（动物学专业论文）腹毛目纤毛虫皮层微管类细胞骨架及微管蛋白的研究.pdf

中文摘要 腹毛目纤毛虫皮层微管类细胞骨架及微管蛋白的研究 专业： 研究方向： 博士生： 导师： 动物学 细胞及分子生物学 曾 红 顾福康教授 中文摘要 关于真核生物细胞骨架的研究是细胞生物学的个重要发展领域。由于原生 动物纤毛虫具有多种复杂的细胞骨架结构，加之其材料培养和处理的优点，一直 被作为研究细胞骨架结构与功能及其细胞调控的理想材料。2 0 世纪8 0 年代初， 许多学者应用蛋白银染色方法和超微结构方法，显示了纤毛虫细胞皮层中以纤毛 基体作为主成分的骨架结构，探讨了纤毛虫皮层纤毛器的形态、形态发生及其结 构形成机理，在国内外原生动物细胞学领域成为主流。2 0 世纪9 0 年代起，先后 应用非离子去垢剂处理和扫描电镜相结合的方法、稳定保存微管结构的透射电镜 术，微管蛋白的抗体标记及其免疫荧光技术及相关的生化与分子生物学等方法显 示纤毛虫的微管胞器及其微管蛋白组分，探索微管胞器的形态、功能及其微管装 配机理，积累了较多的资料，取得了重要的进展。但是，目前仅对草履虫、四膜 虫中分散排布的体纤毛基体的装配有较深入的了解，而对不同种纤毛虫的毛基体 特别是紧密聚集排列的纤毛器基体微管的装配和基体微管装配在细胞内的启动 和发生过程尚未进行深入的研究。鉴于这种情况，本文采用细胞微管结构分化更 为复杂，细胞皮层纤毛器形成紧密聚集排列的腹毛目纤毛虫为对象，应用其皮层 纤毛器分化具有典型特征的三种纤毛虫，即游仆虫( e u p l o t e ss p ) 、贻贝赫尾虫 ( s t y t o n y c h i am y t i l u s ) 和伪尾柱虫( p s e u d o u r o s t y l as p ) 为材料，应用特异性显 示微管及微管蛋白的f l u t a x 直接荧光标记法和抗a 、抗y 微管蛋白免疫荧光 标记法，以及扫描电镜术( s e m ) ，研究了其皮层微管类细胞骨架的组成和发生； 此外，对扩增出的游仆虫、伪尾柱虫编码y 微管蛋白的基因片段进行了序列测定 和分析，并采用r n a i 喂食法使游仆虫y 微管蛋白基因沉默，初步探讨了y 微管 蛋白编码基因的功能。结果如下： l 纤毛虫皮层纤毛器微管骨架 腹毛目纤毛虫皮层纤毛器微管骨架由口围带、波动膜、额腹横棘毛、背纤毛 等纤毛器微管和纤毛器基部附属微管组成。三种纤毛虫皮层纤毛器微管骨架的分 中文摘要 布模式各不相同，且相应的纤毛器微管骨架及其纤毛器基部附属微管也依据特定 模式在皮层中定位，其中： ( 1 ) 游仆虫：具有“巨大型口围带一额腹棘毛一横棘毛一尾棘毛”模式。 细胞腹面口围带为巨大形，额腹棘毛汇聚在口围带右侧，横棘毛位于口围带基部 右侧，尾棘毛定位于细胞后端。与额腹棘毛基部相联系的前纵微管束、后纵微管 束和放射微管束在皮层中伸展，前纵微管束和后纵微管束分别由棘毛基部的左前 角、右后角向皮层前后伸展，几根放射微管柬向细胞质的不同方向伸展：每根横 棘毛基部各发出的一束前纵微管束，向前方伸展并汇集在细胞的前端。 ( 2 ) 棘尾虫：具有“口围带一额棘毛一腹棘毛一横棘毛一左、右缘棘毛” 模式。细胞腹面口围带中等大小，额棘毛位于口围带右侧，腹棘毛位于腹面中区， 横棘毛位于腹面后区，左、右缘棘毛定位于细胞左、右侧。额、腹棘毛基部分别 向周围皮层发出前纵微管束、后纵微管束和周围微管束；每根横棘毛基部的前纵 微管束在其前方汇集：左、右缘棘毛的基部发出横微管束、前纵微管束和后纵微 管束，其中左缘棘毛基部横微管束自棘毛基部向右伸展在皮层内；右缘棘毛基部 横微管束自棘毛基部向左侧皮层伸展。 ( 3 ) 伪尾柱虫：具有“口围带一额棘毛一腹棘毛一横棘毛一左、右缘棘毛” 模式。细胞腹面口围带为小的倒“u ”形，额棘毛形成列，2 列腹棘毛位于细胞 中腹区，多列左、右缘棘毛位于细胞左右两侧。额棘毛的基部发出的前纵微管束 和后纵微管束和周围微管伸展在皮层内；中腹棘毛基部发出前纵微管柬、后纵微 管柬和横微管束；横棘毛基部向左前方发出的前纵微管束在前方汇聚；左、右缘 棘毛列的基部附属微管的按序排列，每个缘棘毛基部分别向左前方、右后方发出 前纵微管束和后纵微管束，前纵微管束和后纵微管束的倾斜角度是固定的，以致 同一列的前纵微管束和后纵微管束分别平行排列；在细胞尾部左右侧的缘棘毛列 汇合，形成一个个同心圆。 2 非纤毛器皮层微管骨架 ( 1 ) 游仆虫：口皮层内存在网格状的非纤毛器皮层微管骨架。细胞背面银 线系网格的边形具有稳定的特征。s e m 结果显示游仆虫背面银线系属于双型中 的d o u b l e - - e u r y s t o m u s 构型，其中：在相邻两列背纤毛之间有2 排大小相似的多 边形，每个多边形是由单条细线围成较规则的六边形。 ( 2 ) 贻贝棘尾虫：主要的非纤毛器皮层微管包括口腔肋壁微管、左右侧皮 层微管。其中，口腔肋壁微管纵向紧密排列于口围带内缘的口皮层内，其微管外 端与口围带骨架在领部特化形成的“u ”形微管接续，向内伸展至皮层深部；在 细胞左、右侧。左、右侧微管带分别纵向分布于左缘棘毛基部微管外侧和右缘棘 毛基部微管内侧，呈细带状。在口围带骨架与左缘棘毛基部交界处左侧微管带的 中文摘要 微管紧密聚集形成三角形状。 ( 3 ) 伪尾柱虫：在细胞背腹交界区纵贯前后端皮层分布着细微的左、右侧 微管带，分别位于细胞的左、右缘。 3 微管蛋白基因的序列分析及其功能 将扩增的游仆虫和拟尾柱虫的y 微管蛋白基因片段测序，并与其他几种游仆 虫y 微管蛋白基因同源区段的序列比对，获得：本实验的游仆虫与小腔游仆虫 ( e a e d i c u l a t u s ) 的v 微管蛋白基因片段d n a 序列有9 7 5 相似性，两者有较近 的亲缘关系；相应的氨基酸序列与小腔游仆虫、八肋游仆虫( e o c t o c a r i n a t u s ) 及厚形游仆虫( e c r a s s u s ) 的氨基酸序列比对后显示其y 微管蛋白变异较小，推 断该氨基酸序列在进化中比较保守；本实验的游仆虫与拟尾柱虫的y 微管蛋白 基因片段的序列比对，两者的碱基序列的相似性仅为7 2 5 ，表明两者在亲缘关 系较远。 此外，通过r n a i 将游仆虫y 微管蛋白基因沉默，约2 周后实验组游仆虫变 小，最终死亡。 结论：腹毛目纤毛虫皮层微管类细胞骨架由皮层纤毛器微管和非纤毛器微管骨 架构成，皮层微管系统发达，具如下共同特征：纤毛器微管的分布具有背腹分 化的特征：腹面体纤毛微管聚合成棘毛。口围带骨架及其附属微管的组成极其 相似，都是由片层状的小膜骨架和小膜间连接微管等组成。额腹横棘毛基部附 属微管都由前纵微管束、后纵微管束和周围微管束组成，但其分布表现出极性和 不对称性。横棘毛的前纵微管束都表现出向前伸展聚合的特性。在皮层内， 相邻的纤毛器骨架及附属微管常彼此交错，甚至特化出特定的衔接结构。 游仆虫、贻贝棘尾虫和伪尾柱虫也表现出微管类细胞骨架组成上的差异和特 征，首先是各自的皮层模式不同，即口围带的形状、小膜数以及额腹横棘毛的数 目和定位各不相同，表现出特定的皮层模式。其次，横棘毛的前纵微管束虽都向 前集聚，但游仆虫的前纵微管束集合在细胞的最前端，而贻贝棘尾虫、伪尾柱虫 的都集聚在基体前方的不远处。第三，在贻贝棘尾虫左、右缘棘毛基部附属的横 微管束特别很发达，且棘尾虫和伪尾柱虫皮层内存在的左、右侧微管带在游仆虫 中未观察到，其存在是否具有普遍性尚需进一步研究。最后，伪尾柱虫有中腹棘 毛列及多列左右缘棘毛列，其基部附属微管在皮层中排列成特定的形状。 由于腹毛目纤毛虫的纤毛有聚合形成棘毛的特性，本文观察到棘毛的基部也 聚合在一起，因此作者推测在腹毛目纤毛虫中存在着不同水平的m t o c ，基体 在单根纤毛水平作为其微管组装的微管组织中心( m t o c ) ，棘毛的基部可能在 棘毛水平作为一群聚合的棘毛组装的m t o c 。此外，可能在整个细胞皮层内存 中文摘要 在大范围的m t o c 。 本研究采用特异性显示纤毛虫微管及微管蛋白的方法，对3 种具代表性的腹 毛目纤毛虫细胞内微管类胞器及其附属微管的组成和分布特征及发生规律进行 了较系统的观察和比较分析，较详细地揭示了腹毛目纤毛虫微管类细胞骨架的组 成和模式。由于腹毛目纤毛虫是纤毛虫中最高等的类群，本文所得结果不仅有助 于深入了解纤毛虫细胞微管骨架的组成特征，也为探讨真核细胞的细胞模式和模 式形成以及微管类结构在真核生物中的进化和分化的规律提供深入研究的基础 资料。对游仆虫和伪尾柱虫y 微管蛋白基因片段的序列测序及分析显示，y 微管 蛋白氨基酸序列在几种腹毛目纤毛虫中比较保守。此外，本文进一步证实，喂食 法可有效地产生r n a i ，y 微管蛋白基因的表达和细胞调控是细胞微管骨架的装 配及其细胞生命活动所必需的。v 微管蛋白在纤毛虫形态构建等其他方面的功能 值得继续进行研究。 关键词：腹毛目纤毛虫，游仆虫，贻贝棘尾虫，伪尾柱虫，皮层，微管类细胞骨 架，微管蛋白，f l u t a x ，免疫荧光，y 微管蛋白基因，序列分析，r n a i a b s t r a c t s t u d i e s0 1 1t h em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n a n dt u b u l i n si nh y p o t r i c h o u sc i l i a t e s m a j o r ： z o o l o g y s p e c i a l i t y ： c e l la n dm o l e c u l a rb i o l o g y p h d c a n d i d a t e ： z e n gh o n g s u p e r v i s o r ：p r o g uf u k a n g a b s t r a c t s t u d i e so nt h ee u k a r y o t i cc y t o s k e l e t o nw e r ei m p o r t a n tr e s e a r c ho fc e l lb i o l o g y ， t h ec i l i a t e sw e r ea l w a y si d e a lm a t e r i a l si nt h es t u d i e so ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f c y t o s k e l e t o na n di t sc e l l c o n t r o la n da d j u s t m e n t ，f o rt h e yh a v em a n yk i n d so f c y t o s k e l e t o n sw i t l lc o m p l e x i t ya n dt h e yc o u l db ee a s i l yc u l t u r e da n dh a n d l e d i nt h e e a r l y 19 8 0 s ，m a n yr e s e a r c h e r sr e v e a l e dt h es t r u c t u r eo fc y t o s k e l e t o nm a i n l yo n k i n e t o s o m ei nt h ec o r t e xb yt h ee m p l o y m e n to fp r o t a r g o ls t a i n i n ga n du l t r a s t r u c t u r e m e t h o d ，a n dt h u st h ec o n f i g u r a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n dm e c h a n i s mo fc o r t i c a lc i l i a t u r e s w e r ed i s c u s s e d ，w h i c hw a st h em a j o rt i d ei nt h es t u d i e so fc e l lb i o l o g yo fp r o t o z o a s i n c et h e19 9 0 s m e a n so fn o n - i o n i cd e t e r g e n t e x t r a c t i o nc o m b i n e dw i t hs c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y , t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y i nw h i c hm i c r o t u b u l a r s t r u c t u r e sc a nb e s t a b l yc o n s e r v e d ，a n t i b o d i e s t ot u b u l i n sa n dc o r r e s p o n d i n g i m m u n o f l u o r e s c e n tt e c h n i q u e s t o g e t h e rw i t hs o m em o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s w e r eu s e dt od i s p l a yt h em o r p h o l o g yo ft h em i c r o t u b u l a ro r g a n e l l e sa n dt u b u l i n s ，i n o r d e rt oe x p l o r ei t sf u n c t i o n sa n da s s e m b l ym e c h a n i s m sa n dal o to fd a t aw e r e a c c u m u l a t e da n di m p o r t a n tp r o g r e s sw a sm a d e h o w e v e r , t h e ya r eo n l yl i m i t e dt ot h e k i n e t o s o m ea s s e m b l yo fs o m a t i cc i l i a t u r ew h i c ha r es c a t t e r e di np a r a m e c i u ma n d t e t r a h y m e n a ，w h i l en op r o f o u n dr e s e a r c h e sh a v eb e e nm a d eo nd i f f e r e n tk i n do f c i l i a t e s ，e s p e c i a l l yo nt h o s ek i n e t o s o m et i g h t l ya s s e m b l e d ，n o ro nt h em i c r o t u b u l e a s s e m b l ya n dt h en u c l e a t i o na n db i o g e n e s i so ft h em i c r o t u b u l ei nt h ec e l l t h u s ，t h i s p a p e ra i m e d a tt h e h y p o t r i c h o u s e i l i a t e sw h i c hh a v et h em o r ec o m p l i c a t e d m i c r o t u b u l a rs t r u c t u r e sa n dt h ec o r t i c a lc i l i a t u r e sa s s e m b l et i g h t l ya n dt h r e et y p i c a l c i l i a t e sw i t hc o m p l e xd i f f e r e n t i a t e dm i c r o t u b u l a rs t r u c t u r e sw e r ec h o o s e da sm a t e r i a l s ， t h a ti s ，e u p l o t e ss p ，s t y l o n y c h i am y t i l u sa n dp s e u d o u r o s t y l as p t h ef o r m a t i o na n d a b s t r a c t b i o g e n e s i so ft h ec o r t i c a lm i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o nw e r ea n a l y z e dw i t hs e m ，a n t i 一 & a n t i ￥t u b u l i na n t i b o d i e s ，f l u t a xw h i c hc a nl a b e lm i c r o t u b u l ea n dt u b u l i n s s p e c i f i c a l l y , a n d t h ef o r m a t i o na n d b i o g e n e s i s o ft h ec o r t i c a lm i c m t u b u l a r c y t o s k e l e t o nw e r es t u d i e d m e a n w h i l e ，t h e y t u b u l i ng e n ef r a g m e n to fe u p l o t e ss p a n dp s e u d o u r o s t y l as p w e r ea m p l i f i e da n dt h e ns e q u e n c e da n da i i g n e d t h e nt h e e x p r e s s i o no fy - t u b u l i ng o n ew a si n h i b i t e db yr n a if e e d i n ga n di t sf u n c t i o n s 、t q a s d i s c u s s e dp r i m a r i l y t h er e s u l t sw e r ea st h ef o l l o w i n g ， 1t h ec o r t i e a lc i l i a t u r em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n n l ec o r t i c a lc i l i a t u r em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o ni nh y p o t r i c h o u sc i l i a t e s c o n s i s t e do fc i l i a t u r e sa n di t sb a s e a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e s t h ec i l i a t u r e sw e r ea d o r a l z o u eo f m e m b r a n e l l e s ( a z m ) ，u n d u l a t i n g m e m b r a n e s ( u m ) ， f r o n t a l v e n t r a l - t r a n s v e r s ec i r r i ( f v t c ) ，c a u d a lc i r r i ( c c ) ，d o r s a lk i n e t i c s ( d k ) ，e t c t h ed i s t r i b u t i o nm o d e lo fc i l i a t u r e si nt h et h r e ec i l i a t e sd i f f e r e df r o me a c ho t h e ra n d t h ec o r r e s p o n d i n gb a s e - a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e sl o c a t e di nt h ec o d e xa c c o r d i n gt oi t s m o d e l t h a tw a s ， ( i ) e u p l o t e sh a d “h u g ea z m 卜f v c t c c c ”m o d e l i ni t sv e n t r a ls i d e a z mw a sh u g ea n df v c g a t h e r e dt ot h er i g h to f a z m ，t cl o c a t e dt ot h er i g h to f t h e b a s eo fa z m c cl i e di nt h eb a c ko ft h ec e l l t h ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ( a m ) ，p o s t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ( p m ) a n dr a d i a t em i c r o t u b u l e s ( i u d c o n n e c t i n gt h eb a s eo ft h ef v c e x t e n d e di n t ot h ec o r t e x ，t h ea ma n dp me x t e n d e d f r o mt h el e f th e a dc o m e ro rt h ef i g h tb a c kc o m e ro ft h ef v cb a s ea n ds p r e a d t o r w a r d so rb a c k w a r d ss e p a r a t e l y , w h i l es e v e r a lr me x t e n d e df r o mt h eb a s ei n v a r i o u so r i e n t a t i o n s e a c hb u n d l eo fa mf r o mt h eb a s eo ft cs p r e a df o r w a r d sa n d g a t h e r e dt o g e t h e ra tt h ef r o n to f t h ec e l l ( 2 ) s t y l o n y c h i am y t i l u sh a d “a z k 【_ f c v c t c l & r m c ”m o d e li ni t s v e n t r a ls i d e ，a z mw a sm e d i u m - s i z e d ，f cl i e dt ot h er i g h to f a z m ，v cl o c a t e di nt h e m i d d l eo fv e n t r a l ，a n dl e f t - a n dr i g h t - m a r g i n a lc i r r i ( l & r m c ) w e r ei nt h el e f ta n d f i g h ts i d es e p a r a t e l y t h ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s p o s t e r i o rl o n g i t u d i n a l m i c r o t u b u l e sa n dr a d i a t em i c r o t u b u l e se x t e n d e df o r mt h eb a s eo ff ca n dv ci n t ot h e c o r t e x t h ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e sf r o mt h eb a s eo fe a c ht cg a t h e r e d t o g e t h e ri nf r o n to fi t t h ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lr n i c r o t u b u l e s p o s t e r i o rl o n g i t u d i n a l m i c r o t u b u l e sa n dt r a n s v e r s em i c r o t u b u l e s ( t m ) e x t e n d e df r o mt h eb a s eo fl & r m c 。 t h et mf r o mt h eb a s eo fl m ce x t e n d e dt o 也ef i g h ti n t ot h ec o r t e xw h i l et h o s ef r o m a b s t r a c t t h e 蹦c t o t h e l e f t ( 3 ) p s e u d o u r o s t y t ah a d “a z m f c v c - t c i _ - i 。& r m c ”m o d e l ，i ni t s v e n t r a ls i d e a z mw a ss m a l la n di nar e v e r s e u s h a p e ，f cw e r ei ns e r i e s ，2s e f i e so f v ci nt h em i d d l e v e n t r a la n ds e v e r a ls e r i e so fl & r m c1 0 c a t e di nt h el e f ta n df i g h t s i d eo ft h ec e l l 1 1 1 ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ，p o s t e r i o rl o n g i t u d i n a l m i c r o t u b u l e sa n dr a d i a t em i c r o t u b u l e se x t e n d e df o r n at h eb a s eo ft h ef v ci n t ot h e c o r t e x t h ea m p ma n d ( t m ) e x t e n d e df r o mt h eb a s eo fm i d - v c t h ea n t e r i o r l o n g i t u d i n a l m i c r o t u b u l e so ft cg a t h e r e dt o g e t h e ri nf r o n to fi t sb a s e n e b a s e a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l a rf r o ml & r m ca r r a y e dr e g u l a r l y , t h ea n t e d o r l o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e sa n dp o s t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e sp a r a l l e l e de a c h o t h e ra st h e ys l a n t e do u ta tt h es a m ea n g l e s m e a n w h i l e t h ec o r r e s p o n d i n gl m ca n d r m cs t r e a k sj o i n e dt o g e t h e ra tt h eb a c ke n do ft h ee e l la n ds os e v e r a lc o n c e n t r i c c i r c u l a r i t i e sw e r ef o r m e dt h e r e 2t h ec o r t i c a lu o n c i l i a t u r em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n ( 1 ) e u p l o t e s s o m em e s h w o r k - l i k en o n - c i l i a t u r em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n w a sf o u n di nt h eo r a lc o r t e x t h es i l v e r l i n es y s t e mo nd o r s a ls i d eo fe u p l o t e sw a sa s t a b l e m o r p h o l o g i c a lt r a i t s e mr e s u l t s s h o w e dt h a tt h es i l v e r l i n e s y s t e mo f e u p l o t e ss p b e l o n g e dt od o u b l e - - e u r y s t o m u st y p e ，f o rt h e r ew e r ed o u b l er o w so f s i m i l a rp o l y g o n sl y i n gb e t w e e na n yt w oa d j a c e n tk i n e t i c s a n de a c ho ft h ep o l y g o n s w a sr e g u l a rh e x a g o n 、析t l ls i n g l ef i l a m e n t ( 2 ) s t y l o n y c h i am y t i l u s t h en o n c i l i a t u r em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o nm a i n l y i n c l u d e da n dl e f t - ，r i g h t - m i c r o t u b u l a rr i b b o n s ( l & r m r ) o ft h ec o r t e x t h eo r a l r i b w a l lm i c r o t u b u l e sa r r a y e dl o n g i t u d i n a l l yi nt h eo r a lc o d e x ，t h e yj o i n e dt h e m e m b r a n e l l eb r a c k e t so fa z ma tt h et o pb ys p e c i a ll y i n g “u ”s h a p em i c r o t u b u l e s l & r m re x t e n d e dl o n g i t u d i n a l l ya tt h el e f to rr i g h ts i d eo ft h ec e l l ，l i k es l e n d e r r i b b o n s l m rl o c a t e dt ot h eo u t s i d eo ft h eb a s e a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e so fl m c w h i l et h er m ci nt h ei n n e rs i d eo ft h o s eo fr m c a tt h eb o u n d a r yw h e r et h e b r a c k e t so fa z mm e tt h eb a s eo ft h el m c ，l m ra c c u m u l a t e dt i g h t l ya n df o r m e da t r i a n g u l a rs h a p e ( 3 ) p s e u d o u r o s t y l a t h en o n - c i l i a t u r em i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o ni nt h ec o r t e x o b s e r v e dw e r el e f t 一，r i g h t - m i e r o t u b u l a rr i b b o n s ，w h i c hw e r en a r r o wr i b b o n sa r r a y e d l o n g i t u d i n a l l yi nt h el e f to rf i g h tm a r g i no f t h ec e l lr e s p e c t i v e l y a b s t r a c t 3s e q u e n c ea l i g n m e n to ft u b u l i ng e n ef r a g m e n ta n di t sf u n c t i o n si n h y p o t r i c h o u sc i l i a t e s t h ea m p l i f i e dy t u b u l i ng e n ef r a g m e mw a ss e q u e n c e df r o me u p l o t e ss p a n d p s e u d o u r o s t y l as p ，a n dt h e nt h eh o m o l o g o u ss e q u e n c ew e r ea l i g n e dw i t hs e v e r a lo t h e r e u p l o t e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h el i k e l i h o o ko fy t u b u l i ng e n ef r a g m e n t b e t w e e ne u p l o t e ss p a n de a e d i c u l a t u sw a s9 7 5 w h i c hs h o w e dt h a tt h e yh a da c l o s e rr e l a t i o n s h i p s e q u e n c ea l i g n m e n to ft h ec o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i da m o n g e u p l o t e ss p ，f 。a e d i c u l a t u s , e o c t o c a r i n a t u sa n de c r a s s u sr e v e a l e dt h a tv a r i a n c e so f y - t u b u l i nw e r ev e r yl i t t l e ，t h i si n d i c a t e dt h ea m i n oa c i ds e q u e n c ew a sc o n s e r v a t i v ei n t h ee v o l u t i o n t h el i k e l i h o o ko fy - t u b u l i ng e n ef r a g m e n tb e t w e e ne u p l o t e ss p p s e u d o u r o s t y l as p w a s7 2 5 ，i n d i c a t i n gt h er e l a t i o n s h i pw a s f a r o nt h eo t h e rh a n d ，t h ee x p r e s s i o no fv t u b u l i ng e n ei ne u p l o t e ss p w a s i n h i b i t e db yr n a if e e d i n g ，t h ec e l l sg o ts m a l l e ra n da b o u t2w e e k sl a t e rt h e yd i e d e v e n t u a l l y c o n e l u s i o n s ：t h ec o r t i c a lm i c r o t u b u l a r c o n s i s t e do fc i l i a t u r ea n dn o n c i l i a t u r e c y t o s k e l e t o ni nh y p o t r i c h o u s c i l i a t e s m i c r o t u b u l a rc y t o s k e l e t o n ，a n dt h e m i c r o t u b u l a rs y s t e mi nt h ec o r t e xw a sd e v e l o p e d ，s h a r i n gt h es a l n ec h a r a c t e r i s t i c s a sf o l l o w i n g ，t h ed i s t r i b u t i o no fc i l i a t u r em i c r o t u b u l er e v e a l e dt h ec h a r a c t e ro f d o r s o v e n t r a ld i f f e r e n t i a t i o na n dc i l i ag a t h e r e dt o g e t h e rt of o r mc i r r ii nv e n t r a ls i d e t h em e m b r a n e l l eb r a c k e t sa n d b a s e a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e so fa z mw a sv e r y s i m i l a r , i n c l u d i n gl a y e r so fm e m b r a n e l l eb r a c k e t sa n dm i c r o m b u l e sl i n kb e t w e e n m e m b r a n e l l eb r a c k e t s f v t c b a s e a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e sw e r ea n t e r i o r l o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ，p o s t e r i o r l o n g i t u d i n a l m i c r o t u b u l e sa n dr a d i a t e m i c r o t u b u l e s ，w h i c he x t e n d e di n t ot h ec o r t e xs h o w i n gp o l a r i t ya n dd i s s y m m e t r y t h ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e sf r o mt ca l le x t e n d e df o r w a r d sa n dt h e n g a t h e r e dt o g e t h e r i nt h ec o r t e x ，a d j a c e n tc i l i a t a r eb r a c k e t sa n db a s e - a s s o c i a t e d m i c r o t u b u l e so f t e nc r o s sl i n k e dt oe a c ho t h e ra n dc e r t a i nl i n k - u ps t r u c t u r e sw e r ee v e n s p e c i a l i z e d t h e r ew e r es o m ed i f f e r e n c e sa n dc h a r a c t e r i s t i c si nt h e i rm i c r o t u b