（果树学专业论文）酪氨酸蛋白磷酸酶在植物开花中的作用机理.pdf

摘要 开花在植物的生| 炙周期过程中具有重要的作用和意义，植物的开花过程受到很多途径的调 控。本研究筛选出了两个拟南芥早花突变体，命名为p t p l 3 5 、p t p l 3 6 。p t p l 3 5 彝ip t p l 3 6 编码 酪氨酸蛋白磷酸酶。本文通过多种分子生物学技术和手段，对p t p l 3 5 和p t p l 3 6 调控开花的机 理进行了研究。 实验构建了p t p l 3 5 p r o m o t e r ：g u s 和p t p l 3 6 p r o m o t e r ：g u s 载体，采用沾花法转化野生型拟 南芥，潮霉素抗性筛选出阳性株进行g u s 染色；构建3 5 s ：p t p l 3 5 ：g f p 和3 5 s ：p t p l 3 6 ：g f p 载体， 用基因枪法转化洋葱表皮细胞。结果显示p t p l 3 5 基因定位在维管束，叶肉细胞，花柱，花丝和 花蒂，p t p l 3 5 编码蛋白定位在细胞质；p t p l 3 6 基因定位在维管束，花柱和花丝，p t p l 3 6 编码 蛋白定位在细胞核和细胞膜。 实验构建了p t p l 3 6 超表达载体，转入野生型拟南芥和p 妒1 3 6 ：将构建的p t p l 3 5 和p t p l 3 6 超表达载体转入p h y b ，对t 2 代转基因植株进行基因表达分析和开花时间的表型观察。结果显示， 转基因植株中基因的表达量明显高于未经转基因的对照，证明拟南芥转基因成功。对转基因植株 进行表型观察，发现p t p l 3 6 在野生型中过量表达使植株表现为晚花，在p t p l 3 6 中的表达互补 了突变体中的基因缺陷，植株比对照晚花，和野生型开花时间相一致；经过转化p t p l 3 5 和p t p l 3 6 的口h y b 开花时间和对照没有显著差异。实验结果说明p t p l 3 6 是开花相关基因而且是一个晚 花基因。p t p l 3 5 和p t p l 3 6 与p h y b 之间可能没有直接作用关系。 在开花调控途径中c o 是个特异基因，其下游的靶基冈是f t 。实验对不同光照时间下的野 生型、p 护1 3 5 、p t p l 3 6 和p h y b 进行c o 和f t 基因的表达分析，结果发现c o 和f t 在p t p l 3 5 、 口t p l 3 6 中的表达时间延长，表达量增加。说明p t p l 3 5 和p t p l 3 6 可以在转录水平上调控c o 和 h 、，p 1 p 1 3 5 雨ip f p l 3 6 参与了植物开花凋控途径，而且作j j 位点在c o 上游。为进一步研究 p t p l 3 5 和p t p l 3 6 对c o 在调控机理，实验还成功建立了野生型，p t p l 3 5 和p t p l 3 6 转c o 基 因的超表达体系，为深入研究p t p l 3 5 和p t p l 3 6 与c o 的蛋白互作建立了平台。 关键词：开花，酪氨酸蛋白磷酸酶 i i a b s t r a c t p l a n tf l o w e rp l a y sc r i t i c a lr o l e si nt h eg r o w t hp r o c e s s ，a n dt h ef l o w e r i n gp r o c e s si sr e g u l a t e db ym a n y p a t h w a y s r e c e n t l yw ei d e n t i f i e dt w om u t a n t so fa r a b i d o p s i s ，p t p l 3 5a n dp t p l 3 6t h a tf l o w e re a r l i e r t h a nw i l dt y i ) ea n do t h e rm u t a n t s p t p l 3 5a n dp t p l 3 6a r ep t p a s e w er e s e a r c h e dt h em e c h a n i s mo f p l a n tf l o w e rr e g u l a t e db yp t p s w ec o n s t r u c t e dt h ee x p r e s sv e c t o r sp t p l 3 5 p r o m o t e r ：g u sa n dp t p l 3 6 p r o m o t e r ：g u s ，a n d t r a n s f e r r e dt h e s ev e c t o r si n t oa r a b i d o p s i sb ya g r o b a c t e r i u m g n ss t a i n i n gw a sm a n i p u l a t e dt ot e s tw i t c h s c r e e n e db yh y g r o m y c i n ，w es t i l lc o n s t r u c t3 5 s ：p t p l 3 5 ：g f pa n d3 5 s ：p t p l 3 6 ：g f pv e c t o r s ，a n d t r a n s f e r r e dt h e s ev e c t o r st oo n i o ne p i d e r m a lc e l l sb yb i o l i s t i c s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp t p l 3 5 - g u s a c t i v i t yw a sh i g hi nv a s c u l a r , m e s o p h y l lc e l l s ，t h ec o n n e c t i o no fs t y l ea n ds t i g m a ，l a x q u e r em a dp e d i c l e p t p l 3 6 一g u sa c t i v i t yw a sh i g hi nv a s c u l a r ，l a x q u e r ea n dp e d i c l e p t p l 3 5e x p r e s si nc y t o p l a s m i ca n d p t p l 3 6e x p r e s si nn u c l e a ra n dc e l lm e m b r a n e w ec o n s t r u c t e dt h ev e c t o ro f p t p l 3 6a n dl e tp t p l 3 6o v e r e x p r e s s e di nw i l d - t y p ea m b i d o p s i sa n d p t p l 3 6 , a n ds od i dp t p l 3 5a n dp t p l 3 6i n p h y b w ea n a l y s i st h ee x p r e s so f t r a n s f e r r e dg e n ea n dt h e f l o w e r i n gt i m eo ft r a n s g e n i cp l a n t s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s so fp t p l 3 6i nt r a n s g e n i c p l a n t sw a ss i g n i f i c a n t l yh i 曲e rt h a nc k a n dt h et r a n s g e n i cp l a n t sf l o w e r e dl a t e rt h a nc k t h i sm e a n s t h a tp t p l 3 6t a k e sp a r ti nt h ep a t h w a yo fp l a n tf l o w e ri n d u c t i o n f l o w e r i n gt i m eo f p h y bt r a n s f e r r e d p t p l 3 5a n d 盯p 1 3 6w a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t hc k i t sd e m o n s t r a t e dt h a tp t p l 3 5a n dp t p l 3 6 w i t l lp h y bm a yn o th a v ead i r e c tr o l ei nr e l a t i o n s c oi sas p e c i f i cg e n ei nt h ep a t h w a yo f p l a n tf l o w e ri n d u c d o n ，a n di t sd o w n s t r e a mg e n ei sf t w e a n a l y s i st h ee x p r e s so fc oa n df ti nw i l dt y p e ，p t p l 3 5 ，p t p 3 6a n dp h y b f h er e s u l t ss h o w e dt h a ti n p i p l 3 5a n d p l t 7 1 3 6 , t h ec oa n df te x p r e s s e dm o r ea n dm o r el o n g e rt h a nw i l dt y p ea n dp h y b r e s u l t s s h o w e dt h a tp t p l 3 5a n dp t p l 3 6r e g u l a t ec oa n df ta tt h el e v e lo f t r a n s c r i p t i o n a n di n v o l v e di nt h e p a t h w a y c o n s t r u c t e dv e c t o ro f c oa n dt r a n s f e r r e di n t ow i l dt y p e ，p t p l 3 5a n d p t p l 3 6f o rf u r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：f l o w e r , p t p i i l 缩略词 a b a ：a b s c i s i c ：a c i d c t a b ：h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d e p c ：d i e t h lp y r o c a r b o n a t e d s p t p ：d u a ls p e c i f i cp r o t e i np h o s p h a t a s e e d t a ：e t h y l c n e d i a a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d i p t g ：k o p r o p h y t h i 棚- d - g l u c u r o n i d a s e k r i i ：k a n a m y c i n s u l f a t e l b ：l a r i a b c a t a n im e d i a m a p k ：m i t o g e n - a c t i v a t c dp r o t e i nk i n a m s ：m u r a s h i g e s a rm i x t u r e p a o ：p h e n y l a r s i n eo x i d e p t k ：p r o t e i nt 声o s m ek i n a s e m ：p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e t r i s ：m a m i n o - 2 ( h y d r o x y m e t h y l ) - i 3 - p r o p a n e d i o l x - g a h5 - b r o m o - l - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - i b - d - g a l a c t o s i d e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：动静 时问：a 曲7 年瑚阽日 ， 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩日j 或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 卦静 饧遂 时间：0 舸年厂月，3 日 ， 时间：a 坷年厂月，3 日 中国农业大学硕士学位论文前言 第一章前言 1 植物酪氨酸蛋白磷酸酶研究进展 蛋白可逆磷酸化是细胞中普遍存在的一种共价修饰的生理调节反应，作为一种开关机制( o n a n do f f s w i t c h ) 调节细胞活性诺贝尔奖获得者f i s c h e r a n d k r e b s 在1 9 5 5 年初次发表了蛋白质可 逆磷酸化可以调节酶活性的报道。蛋白可逆磷酸化这一可逆化过程由两种类型的酶催化完成：蛋 白激酶和蛋白磷酸酶，蛋白激酶催化底物上的氨基酸残基磷酸化，而蛋白磷酸酶则催化磷酸化的 蛋白脱磷酸化。蛋白可逆磷酸化就是通过各种蛋白激酶和蛋白磷酸酶对效应蛋白活性基团进行磷 酸化或脱磷酸化，引起其结构变化从而实现活性的变化。例如，磷酸化可以使酶的构像发生变化， 致使底物与酶活中心接触的通路受阻从而调节酶的活性( j o h n s o n & o r e i l l y ，1 9 9 6 ) ；磷酸化还 可以调节蛋白复合体中蛋白成员的相互作用而控制蛋白复合体的功能( p a w s o n ，1 9 9 5 ) ；还有一 些蛋白必须经磷酸化后才能被定位于其细胞内的功能靶位。细胞内存在着很多功能蛋白，如激酶、 受体、调节蛋白、离子通道、离子泵等，都受可逆磷酸化的调节相应的细胞内也存在着大量与 之对应的蛋白激酶和蛋白磷酸酶。由蛋白磷酸酶和蛋白激酶共同调节的蛋白可逆磷酸化几乎涉及 细胞功能的各个方面，包括新陈代谢，细胞周期调控，发育控制，离子运输以及逆境应答等多种 生命活动由于蛋白可逆磷酸化具有显著而又广泛的生物学意义，因此蛋白可逆磷酸化成为当今 生命科学中研究比较活跃的一个领域。 随着研究的进一步深入，人们根据底物的不同把蛋白激酶和蛋白磷酸酶分为两大类；丝氨酸 ，苏氨酸蛋白激酶( s e r i n e t h r e o n i n e k i n a s e s ) 和丝氨酚苏氨酸蛋白磷酸酶( s e r i n e t h r e o n i n e p h o s - - p h a t a s e s ) ，酪氨酸蛋白激酶( p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e s 。p t k s ) 和酪氨酸蛋白磷酸酶( p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e s ，p t p a s e s ) 在动物和酵母系统中，丝氮酸苏氨酸( s e r f r h r ) 和酪氨酸( t y r ) 磷 酸化已经被确定，但在植物中，目前仅确立丝氨酸，苏氨酸磷酸化的调节机制，此类酶对植物生长 发育具有重要作用( l u a n ，2 0 0 2 ) ，酪氨酸磷酸化作用的研究尚待深入。已有资料表明，植物体 内存在很多酪氨酸磷酸化的蛋白，表明酪氨酸磷酸化也可能存在于植物生长发育中随着拟南芥 全基因组测序的完成，通过序列比对分析已鉴定出2 0 多个基因编码酪氮酸蛋白磷酸酶，但是除了 极少数基因刚开始被研究，其功能部分有鉴定外，大多数基因的功能仍然未知，但是鉴于酪氨酸 蛋白磷酸酶家族在动物中的重要作用，可以推测在植物体中也具有不可或缺的作用。 在植物中，根据磷酸化氨基酸的专一性不同，p t p a s e 8 可分为两大类：酪氨酸特异性磷酸酶 ( t y r o s i n e - s p e c i f i cp t p a s c 8 ，p t p s ) 和双特异性磷酸酶( d u a l s p e c i f i c i t yp t p a s e 8 ，d s p t p s ) 。p t p s 只能使磷酸化的酪氨酸磷酸基脱磷酸化；d s p t p s 既能使磷酸化的酪氨酸磷酸基脱磷酸化，也能 使磷酸化的丝氨酸，苏氨酸磷酸基脱磷酸化( d e n u j e t a l ，1 9 9 6 ) 根据亚细胞定位，p t p a s e 可分为两类：受体型p t p a $ c s 和胞内p t p a s e 8 ( s t o n e d i x o n ， 中国农业大学硕士学位论文前言 1 9 9 4 ；n c c l t o n k s ，1 9 9 7 ) 受体型p t p a s c s 含有1 个长度不等的胞外配体结合区、1 个跨膜结 构区和1 个或2 个胞浆区胞内p t p a s c s 含有一个单独的催化区以及不同的n 和c 末端延伸区， 该区可能有靶向和调控功能( m a u r o & d i x o n ，1 9 9 4 ；v a n v a c t o r e t a ，1 9 9 8 ) 。 图l l 酪氨酸蛋白磷酸酶的结构域( l u a n , 2 0 0 3 l 尽管p t p 和d s p t p 之问同源性很低而且具有底物特异性，但所有p t p a , 催化机制基本相 同，即催化核心都包含一个活性序列m h c x a g x o r ( s t ) g 。这一序列有一个关键的半胱氨 酸残基，只有当这个半胱氨酸处于还原态时磷酸酶才有活性，可以用它作为亲核物质，形成硫代 磷酸共价酶中间产物( d e n ue t a ，1 9 9 6 ：t o n k s n e e l ，1 9 9 6 ) ；作为p t p a s c s 特征结构的恒定 纽分，精氮酸残基具有结合底物和稳定状态转换的作用；p t p a s c 8 上裂缝的深度决定了其底物特 异性，只有磷酸酪氨酸的长度足以到达其底部才能与之作用( t o n k s & n e e l ，1 9 9 6 ) p 1 限不但具有相同的活性中心，而且所有p t p a $ 的二级和三级结构在催化结构域上有 高度的相似性。在动物和酵母中已经成功分析了p t p $ 和d s p t p 的晶体结构，这为研究p t p s 8 的催化和底物专一性提供了基础( d e n u 甜a l ，1 9 9 6 ) 晶体结构是l y i p a s c s 催化作用和底物特 异性的基础( s t u c k e y e t 口f ，1 9 9 4 ；b a r f o r d ，1 9 9 5 ；y u v a n i y a m a e t a l ，1 9 9 6 ：h o f f m a n e t a l ，1 9 9 7 ) 所有的p t e a s c 8 的晶体结构都呈类似的折叠型：中心为四股平行的b 片层，两侧被1 ，她螺旋包 被。 d s p t p 是一类胞内磷酸酶，这类酶具有相似的催化机制，但又有明显不同的催化区这个家 族的原始类型是编码牛痘病毒的开放阅读框h l 的v i i i ( g u a ne t a ，1 9 9 1 ) 。促分裂原活化蛋白 激酶磷酸酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e sp h o s p h a t a s e s ，m k p s ) 属于d s p t p s 磷酸酶，可使 促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i ni d n a s e s ，m a p k s ) 脱磷酸化而使之失活。到目 前为止，至少已鉴定出6 种m k p s ，每一种都有特异的底物，参与不同的m a p k 途径的调节 ( k c y s e ，1 9 9 8 ) 此外，d s p t p s 还包括细胞分裂周期磷酸酶( c e l ld i v i s i o nc y c l ep h o s p h t a s e s ， c d c 2 5 磷酸酶) 和类张力蛋白磷酸酶( p h o s p h a t a s ea n dt c n s i nh o m o l o g ，p t e n ) ，是c d c 2 蛋白 2 中国农业大学硕士学位论文前言 激酶与细胞分化所必需的。 另外p r p a s 船对钒酸钠都十分敏感，能够水解对硝基苯磷酸( p - n i t r o p h e n y lp h o s p h a t e ，p n p p ) ， 对冈田酸( o k a d a i ca c i d ，o a ) 不敏感，金属离子不影响其活性。 1 2 植物体内的p t p a s 龋 f r p 勰在细胞生长和分化及信号转导系统中具有作用，随着对动物和酵母体内p t p a s a $ 的 深入研究，人们致力于在植物体内寻找蛋白酪氨酸磷酸化的证据。e l l i o t 和g e y t e n b e e k ( 1 9 8 5 ) 及t o r m e l l a ( 1 9 8 6 ) 等在烟草和豌豆中发现含有酪氨酸残基磷酸化的蛋白质。c h e n g 和t a o ( 1 9 8 9 ) 及g u o ( 1 9 8 9 ) 等在小麦和豌豆中鉴定到p t p a $ 8 活性。而后有研究者从绿藻中分离出典型d s 盯p ( h a t i n g e t a l ，1 9 9 5 ) 有研究者在将烟草气孔保卫细胞渗透胁迫处理后，发现至少有2 种m a p k 受到激活，随后又迅速失活；用磷酸酶的抑制剂o a 和钒酸钠同时处理细胞时保卫细胞表现出 超活化的m a p k 活性，但是分别用o a 和钒酸钠处理细胞时不能观察到超活化的m a p k 活性。 由于o a 是s e r t h r 磷酸酶而钒酸钠是p 1 p a s 的抑制剂，这些现象充分表明s e r f f h r 磷酸酶和 p t p a 都参与渗透胁迫下保卫细胞m a p k 失活( z h a n ge t a ，1 9 9 6 ) ，植物体内含有对钒酸钠 敏感的m k p s 属于p t p a s e s 家族。1 9 9 8 年，x u 等报道，拟南芥有一种典型的酪氨酸磷酸酶基 因a t p l t l ( a r a b i d o p s i st h a l i a n at y r o s i n es p e c i f i cp r o t e i nt y t o s i n e 曲o s p h a t a s e ) ，一种胞内p t p a s c a t p t p i 重组蛋白特异脱磷酸化由p # 0s r c ( - - 种酩氨酸特异激酶) 标记的磷酸酪氨酸，而对被 p k a ( 一种丝氨酸侪氨酸特异激酶) 标记的底物无作用；其活性可被i m mv a n a d a t e 抑制；在序 列中用丝氨酸置换半胱氨酸残基，虽然只是一个氨基酸的改变，但使得a t p t p i 的活性完全丧失 ( x u e t a ，1 9 9 8 ) 。1 9 9 8 年g u p t a 等从拟南芥中分离到一种双特异性蛋白磷酸酶基因a t d s p r i p l ( a r a b i d o p s i st h a l i a n ad u a l - s p e c i f i c i t yp r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e ) 它可促使底物蛋白磷酸化的 s e r i h r 及酪氨酸残基脱磷酸化和a t m p k 4 ( 植物中m a p k 中的一种) 脱磷酸化而失活( g u p t ae t a 1 ，1 9 9 8 ) 2 0 0 1 年，u l n a 等从拟南芥中分离剑一种对紫外辐射敏感的突变体”助 ( m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ep h o s p h a t a s e ，a t m k p l ) 。a t m k p i 是一类d s p t p s ，能使m a p k s 失活，是m a p k 信号途径中的调节因子。2 0 0 2 年，f o r d h a m s k e l t o n 等在拟南芥基因组中鉴定到 一种蛋白磷酸酶基因，命名为a t p t p k i s i ，它包含一个酪氨酸蛋白磷酸酶催化区和一个激酶相互 作用序列( k i n a i n t e r a c t i n gs e q u e n c e ，k i s ) 结构域。随后越来越多的p t p a s e $ 开始在植物中发 现，2 0 0 2 年g u p t a 从拟南芥中发现a t p t e n l ，a t p t e n 2 ，a t p t e n 3 。 目前为止，已从拟南芥基因组中鉴定到2 0 多个编码p t p a s e s 的基因：d s p t p 和类t 以d s p t p1 7 个，p t p $ 1 个，低分子量的p t p 81 个，以及一些类似p 1 p a s 的基因( d a v i d ，2 0 0 2 ) 。 1 3 酪氨酸蛋白磷酸酶在植物体内的功能 在动物和酵母中已经证明，丝氢酸苏氨酸和酪氨酸磷酸化，都在细胞信号传导中起着至关重 要的作用，特别是酪氨酸蛋白磷酸化是动物细胞内生长因子调节细胞增殖与分化的一般机制。 最近的研究也表明丝氨酸苏氨酸磷酸化在调节植物生长和发育中起作用( s m i t hr d & w a l k e r j c ，1 9 9 6 ) 虽然以前由于在植物中没有发现典型的酪氨酸蛋白激酶而被忽略，但最近 3 中国农业大学硕士学位论文前言 的研究资料证明酪氨酸磷酸酶不仅在植物体内存在，而且还参与植物对逆境反应的信号途径以及 控制生长发育中的许多生理过程。 1 3 1 参与m a p k 信号途径的调节 m a p k 家族成员普遍存在于真核生物中，受细胞分裂和逆境信号的诱导，是激素、细胞分 化以及基因表达等信号传递途径中的关键成分。在动物和酵母中，m a p k 活性是通过t h r 和t y r 残基的磷酸化和脱磷酸化作用来调节的。许多资料证明d s f f p s 使m a p k s 的t h r 和t y r 残基脱 磷酸化而使之失活( k e y s e ，1 9 9 8 ) 。在酵母中的研究表明，p t p s 和d s p t p $ 在m a p i c s 途径中 起调节作用( z h a n g ，1 9 9 6 ) 哺乳动物细胞中的d s p t p s 使m a p g 脱磷酸化而导致m a p k 失活。 外源信号或物质激活m a p k 时，几分钟内达到高峰，随后回到初始的水平，信号遂熄灭，这种 瞬时的开和关对m a p k s 调节的生理过程来说非常重要。因此，蛋白磷酸酶尤其是p t p s 和d s p t p ， 是精确维持m a p l ( s 活化和失活的关键调节因子 过去几年的研究表明，m a p k 途径大量存在于高等植物体内，在激素、环境胁迫和病源菌 刺激等信号转导途径中均涉及到m a p k s 的活化作用。对一些高等植物的研究表明，植物体内 m a p k 的活化作用也与酪氨酸残基磷酸化和脱磷酸化有关当植物接受信号时，激活m a p k 信 号途径，m a p k 迅速发生自体磷酸化或由m a p k k s 使之磷酸化，传递信息，引起各种反应，之 后脱磷酸而失活，从而使信号传递中断研究表明a t l r i l 的表达被逆境( 高盐，冷) 调节( x u e t a l ，1 9 9 8 ) ，而r a t p t p l 使拟南芥中的一种m a p k 脱磷酸化并使之失活( h u a n g e t a l ，2 0 0 0 ) 。 a t m p k 4 是拟南芥中的一种m a p k ，生化分析表明a t m p k 4 上的酪氨酸残基的磷酸化作用对它的 活化是必需的( g u p t a r e t a l ，2 0 0 2 ) 生化分析和遗传学资料证明了植物m a p k 活化和p t p $ 活 性之间的生理关系( g u oe ta l ，1 9 9 8 ：t e n ae ta l ，2 0 0 1 ) 。 在u v 辐射筛选拟南芥突变体时，k e y s e 发现一个类似d s p t p 、被命名为a t m k p i 的基因， 能够抗u v - 辐射。在u v 辐射条件下，这个突变体表现出高的m a p k 活性，说明在u v 辐射反 应中，a t m k p i 是m a p k s 的一个负调节因子( f o r d h a m s k e l t o ne t a l ，2 0 0 2 ) 在a t p t p i 缺失 突变体中。m a p k s 明显比野生型的活性高，但在转基因植物中，a t p t p l 过量表达会延迟m a p k s 的活化( l u a n ，2 0 0 3 ) a t d s p t p l 和推测的d s p t p s 是否在体内控制m a p k 活性尚待进一步证 实。植物与动物和真菌一样，其体内的m a p k 也是p t p a s e 8 的一个主要作用靶位 最新的证据表明，p t p a s e 8 对在a b a 介导的种子后熟发育中的m a p k 有负调控作用( d a v i d 甜a 1 ，2 0 0 6 ) 。在使用p t p i ；的特异性抑制剂氧化苯肿( p a o ) 后，拟南芥种子对a b a 的敏感性 提高，严重抑制了萌发。由于m a p k 参与了a b a 介导的种子后熟发育的信号转导途径，所以， 这个现象说明可能是p t p $ 活性的抑制导致了m a p k 激活状态的维持而增加了种子对a b a 的 敏感性。 d s p t p s 对于m a p i c s 有相当严格的底物专一性( k e y s es m ，1 9 9 8 ) 因此，一个细胞中如 果有多种的m a p k 异构体，必然会发现不同类型的d s p t p s 。与m a p k s 功能的多样性相一致的 是，在拟南芥基因组中也鉴定到2 0 个左右编码m a p i c s 基因，1 0 个m a p k k s ( m a p k k i n a s e s ) 基 因，约6 0 个m a p k k k s ( m a p k k k i n a s e s ) 基因。 这些研究表明p t p a s e s 应答许多胞外信号并调控m a p k 通路。进一步的研究需要鉴定磷酸 4 中国农业大学硕士学位论文前言 酶的活体目标蛋白及其在植物细胞与发育进程中的作用。 1 3 2 参与a b a 信号途径的调节 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 是一种重要的植物激素。不仅在植物的生长发育中具有广泛的 调控功能，而且在植物对环境胁迫的响应中起着十分重要的作用。环境胁迫下a b a 不仅可以作 为长距离传递的信号物质传导信息，而且可以作为细胞逆境信号直接调控众多逆境基因的表达。 环境胁迫下植物体内快速大量的积累a b a ，这个信号进一步向下游传递信息，发生复杂的网络反 应，一旦胁迫解除，a b a 信号又会迅速的消失 水分亏缺时a b a 的积累调节植物体内的许多生理过程，可以提高植物的抗逆性，比如气孔 关闭。气孔关闭是形成气孔的保卫细胞中的溶质，尤其是k + 穿过液泡膜外流的结果保卫细胞 中9 0 以上的溶质贮存于中心液泡中，作为膨压调节的主要因子。如果要减少保卫细胞膨压，关 闭气孔，大量的溶质需要穿过液泡膜从液泡运至胞质并通过质膜离子通道最终运至胞外实验的 最新研究表明，p t p a $ 的专一性抑制剂氧化苯胂( p h e n y l a r s i n eo x i d e ，p a o ) 和钒酸钠可以抑 制水分亏缺时玉米胚芽鞘中a b a 的积累，p t k 的抑制剂4 5 ，7 - - - 羟异黄酮( g e n i s t e i n ) 可以模拟 水分胁迫，而促使a b a 积累。m a c r o b b i e ( 2 0 0 2 ) 在研究鸭趾草气孔运动时发现，p a o 可以阻 止外源a b a 及其他刺激诱导的气孔关闭，在关闭的气孔中加入p a o 关闭的气孔可以重新张开 h 2 0 2 和c a 2 + 是a b a 信号途径的下游成分( s a ij ，2 0 0 2 ) ，a b a 、h 2 0 2 和高c a 2 + 都促使胞内c 矿 + 浓度升高，胞内c a 2 + 浓度升高会改变质膜和液泡膜上x _ 通道的活性( g - u i l l e ng ，1 9 9 9 ) ，诱 导气孔的关闭，而p a o 抑制c a 2 + 诱导的气孔关闭效应。这些现象说明胞内c a 2 + 的升高是一个 对p a o 敏感的过程，p a o 或作用于c a z + 的内流，或是作用于胞内c a 2 + 增加引起的信号链的下 游。由此推测，p t p a s 8 成分可能位于质膜和液泡膜上c a 2 + 通道的下游和k + 通道活性的上游。 如上所述，植物中p t p a s e s 作用的主要靶位是参与许多信号过程的m a p k s 而且，m a p k 在a b a 诱导产生和气孔关闭过程中，对氧化信号的产生、放大及其信号途径中刺激和反应的特异性却有 调节作用但是p m p a s e s 在调节保卫细胞气孔关闭是否通过调节m a p k 活性来实现，尚不清楚， 有待深入研究 最近的研究表明，在植物体内除了m a p k s 之外，p t p a $ ( 镕还有其他的作用底物。纤维蛋白 原( p r o f i l i n ) 的磷酸化作用位点发生在它的酪氨酸残基上( g u i l l e ng ，1 9 9 9 ) 细胞骨架组织也 可以通过酪氨酸磷酸化作用进行调节。研究证明，含羞草肌动蛋白( a c t i n ) 的磷酸化位点发生在 它的酪氨酸残基上，p t p a s c $ 抑制剂氧化苯胂阻断含羞草叶枕细胞中肌动蛋白的酪氨酸脱磷酸化 作用，而肌动蛋白的磷酸化和脱磷酸化作用则参与含羞草对触摸引起的叶子敏感反应，从而抑制 触摸引起的叶柄弯曲运动( k a m e y a m a c t a l 。2 0 0 0 ) 含羞草叶片的运动机制与气孔保卫细胞的 运动机制相似，植物叶片运动现象是由定位于小叶片叶柄的运动蛋白的k + 离子的内外流动引起 的，所以，肌动蛋白的酪氨酸磷酸化可能与运动蛋白的l f 相关 5 中国农业大学硕士学位论文前言 图1 2 a b a 诱导气孔关闭的简单模式( l u a a , 2 0 0 2 ) 1 3 3 调节植物的生长发育 c d c 2 5 磷酸酶( c e l ld i v i s i o nc y c l y p h o s p h t a s e s ) 是d s p t p 的一类，在细胞分裂周期过程中 起作用。c d c 2 蛋白激酶上的酪氨酸残基磷酸化后而失活，c d c 2 5 磷酸酶可促使c d c 2 激酶上 起抑制作用的磷酸化酪氨酸残基脱磷酸化，进而激活c d c 2 激酶( d u n p h y ，1 9 9 4 ) 。这个机制在 动物和酵母中已经很成熟，但是在植物中还没有鉴定到与c d c 2 5 磷酸酶类似的同源物。有研究 表明酵母中的c d c 2 5 磷酸酶也激活植物的细胞分裂( z h a n gk ，1 9 9 6 ) 这为p t p 可能存在并调 节c d c 2 提供了证据。基于序列比对和结构的研究，在拟南芥中找到一个c d c 2 5 同源基因a r a t h ( i s a b e l l e ，2 0 0 4 ) ，拟南芥c d c 2 5 包含一个保守活性域，但是不具有人类c d c 2 5 的n 调节域， 它在大肠杆菌中的原核表达表明编码的蛋白具有酪氨酸磷酸酶活性，晶体结构经核磁共振n m r 分析发现在c 端有一个z n 指结构，并且有z n 存在。 肿瘤抑止因子p t e n ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o g ) 也是d s p t p 一类的酶，它们有p t e a s c f l 的催化核心序列，其结构域与细胞骨架蛋白张力蛋白( t e n s i n ) 有高度的相似性( l i e t a l ，1 9 9 7 ； l i a w e t a l ，1 9 9 7 ) ，在动物中具有抑止细胞生长的功能。从拟南芥中鉴定出一些基因，它们编码 的蛋白与p t e n 有高度同源性。例如a t p t e n i 是拟南芥中一个类似p t e n 的基因，a 旷n l 在 花中特异性表达，而且当用r n a 干扰技术使a t p t e n i 发生基因沉默后花粉不能正常发育( c , u p t a “以，2 0 0 2 ) ，重组的a t p t e n i 是一个有活性的磷酸酶，能够水解多肽上的磷酸化酪氨酸残基， 也能使p m 3 脱磷酸化。 6 中国农业大学硕士学位论文 前言 研究发现，在动物中还有一类类似p 1 弧的蛋白，虽然有些特性与f r r p a s 相似，但是不具 有磷酸酶的活性( u w a n o g l i o 甜以，1 9 9 9 ) 在植物中也发现了这种蛋白的存在- 如p a s 2 ( y a r m i c k ， 2 0 0 2 ) 。 2 植物成花诱导机制 高等植物生活周期需要经过种子萌发、营养生长、开花、受精、胚胎发育、种子形成等一系 列发育阶段。高等植物为了进行成功的有性繁殖。繁衍后代，它们必须在适宜环境条件下开花， 因而开花时程对高等植物有着重要的适应意义，而且开花过程直接控制作物生育期的早晚，与作 物产量品质密切相关，该领域相关研究对农业和园艺生产具有重要的意义 高等植物花的形成是由其顶端分生组织从营养生长向生殖生长转变而启动的，而植物从营养 生长向生殖发育的转变是由一系列环境和内部因子调控的。通过改变环境因子并分析这些处理的 后续形态、生理及生化变化，植物生理学家们研究了上述过程。9 0 年代，控制成花启动时程的机 制在拟南芥中通过鉴定较野生型开花早或晚的突变而得到了广泛的研究，这些突变称为开花时程 突变，而其相应的基因称为开花时程基因，以成功分离花器官发育控制基因为标志，植物学研究 取得了突破性进展，并从此进入快速发展阶段，该领域受到高度重视，开花时间调控机制的研究 成为植物学研究的新热点 不同的植物种类可能采取不同的途径进入开花转换状态，同种植物也可能在不同的生活环境 中存在其它的开花转换途径，当主要的开花转换启动途径遇到阻碍时，其他途径也可能成为正式 的开花途径。近年来通过对拟南芥突变体的研究、基因的分离及功能分析。使人们对开花的分子 机制有了新的认识。拟南芥开花时间至少受4 种遗传途径的调控，即：光周期途径，春化途径， 自主途径和赤霉素途径。这四条途径并不是独立的，通过_ f l c ，f p d ，s o c i ，c o ，f t 等控制开 花的主效基因相互作用使这4 条途径相互联系，成为一个整体。成花转变过程中各种成花诱导信 号传递剑花分生组织特异性基因a p i ，f u l ，促进花的形态建成( p u u e r i u ，2 0 0 1 ) 2 1 光周期途径 影响高等植物开花时程最重要的环境因子之一便是光的日照长度，即光周期( p h o t o p e r i o d ) ， 它最初是由g a r n e r 和a l l a r d 在上世纪的2 0 年代发现的，光周期对高等植物开花的调控是通过 相关基因问的相互作用来实现的，这些基因包括参与花启动发育控制基因，昼夜节律时间钟 ( c i r c a d i a nc l o c k ) 调控基因及光受体信号转导基因。 2 0 世纪初美国科学家g a m c r 和a l l a r 用一种烟草突变体首次证实了光周期对开花的影响。植 物通过光受体感受光信号后，作用于生物钟，调控某些促进开花基因的表达以及降解某些抑制开 花因子，接着花分生组织特性基因表达升高，植株开花。分子遗传方法已经揭示：应答光周期的 基因，一部分编码调节蛋白来特异地调控开花，另一部分编码光信号传导途径中的某些成分或参 与生物钟的调节 研究表明光周期对开花影响的模式可能是：接受不同波长的光受体接收光周期后，由光信号 传导分子将光信号传递到内源的控时器，生物钟( 凼：a d i a n c l o c k ) ”，生物钟将检测的目照长 7 中国农业夫学硕十学位论文 前苦 度信号传输给主要信号分子c o ，进而诱导其靶位基闪f t 的表达，