（分析化学专业论文）稳定同位素碘标记icpms在免疫分析中的应用.pdf

摘要 摘要 随着生命科学的进步，免疫分析法获得了不断的发展。近来，电感耦合等离 子体质谱( i c p m s ) 在免疫分析中成为人们关注的一个检测手段。由于电感耦 合等离子体质谱具有灵敏度高、检出限低、线性动态范围宽、干扰较少等优点， 并可以进行多元素同时快速分析，因此在高通量的生物免疫检测方面具有广泛的 应用前景。本工作中研究了稳定同位素碘标记蛋白技术，建立了电感耦合等离子 体质谱免疫碘标记蛋白分析方法，并将该法应用到特异性免疫蛋白检测和致病性 菌检测中。论文共有四个部分组成：1 文献综述；2 稳定性同位素碘标记蛋白； 3 碘1 2 7 标记电感耦合等离子体质谱用于免疫分析；4 蒸气发生电感耦合等离 子体质谱法测定碘。 第一章通过文献综述介绍了免疫分析方法的发展状况及其在各领域的应用， 阐述了免疫分析的标记方法及进展，并对免疫分析发展趋势作了扼要论述，突出 了电感耦合等离子体质谱在免疫分析应用中的可行性。 第二章研究稳定性同位素碘一1 2 7 标记蛋白的方法。介绍了不同的碘标记方 法及其发展情况，并对各种碘的标记方法进行了比较；研究中采用溴代琥珀酰亚 胺法实现非放射性碘1 2 7 对蛋白的标记：溴代琥珀酰亚胺是一种比较温和的氧化 剂，并在均相中进行反应，标记反应步骤简便，标记率高、标记物稳定、活性好， 实验证明是一种理想的碘标记方法。 第三章主要介绍了稳定性碘标记电感耦合等离子体质谱用于免疫蛋白分 析。研究中首先以兔抗大肠杆菌为抗原，羊抗兔i g g 蛋白为抗体，对羊抗兔i g g 蛋白进行碘标记，然后进行免疫反应，以电感耦合等离子质谱进行检测，建立了 免疫蛋白检测的碘1 2 7 标记电感耦合等离子体质谱免疫分析法。另外，对免疫 微孔板进行了修饰实验；建立检测前碘标化合物的处理方法，防止碘的挥发和碘 的记忆效应。最后，使用该方法对致病性菌的免疫蛋白分析作了尝试，获得一定 理想的效果。 第四章主要建立了一种在线化学蒸气发生电感耦合等离子体质谱测定碘的 方法，利用碘负离子的还原性，采用氧化还原手段，将碘负离子氧化为碘单质； 然后通过碘单质的易挥发特点，将碘蒸气直接导入等离子体。即采用化学蒸气发 摘要 生法f c h 锄i c a lv a p o u rg e n e r a t i o n ) 进行进样，与传统的雾化进样相比，能更有效 地引入样品，提高了样品传输效率和检测灵敏度。该方法的建立还对碘的形态作 了尝试，对碘负离子和碘酸盐进行检测。 本研究工作的创新点： 1 为电感耦合等离子体质谱检测法与免疫方法相结合完成了非放射性碘12 7 标 记蛋白的研究。实验中采用溴代琥珀酰胺( n b s ) 法，实现了稳定性同位素碘标 记蛋白方法的建立；方法采用非放射碘标记，克服了传统方法中碘放射性对操作 者带来的危害和困难等。 2 将电感耦合等离子体质谱检测法与免疫方法相结合，建立了免疫蛋白检测的 碘一1 2 7 标记电感耦合等离子体质谱免疫分析法，并实现该方法在特异性免疫蛋 白检测和致病菌检测中的应用。 3 建立一种在线化学蒸气发生电感耦合等离子体质谱测定碘的方法。即采用化 学蒸气发生法( c h e m i c a lv a p o u rg e n e r a t i o n ) 进行进样，能更有效地引入样品，提 高了样品传输效率和检测灵敏度。 关键词：免疫分析；i c p m s ；碘标记 l l a b s t r a c t a b s t r a c t i m m u n o a s s a yh a sb e e nd e v e l o p e dc o n t i n u a l l yf o l l o w i n gt h el i f es c i e n c e p r o g r e s s i n g r e c e n t l y ，t h ei n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m am a s ss p e c t r o m e t r yh a sg o t t e n r e c o g n i t i o nb e c a u s eo fi t so u t s t a n g da d v a n t a g e ，s u c ha s ，h i 曲s e n s i t i v e 、l o wd e t e c t i o n l i m i t 、m u l t i c o m p o n e n ta n a l y s i sa b i l i t ya n ds oo n ，s ot h ei m m u n o a s s a yw i t hh i 曲f l u x h a sag o o df o r e g r o u n d i nt h es t u d y , t h et e c h n i q u eo fs t a b l ei s o t o p ei o d i n el a b e l l i n g p r o t e i na n di c p m sl i n k e di r n m u n o a s s a yh a sb e e ne s t a b l i s h e d ，w h i c hw a su s e di nt h e d e c t e t i o no fs p e c i a l i t yo fp r o t e i na n db a c t e r i a t h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ff o u r c h a p t e r s ：1 r e v i e w ；2 i o d i n eo fs t a b l ei s o t o p el a b e l l i n gp r o t e i n ；3 n o n r a d i o a c t i v e i o d i n e l a b e l e d a n t i b o d i e s - i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m a m a s ss p e c t r o m e t r yf o r i m m u n o a s s a y ；4 v a p o u rg e n e r a t i o ni n d u c t i v e l yc o u p l e dm a s ss p e c t r o m e t r yi n d e t e r m i n a t i o no fi o d i n e c h a p t e ro n eo ft h i s t h e s i sw a sa l lo v e r v i e wo ft h ed e v e l o p m e n ta b o u t i m m u n o r e a c t i o na n dt h ef i e l di nw h i c hi tw a su s e d ；t h e l a b e l l i n gs k i l l s a n d d e v e l o p m e n th a v eb e e ne x p a t i a t e db r i e f l y , i na d d i t i o n ，t h es t a n d a r d i z a t i o no fl a b e l l i n g - i m m u n o a s s a ya n dt h ed e v e l o p m e n t a lt r e n dw e r ed i s c u s s e d ；e s p e c i a l l y , p o p i n go u tt h e m e t h o do fi m m u n o a s s a yl i n k e dw i mi c p m s i nc h a p t e rt w o ，t h em e t h o da b o u ti o d i n eo fs t a b l ei s o t o p el a b e l l i n gp r o t e i nw a s e s t a b l i s h e d t h em e t h o d sa n dt h ed e v e l o p m e n t so fd i f f e r e n ti o d i n e l a b e l l i n gw a r e i n t r o d u c e d ，a n dc o m p a r e de a c ho t h e r d u r i n gt h i ss t u d y ，t h ep r o t e i nw a st a g g e dw i t h n o n r a d i o a c t i v e1 2 7 i u s i n g n b r o m o s u c c i n i m i d e o n b s ) t op r o d u c e t h ei c o m p o u n d ：n b si sak i n do fo x i d a n tw h i c hi sm i l da n dt h er e a c t i o nh a p p e n e di n s o l u t i o n ，s ot h el a b e l l i n gm e t h o dw a sap e r f e c to n ew h i c hw a sc o n v e n i e n to p e r a t i o n 、 h i 曲l a b e l l i n gt a g - y i e l da n dt h ei - c o m p o u n db e i n gs t a b l e i nc h a p t e rt h r e e ，t h e i m m u n o a s s a ya b o u ti o d i n el a b e l l i n gp r o t e i n - i n d u c t i v e l y c o u p l e dp l a s m am a s ss p e c t r o m e t r yw a sd i s s e r t a t e d f i r s t l y , t h eg o a ta n t i e s c h e r i c h i a c o l i ( g a e ) a n dg o a ta n t ir a b b i t ( g a r ) w e r es e l e c t e da st h ea n t i g e na n da n t i b o d y r e s p e c t i v e l yi nt h ee s t a b l i s h m e n to ft h i si m m u n o a s s a y , a n dt h ei o d i n ew a sd e t e c t i o nb y i c p - m sa f t e rr e a c t i o n i na d d i t i o n ，t h eo r n a m e n to ft h ep o l y s t y r e n em i c r o t i t r ep l a t e 1 1 1 a b s t r a c t h a sb e e ni n v e s t i g a t e d ；t h em e t h o da b o u td i s p o s a lo fs a m p l ew a se s t a b l i s h e d ，b yw h i c h n o to n l ya v o i d i n gt h ev o l a t i l i z a t i o no fi o d i n ea n da b a t i n gt h ee f f e c to fm e m o r yb y i c p m s i nt h ec h a p t e r , w ea l s od i ds o m ee x p e r i m e n ta b o u tt h ed e t e c t i o no fb a c t e r i ai n t h em e t h o d i n c h a p t e rf o u r , a no n l i n ev a p o u rg e n e r a t i o ni c p m sm e t h o d f o rt h e d e t e r m i n a t i o no fi o d i n ew a se s t a b l i s h e d i nt h es t u d y , d e p e n d i n go nt h ed e o x i d i z a t i o n o ft h era n dt h em e a n so fo x i d i z a t i o n ，s e n s i t i v i t yw a sr a i s e dd u et oi m p r o v i n g t r a n s f e r se f f i c i e n c yt oi c p m sb yu s i n gt h et e c h n i q u ew h i c ht h ei 。w a so x i d i z e dt oh t h a tw a sv o l a t i l eb e f o r eb e i n gd e t e c t e d i na d d i t i o n , t h ed i f f e r e n tm o d a l i t yo fi o d i n e h a v e b e e nd e t e c t e db yt h em e t h o d ， t h em a i ni n n o v a t i o no ft h i st h e s i si s ： 1 t h en o n r a d i o a c t i v ei o d i n e ( 12 7 ) - l a b e l l e dp r o t e i nw a se s t a b l i s h e di no r d e rt o c o m b i n ei c p - m sw i t hi m m u n o a s s a y i nt h ee x p e r i m e n t ，w ea d o p t e dt h e m e t h o do fn b st oa c h i e v et h ep r o t e i nl a b e l l i n gw i t hi o d i n e , t h ec h o i c eo f s t a b l ei o d i n ea v o i d sr a d i o a c t i v ei o d i n e - l a b e l l i n gw h i c hw a sd i f f i c u l tf o r e x p e r i m e n tb e c a u s eo f t h er a d i o a c t i v i t y 2 an e wi m m u n o a s s a yw a se s t a b l i s h e db yt h e1 2 7 il a b e l l i n gp r o t e i nl i n k e dw i t h i c p m s ，a n dt h ei m m u n o a s s a yw a su s e di nt h ed e t e c t i o no f b a c t e r i a 3 a no n l i n ev a p o u rg e n e r a t i o ni c p m sm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi o d i n e w a sa c h i e v e d ，w h i c ht h es e n s i t i v i t yc a nb er a i s e dd u et oi m p r o v i n gt r a n s f e r s e f f i c i e n c yt oi c p m sb yu s i n gc h e m i c a lv a p o u rg e n e r a t i o n k e yw o r d s ：i m m u n o a s s a y ；i c p - m s ；i o d i n el a b e l l i n g i v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。 声明人( 签名) ： 年月日 确霓孙辛趸，否 饔、委 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密() ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期：年月f t 日期：年月日 第一章文献综述 1 引言 第一章文献综述 免疫分析( i m m u n o a s s a y ) 是利用抗原与抗体的特异性结合作用来选择性识别 和测定可以作为抗体或抗原的待测物，它是免疫学长期发展的一个重要分支。二 十世纪六十年代，e k i n s t 、y a l l o wr 和b e r s o ns a t 2 】同时分别提出了免疫分析的方 法，1 9 7 5 年，k o h l e l 和m i l s t e i n 开创性地发展了单克隆抗体技术，大大推动了 免疫分析的应用【3 】；目前，它已成为临床生化检验的一种重要技术，可以分析人 体内具有生物活性的微量物质如乙肝病毒、与糖尿病有关的胰岛素、与肝癌有关 的甲胎蛋白等，分析的样品为少量的血液、尿液、唾液等体液。免疫分析的另一 种主要组分是示踪物。将放射性核素、酶或荧光物等探测灵敏的物质联接到抗原 或抗体上即可获得示踪物，示踪物的应用大大提高了分析的灵敏度。1 9 5 3 1 9 5 6 年间，美国科学家b e r s o n 和y 越o w 【4 】应用放射性碘标记蛋白质进行蛋白质代谢示 踪研究，并发现非标记抗原能竞争抑制标记抗原与抗体的结合，并能从结合能力 测出未知抗原的量。1 9 6 0 年，b e r s o n 和y a l o w 应用放射性核素示踪的高灵敏度 及免疫反应的高特异性，从而建立了放射性免疫测定法( r a d i oi m m u n o a s s a y r 队) 。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上 的一个新纪元。放射免疫分析( r i a ) 具有灵敏度高、特异性强、简便实用、成 本低廉等优点，它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意 义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人 们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础，也为生物医学的 微量物质分析开创了新的领域。其后3 0 年中，内分泌科学的飞速进展，充分证 明了这一超微量分析技术的巨大推动力。1 9 7 7 年，这项技术的发明者荣获诺贝 尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其它领域，如病毒学、 药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科， 如农业科学、生态学及环境科学等。放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一 切生物活性物质。但是由于放射线的一些固有缺点，限制了它的应用掣。 第一章文献综述 为了替代r i a ，灵敏度高的非放射免疫分析法接着成为了研究的热点；1 9 4 1 年，c o r n s 和k a p l a n 把荧光素和抗体结合后，用来定位组织种的抗原，现已发展 成为各种类型的荧光免疫分析法( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a yf i a ) ，这种方法以 荧光物质作为标记物，紫外光激发发光，借助荧光显微镜来测定或定位未知抗原； 近年来，时问分辨荧光免疫分析的研究异常活跃，它是以稀土离子标记抗原或抗 体的超高灵敏度检测技术，具有标记物制备简便、有效期长、不污染环境、操作 短等优点【6 】oe v g v a l l t 7 3 和w e e m a n 8 1 同时提出了酶联免疫分析法( e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a ye l i s a ) ，但灵敏度不如放射免疫方法，而且酶的活性易受 影响。1 9 7 1 年，h a l m a n 将化学发光原理与免疫反应结合起来，建立了化学发光 免疫分析法( c h e m i l u m i n e s c e n e c ei m m u n o a s s a yc l i a ) ，这种方法虽然灵敏度可 以达到放射免疫方法的水平，但影响因素较多，稳定性较差，而且化学反应后， 样品的发光无法再现【6 】。通常免疫分析可以测得毫微克或微微克的活性物质，比 一般的化学分析的灵敏度要高一万或一百万倍。由于样品存在的其他干扰物不会 产生免疫识别，因此免疫分析具有高特异性和高分辨率，应用十分普及。因此， 自免疫分析问世以来一直得以迅速发展，建立了多种检测方法( 如放射免疫分析、 酶免疫分析、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析等) ，可检测物质已达 数百项包括激素、蛋白、维生素、病毒、细菌、寄生虫抗体、肿瘤标志物及药物 等；其中许多项目已开发成方便应用的免疫分析药盒并形成规模生产，更加促进 了免疫分析应用的推广和普及。1 9 9 2 年美国等1 2 个国家仅开展肿瘤标志物检测 即达1 3 7 亿人次，其中主要应用免疫分析。我国每年也有5 0 0 0 万人次左右接受 免疫分析检测。免疫分析不仅为临床诊断提供了依据，在内分泌学、病毒学、药 理学、血液学及肿瘤学等研究方面得以应用，而且在农业科学、生态学及法医学 等领域的应用也有所进展。 标记免疫分析是一门综合性学科，也是- - f l 边缘学科，是集基础医学、实验 医学及临床应用于一体的学科。在当前的各种免疫诊断技术中标记免疫分析技术 是最为活跃的、发展最快的一个领域。传统免疫分析法( 又称n o n 1 a b e l e d i m m u n o a s s s a y s ) 主要是借助抗体的价性和( 与抗原结合后) 激活补体反应活性， 可分为免疫沉淀分析法( 包括沉淀法和凝集法) 和脂质体溶解分析法，此外，涉 及补体反应的还有细胞毒性试验以及免疫粘连凝集等方法。标记免疫分析法则采 第一章文献综述 取了不同的分析原理，标记分析依靠在分析体系中引入探针系统实现检测，摒弃 了抗体自身具备的分析性能( 传统免疫分析中所利用的) 。由于灵敏的探针分子 和新的测定原理的引进，标记分析法可以达到更加灵敏的分析结果同时也扩大了 待测物的范围。然而传统的免疫分析法仍然有相当重要的地位，特别是结合了标 记分析原理的方法，近年来也不断的发展，有不少新方法的出现【9 13 1 。 自八十年代起，特别示1 9 9 0 年以后，随着新的标记物质的发现及新的标记 方法的使用，以及电子计算机、自动化控制技术的广泛应用，有力地推动了免疫 检测技术的发展。一些以灵敏度高、稳定性好、反应快、检测过程全自动化为特 点的非放射性免疫检测技术的出现，向放射免疫检测技术发起了有力的挑战。国 际上自九十年代开始，一些大型实验室，标本量大的检测项目都已逐步应用各种 非放射性标记的自动化设备进行分析。国内临床医学检测领域对非放射检测技术 也有极大的热情，特别是一些大型医院陆续进口了此类设备。非放射性免疫技术 上的先进，操作上的简便性，并且有效地克服了核素需保护、试剂保存时间短、 反应时间过长等放射性免疫检测技术固有的缺点。因此非放射性免疫分析技术在 临床医学及其他生化领域中备受欢迎，迅速地得到推广应用。 当今在各种全自动化学发光免疫分析系统推出的情况下，传统的r i a 使用 市场逐渐缩小，特别是在沿海发达地区。但r i a 经历了4 0 年的研究应用，灵敏 度、特异性、精密度、稳定性及临床符合率已达到较高水平，国产试剂盒的技术 含量大大提高，在样品量不大的中小型医疗机构仍广泛使用。检测设备及试剂盒 价格便宜、操作简单。在生物医学的基础研究中，新的生物活性物质发现日益增 多。 2 标记免疫分析 在标记免疫分析中，标记物和标记方法是标记分析的一个重要环节，目前常 用的标记物总结于表1 中。在诸多的标记物里，常用的的为放射性同位素、酶及 其底物、荧光分子、化学和生物发光系统等，这些标记物几乎占了应用的全部。 第一章文献综述 表1 1 一些常用标记物 标记物检测方法标记物检测方法 辣根过氧化酶( h r p )目测、显色、荧光、罗丹明衍生物荧光分析 发光分析藻胆蛋白荧光分析 碱性磷酸酯酶( a p )目测、显色、荧光、 发光、电化学分析 t b ” 时间分辨荧光分析 3 - 半乳糖苷酶目测、显色、荧光、e u ”及其螯合物时间分辨荧光分析 发光分析e u 3 + 螯合物剂时间分辨荧光分析 葡萄糖一6 一磷酸酯脱氢酶显色s i n 时间分辨荧光分析 b 哥l 糖苷酶 显色 蜂毒酶显色( 脂质体包藏酶)异鲁米诺衍生物发光分析 尿素酶显色y 啶酯发光分析 胆碱酯酶抑制剂显色( 乙酰胆碱酯酶)胶乳颗粒浊度分析，颗粒计数，目测 o d 半乳糖苷酶片段显色( 补充片段)染色细菌 目测 p a d 辅基显色( 葡萄糖氧化酶)6 7 c o固体闪烁计数 荧光素荧光分析 1 2 7 i 固体闪烁计数 香豆素衍生物荧光分析脂质体( 包藏酶或染料)显色，荧光分析 注：参阅文献1 1 4 】 2 1 放射分析技术和非同位素标记 放射免疫分析( r i a ) 是建立在标记抗原( a g ) 和非标记抗原( a g 或待测物， 与特异性抗体( a b ) 的竞争结合基础上，有灵敏度高( 最高可达1 0 4 m o l l l ) 、特异 性强、重复性好、用样量少等优点。随着单克隆抗体的出现以及固相化技术的巩 固和发展，出现了以标记过量抗体与被测抗原或被测物的非竞争结合为基础的免 疫放射分析( i r m a ) ，是免疫分析技术的一个重大进展，具有灵敏度更高( 晟高可 达1 0 0 6 m o l l l ) ，工作量程宽和操作程序更简单等优点，目前已得到广泛应用【1 5 】。 2 1 1 放射免疫分析的基本试剂 ( 一) 标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被测物质 的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为 定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性， 即在合理的贮存条件下保持原来的特性。 按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准 第一章文献综述 曲线。 ( 二) 标记物 标记抗原应具备： ( 1 ) 比放射性高，以保证方法的灵敏度； ( 2 ) 免疫活性好； ( 3 ) 所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不 易的抗原尤其重要； ( 4 ) 标记简便、易防护等。 2 1 2 放射性同位素的选择 放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量，这种测量较灵敏而方 便，故多用放射性同位素。标记抗原，常用的放射性同位素有3 h 、1 4 c 、1 3 1 i 和 1 2 5 i 等。在使用上各有其优缺点，可根据所进行的放射免疫分析的类型特点，标 记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作适当的选择( 表1 2 ) 。大多数抗 原分子中都含有c 、h 等原子，所以用1 4 c 或3 h 标记不改变抗原的结构及其免 疫学活性，且1 4 c 、3 h 半衰期长，所标记的抗原长时间放置后仍可使用，这都是 其优点。1 4 c 或3 h 标记的不足之处是操作较繁琐，并难以获得高比放射性的标 记物；3 h 及1 4 c 放出的都是弱1 3 射线，需用较昂贵的液体闪烁计数器方能获得 较高效率的测量，且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易丧失免 疫化学或生物学活性者，则仍以采用3 h 或1 4 c 标记物为佳。 表1 2 标记抗原常用的放射性同位素及其性质 射线种类及能量( 百万电子伏特) 放射性元素半衰期 b丫 1 4 f 、 5 7 2 0 年 o 1 5 5 o 3 h 1 2 5 年 0 0 1 8 9 1 2 5 16 0 天 0 0 3 5 1 3 1 i8 0 5 天 0 6 0 8 ，0 3 3 5 ，0 2 5 00 3 6 4 ，0 6 3 7 ，0 7 2 2 大多数抗原分子中是不含碘的，引入碘原子就改变了抗原的分子结构，往往 第一章文献综述 容易损伤抗原的免疫化学活性；且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变 使放射性降低，因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适 用，放射性碘放出丫一射线，用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的 测量，测量操作也很简单。由于这些突出的优点，目前在放射免疫分析中，使用 放射性碘标记物最多。 从应用角度来看，1 3 1 i 和1 2 5 i 又各有其优缺点，可根据实验的要求、仪器的 条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言，屹5 i 有较多的优点， 一是半衰期适中，允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间；二是它只发射 2 8 k e v 能量的x 射线和3 5 k e v 能量的y 射线，而无b 粒子，因而辐射自分解少， 标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象( 包括蛋白 质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等) 的标记，且操作简单，一 般实验室都不难做到。 2 1 3 放射免疫分析( r i a ) 的优点 a ：低本底和高灵敏度； b ：特异性强由于抗原一抗体免疫反应专一性强，所被测物一定是相应的抗 原。良好的特异性抗体，能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异 构体。 c ：不受周围环境和样本内干扰物质的影响； d ：与小分子量同位素的结合不影响免疫反应； e ：应用范围广据不完全统计，目前至少已有3 0 0 多种生物活性物质己建立了 r l 。 f ：完善的放射测量体系等。 2 1 4 放射免疫分析( r i a ) 的缺点 a ：只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性百失去免疫活性 的物质是测不出的 b ：灵敏度受方法本身工作原理的限制，对体内某些含量特别低的物质尚不能测 定。 6 第一章文献综述 c ：由于放射免疫分析是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应， 测得的值是相对量而非绝对量。 d ：同位素的半衰期使货架期短，试剂盒不宜储存； e ：结合于抗原或抗体分子上的( 如1 2 5 i ) 分子有限，过高会引起结合物的自照射分 解； f ：试剂的使用，购买以及废物处理等均引起一定的辐射安全问题，存在放射线 辐射和污染； g ：虽然r i a 涉及的放射性较小，但仍会面临公众的反核的负面影响。 为满足社会上检测无核污染和临床上快速诊断、报告等要求，研究和利用非 同位素标记的免疫分析的技术不断发展和完善。2 0 世纪7 0 年代末发展起来的非 同位素标记的各种标记免疫分析技术【1 6 - 2 0 1 克服了r i a 固有的缺陷，灵敏度更高， 可测范围宽，试剂盒使用时间长，操作及测量可全自动化进行。虽然非同位素标 记分析技术的标记物无放射性，但都必须具备下列条件： ( 1 ) 灵敏度检测的灵敏度高，最高可达1 0 - 1 5 _ 1 0 。8 m o l l ； ( 2 ) 结合特性结合于免疫试剂的非同位素标记物质应不影响抗体或抗原的 免疫活性、亲和力、特异性，不减少其信号的产生： ( 3 ) 均一性对均相免疫分析而言，免疫反应不应使反应成分形成物理分离； ( 4 ) 稳定性非同位素标记物必须对样本中的有色物质、淬灭物质、内源性酶 或酶抑制物等影响物质不敏感，保证标记试剂能较长时期的稳定储存，在自动化 的探测系统中得到较小的批内和批间误差； ( 5 ) 环境因素的不敏感性放免分析的最大优点为其不受样本中缓冲液、温度 等变化对测定值的影响，选择非同位素标记物时也应考虑到对环境的不敏感性。 ( 6 ) 安全性放射性同位素的危害引起公众的反对，非同位素标记物更应无 毒、安全、无危险和不影响环境。 ( 7 ) 应用性非同位素标记物来源方便，标记条件温和，容易得到理想结果和 重复性好，简便快速，并能广泛应用于临床和研究。 2 2 酶免疫分析 1 9 6 6 年a w a m e a s 和u r i e l 首先将酶偶联于抗原和抗体贮，1 9 7 1 年，e n g v a l l 第一章文献综述 和p e r l a m a n 7 】及w e e m a n 和s c h u u r 两种学者用酶代替同位素制备了酶标记试剂， 创立了酶免疫分析技术( e n z y m ei m m u n o a s s a ye i a ) 。1 9 7 4 年s y v a c o 首先报道 了均相酶测免疫分析( e n z y m em o n i t o r e di m r n u n o a s s a y , i m i t ) ，开创了酶免疫分析 的临床应用。至今有二十多中酶被应用于酶免疫分析技术【2 2 2 3 1 ，但应用最多的认 识辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eh r p ) 和碱性磷酸酶( a l k a l i n e p h o s p h a t a s ea k p ) 。酶为催化特异反应的一种生物蛋白，酶催化反应的高度转换 数能产生很大的放大效应，其探测效率颇高，一般平均1 个酶分子1 秒钟催化产生 l 千个分子的有色、荧光或发光物质。 2 2 1 类型 ( 1 ) 按抗体偶联的固相物质类型不同，有板式法( 9 6 孔板) 和管式法，后者以 抗体涂在管壁以增加透光量来提高精度。 ( 2 ) 按分离结合抗体或游离抗体的不同，有异相( 固相分离) 和均相酶免疫分 析( 测定时无需分离而直接测定反应体系中的酶活性) ，后者常用于小分子抗原如 激素或药物的测定。 ( 3 ) 斑点酶免疫结合试验【2 4 】，或称斑点金免疫结合试验，是酶免疫分析的另 一种发展，其特点是以微孔膜为载体，以酶或金为标记物，阳性结果以着色斑点显 示在膜上，使用方便，反应快速，有临床实用价值。 2 2 2 原理 异相酶免疫分析的基本原理和免疫放射分析( i m m u n o r a d i o m e t r i ca s s a y i r m a ) 相同。抗体与固相管或珠相结合，另一方面抗体以酶标记取代放射性同位 素标记，如此达到分离结合抗体和游离抗体，经加入底物显色起到信号放大作用。 常用的酶有碱性磷酸酶( a k p ) 、辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s h ) 和半乳糖苷酶 ( b d g ) 等。酶经底物显色后，探测灵敏度有所提高，但由于受到空间排斥的影响， 其灵敏度和重复性仍有一定的限制。 2 3 荧光免疫分析 早在4 0 年代已用荧光素标记抗原或抗体，如1 9 4 1 年c o o n 等用d 一葸标记抗 第一章文献综述 体监测肺炎球菌。荧光标记物质有硫氰基荧光素( t i t c ) 、四乙基罗丹明( r b 2 0 0 ) 和四甲基异硫酸基罗丹明( t r i t c ) 等，荧光免疫分析技术已广泛应用于组织化 学、微生物学和寄生虫学。但由于高本底影响和监测仪器的灵敏度低，一直未能 实现荧光免疫定量分析的临床应用。时问分辨荧光免疫分析和荧光偏振测定技术 的问世开创了荧光免疫分析( f i a ) 定量的新时期。 2 3 1 类型 ( 1 ) 时间分辨荧光免疫分析( t i m e - r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a yt r f i a ) t 2 5 - 2 7 ， 目前，时间分辨荧光免疫分析有三种较好的方法： 第一种是镧系离子标记洗脱增强时间分辨荧光免疫分析法 ( d i s s o c i a t i o n e n h a n c e m e n tl a n t h a n i d ef l u o r o i m m n o a s s a yd e l f i a ) 2 8 2 9 3 3 1 ，该法 的优点是灵敏，但极易受到外源性铕离子的污染影响。由于我国为富稀土国家， 所以d e l f i a 法的广泛应用将存在较大的问题。 第二种是螯合试剂多重标记时间分辨荧光免疫分析法【3 4 1 ，d i a m a n d i s 等首先 报道了以b c p d a 标记的方法【3 5 3 习，其螯合物有强荧光效应，无需增强剂，这一 方法完全克服了外源性铕离子的污染问题，在应用上更有优越性。 第三种是酶放大时间分辨荧光免疫分析法【3 8 3 9 1 ，这是一种酶免疫分析法同时 间分辨荧光检测相结合的方法。 ( 2 ) 微粒子酶荧光免疫分析( m i c r o p a r t i c l ee n z y m ei m m u n o a s s a ym e i a ) 微 粒子酶荧光免疫分析法( m e i a ) 为酶和荧光发光物质相结合，如a k p 与4 一甲基伞 型酮磷酸盐相遇，脱去磷酸形成发出强荧光的甲基伞型酮，用于大分子量抗原或 抗体的检测。 ( 3 ) 荧光偏振免疫分析( f l u o r e s c e n c ep o l o r i z a t i o ni m m u n o a s s a yf p i a )荧 光偏振免疫分析( f p i a ) 是以单一波长的偏振光照射荧光物质后，光被吸收并释 出相应的偏振荧光，荧光偏振的程度与标记结合物量成正比关系而建立的一种荧 光免疫分析技术。f p i a 常用于药物浓度测定，在高浓度药物中，因标记结合物少 出现低偏振值，而在低浓度药物中，因标记结合物多呈高偏振值。 第一章文献综述 2 4 发光免疫分析 发光有物理、化学和生物发光三类发光，后两者与免疫反应相结合得到广泛 应用。狭义的发光免疫分析主要指化学发光免疫分析( c h e r n i l u m i n e s c e n e i m m u n o a s s a y , c l i a ) ，或直接化学发光免疫分析。物理发光有萤火虫荧光素和细菌 荧光素。化学发光氧化化学反应，电子激发后回到基态以光子的形式释放能量， 常用的发光剂为氨基苯二酰肼( 异鲁米诺和鲁米诺) 和吖啶酯类【4 0 】。1 9 7 6 年 s c h r o e d e r 报道异鲁米诺标记生物素进行化学发光测定，发光免疫分析得到迅速 发展，并分别形成了化学发光酶免疫分析、生物发光酶免疫分析和最新发展的电 化学发光免疫分析，探测灵敏度得以迅速提高。 2 4 1 类型 ( 1 ) 化学发光免疫分析，其标记物为单一的化学发光试剂。 ( 2 ) 酶放大化学发光免疫分析，是酶和发光免疫分析相结合，发光时间延长， 信号进一步放大。 ( 3 ) 电化学发光免疫分析，电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明 显增强。 2 4 2 原理 ( 1 ) 化学发光免疫分析( c l i a ) 化学发光免疫分析( c l i a ) 4 1 删是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高 特异性的免疫反应相结合，籍以测定抗原和抗体的分析技术。自上个世纪7 0 年 代中期a r a k a w e 首先报道c l i a ，发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量 活性物质检测技术，应用范围非常广泛常用小分子丫啶酯( a c r i d i n i u m e s t e r , a e ) 标 记抗体，a e 的分子量小( 4 8 1 ) ，有空间阻碍小、增加标记物的扩散、1 秒内完成快 速强发光、非靶物质不产生化学发光和3 7 。c 温育非平衡期反应等特点，明显缩短 检测时间以达到快速诊断的目的。 ( 2 ) 酶放大化学发光免疫分析 酶放大化学发光免疫分析是酶和化学发光的一种结合，以碱性磷酸酶( 甜 ) 第一章文献综述 标记抗体，以d i o x e t a n ep h o s a h a t e ( d p ) 为底物，后者为磷酸苯和金光烷经二氧四节 环相连，在a k p 存在的情况下脱去磷酸根，成为延长发光的发光物，稳定性和灵 敏度得到进一步提高。 ( 3 ) 电化学发光( e c l ) 电化学发光是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，实际上包括了电和 化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展。e c l 的发光剂为三联吡啶钌 f r u ( b p y ) 3 2 + 和三丙胺( t p a ) 4 5 】。在阳电极表面，两种电化学活性物质可同时失去 电子发生氧化反应，即将2 价的r u ( b p y ) 3 2 + 氧化为3 价的r u ( b p y ) 3 3 + ，而t p a 成为 阳离子自由基t p a + 。后者自发失去一个质子( h + ) 形成自由基t p a ，此t p a 作 为强的还原剂，将3 价的r u ( b p y ) 3 3 + 还原成2 价的激发态的r u ( b p y ) 3 2 + ，后者衰减 时发出波长为6 2 0 h m 的光子，回到基态，在阳极上重新形成r u ( b p y ) 3 ”，这一过程 在电极表面周而复始的进行，光信号