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木薯抗性淀粉的酶法制备和机理研究 摘要 随着生活水平的提高，人们越来越关注食品的功能化。抗性淀粉用于 食品加工可提高纤维含量，克服传统膳食纤维的某些缺点，改进食品的性 质。因此，抗性淀粉作为低热、高膳食纤维含量功能食品成分将具有重要 的应用价值。 实验采用木薯淀粉为原料，以普鲁兰酶进行酶解，采用单因素实验法， 以抗性淀粉含量为考察指标，探讨淀粉浓度、淀粉糊化温度、普鲁兰酶作 用时间、作用温度、加入量和储存温度和储存时间对抗性淀粉含量的影响。 在此基础上，确定了正交试验的因素为淀粉浓度、酶解时间、加酶量、酶 解温度和各因素的水平，选用l 9 ( 3 4 ) 正交表来安排实验。实验结果表明：淀 粉浓度对于抗性淀粉含量影响最为显著，其次是普鲁兰酶加入量，再其次 是酶作用时间，影响相对较小的是酶作用温度。最佳反应条件为：淀粉浓 度是2 0 ，普鲁兰酶加入量为4 u g 淀粉，酶作用时间为8 h ，普鲁兰酶作用 温度为5 5 ，此时抗性淀粉含量为1 3 3 6 。 采用脱支和不脱支两种方法来制备抗性淀粉，发现脱支处理有利于抗 性淀粉的形成。普鲁兰酶的处理，使支链淀粉被脱支，分子间移动的阻力 变小，链与链的迁移更加容易，堆积结晶的可能性加大，从而提高抗- 陛淀 i 粉的含量。 通过讨论直链淀粉含量和抗性淀粉含量的关系，得出结论：直链淀粉 含量的增加，有利于抗性淀粉含量的增加。 对抗性淀粉样品进行x 射线衍射分析和扫描电镜分析。结果表明：抗 性淀粉是经重结晶形成的，其颗粒表面结构和原淀粉不同；抗性淀粉含量 增加，其结晶度增加，颗粒排列越紧密。抗性淀粉持水力的测定结果表明： 抗性淀粉的持水力比原淀粉持水力要大，但比其它的膳食纤维的持水力要 小。 关键词：木薯淀粉抗性淀粉酶法直链淀粉回生 i i s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o no fc a s s a v a r e s i s t a n t s t a r c ha n dm e c h a n i s m a b s t r a c t a l o n gw i t ht h el i v i n gs t a n d a r du p t u r n i n g ，p e o p l ep a ym o r ea t t e n t i o nt ot h e f u n c t i o no ff o o d r e s i s t a n ts t a r c hi su s e do nf o o dp r o c e s s i n gt or a i s ef i b e r c o n t e n ta n di m p r o v et h eq u a l i t yo ff o o d ，w h a ti sb e t t e rt h a nt r a d i t i o n a ld i e t a r y f i b e r s t h e r e f o r e ，r e s i s t a n ts t a r c ha sc o m p o s i t i o no ff u n c t i o n a lf o o dc o n t a i n i n g l o wc a l o r i c ，h i g hd i e t a r yf i b e r sw i l lh a v ei m p o r t a n t a p p l i c a t i o nv a l u e w ea d o p ts i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t si no r d e rt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fs t a r c h p a s t e sc o n c e n t r a t i o n ，g e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，p u l l u l a n a s eq u a n t i t y , r e a c t i o n t i m e ，s t o r a g et i m e ，z y m o l y s i st e m p e r a t u r eo nr e s i s t a n ts t a r c hc o n t e n t o nt h i s f o u n d a t i o n ，w ec h o s et h es t a r c hp a s t e sc o n c e n t r a t i o n ，q u a n t i t yo ft h ep u l l u l a n a s e ， t h et i m eo ft h e r e a c t i o n ，z y m o l y s i st e m p e r a t u r e a sf a c t o r so fo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a ts t a r c hp a s t e sc o n c e n t r a t i o nh a s s t r o n gi n f l u e n c eo nt h ec o n t e n to fr s z y m o l y s i st e m p e r a t u r eh a sl i t t l ei n f l u e n c e o nt h ec o n t e n to fr s t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n si ss h o w e da sf o l l o w s ：t h e s t a r c hp a s t e sc o n c e n t r a t i o ni s2 0 ，t h ep u l l u l a n a s eq u a n t i t yi s4 昨s t a r c h ，t h e r e a c t i o nt i m ei s6h o u r s ，t h ez y m o l y s i st e m p e r a t u r ei s6 0 c ，t h ec o n t e n to fr s a m o u n t st o1 3 3 6 t h r o u g hc a r r i e do nt a k e - o f fa n dn o nt a k e o f ft r e a t m e n to ns t a r c h ，w e d i s c o v e rt a k e - o f ft r e a t m e n ti s a d v a n t a g e o u s t ot h ef o r m a t i o no fr s t h e p r o c e s s i n go fz y m o l y s i sb yp u l l u l a n a s em a k e sa m y l o s et a k e no f f , a n dt h e r e s i s t a n c eo f m o v i n gd i m i n i s h e s ，m o v e m e n to fc h a i ni sm o r ee a s i l y , t h a ti sg o o d i t t f o rc r y s t a l l i z a t i o n ，a n da c c e l e r a t er e t u r n i n go fs t a r c h ，i n c r e a s et h ec o n t e n to fr s t h r o u g hd i s c u s s i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na m y l o s ec o n t e n ta n dr e s i s t a n t s t a r c hc o n t e n t ，c o n c l u s i o n si n d i c a t et h a tt h ei n c r e a s eo fa m y l o s ec o n t e n ti s a d v a n t a g e o u sf o ri n c r e a s i n gt h ec o n t e n to f r e s i s t a n ts t a r c h t h ea n a l y s i sr e s u l t so fx r da n ds e mi n d i c a t et h a tr e s i s t a n ts t a r c hi s f o r m a t t e db yr e c r y s t a l l i z e ，a n di t s g r a i ns u r f a c es t r u c t u r ei sd i f f e r e n tw i t h o r i g i n a ls t a r c h t h es a m p l et h a tc o n t a i n sm o r er e s i s t a n ts t a r c h ，c o n t a i n sm o r e c r y s t a l ，a n dg r a i n sa r r a n g em o r ec l o s e t h er e s u l t so fw a t e r - h o l d i n gc a p a c i t y d e t e r m i n a t i o ni n d i c a t e ：t h ew a t e r - h o l d i n gc a p a c i t yo fr e s i s t a n ts t a r c hi sg r e a t e r t h a no r i g i n a ls t a r c h ，b u ts m a l l e rt h a no t h e rd i e t a r yf i b e r s k e yw o r d s ：c a s s a v a s t a r c h ；r e s i s t a n ts t a r c h ；z y m o l y s i s ；a m y l o s e ；r e t u r n i n g 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成 果和相关知识产权属广西大学所有。本人保证不以其它单位为第一署名单位发表 或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的 研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提 供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：韦辛k 互 训7 年莎月i - 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的e i j $ i j 本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时i b j ： 幽口时发布口解密后发白 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：韦歌互导师签名：眯丧冷力衫) 年6 月厂日 末| 抗性淀粉的酶法制j p 和审u 里研究 1 1 淀粉 1 1 1 淀粉的分类 第一章绪论 淀粉在自然界中分靠广泛，是高等植物中常见的组分，也是碳水化合物贮藏的主要 形式。淀粉的品种很多，一般按来源分为： 禾类淀粉：主要来源于玉米、米、大麦、燕麦、高粱和黑麦等，主要存在于种子的 胚乳细胞中。淀粉工业主要以玉米为原料进行加工。 薯类淀粉：薯类是适应性很强的高产作物，在我国以甘薯、马铃薯和木薯为主，主 要来源于块根和块茎。淀粉工业主要以木薯和马铃薯为主。 豆类淀粉：主要来源于蚕豆、绿豆、豌豆等，这类淀粉直链淀粉含量较高。一般用 于制作粉丝的原料。 其它淀粉：植物的果实( 如香蕉、芭蕉、白果等) ，还有豆苗、菠萝等中也含有淀 粉。这些通常不作为淀粉加工的原料。 l 。1 2 淀粉的分子结构 淀粉的分子式是( c 6 h l 0 0 5 ) n ，严格的讲是c 6 h 1 2 0 6 ( c 6 h l 0 0 5 ) n ，n 是聚合度( d p ) ，一 般为8 0 0 3 0 0 0 。 淀粉是由两种不同的聚合物一直链淀粉和支链淀粉组成，直链淀粉分子呈右手螺旋 结构，每六个葡萄糖单元组成螺旋的每一个节距，在螺旋内只含氢原子，是疏水的，羟 基位于螺旋外侧。直链淀粉分子大小随淀粉的来源及提取淀粉时的加工条件而变化，一 般为2 0 0 - 3 0 0 0 个葡萄糖单元。在分子一端的葡萄糖单元上外侧大量的羟基使聚合物有 亲水性，使它具有吸收水分和在水中分散的能力。 支链淀粉是一种分支型聚合物，除了具有和直链淀粉相同的盱d _ - 1 ，4 糖苷键连接 广西大掣骚甄士掌位论文 术l 抗性淀粉的酮 法制鲁和蕾l 理研究 葡萄糖单元之外，还有分支链，这些分支由p d 一一l ，6 糖苷键连接在第六碳原子上，每 个支链约2 0 3 0 个葡萄糖单元。 1 1 3 淀粉的糊化 将淀粉乳加热，则颗粒可逆地吸水膨胀，而后加热至某一温度时( 一般为6 0 8 0 。c ) ， 颗粒突然膨胀，晶体结构消失，最后变成粘稠的糊，虽停止搅拌，也不会很快下沉，这 种现象称为淀粉的糊化。糊化后的淀粉颗粒称为糊化淀粉。糊化的本质是水分子进入淀 粉粒中，结晶相和无定形相的淀粉分子之日j 的氢键断裂，破坏了淀粉分子间的缔合状态， 分散在水中成为亲水性的胶体溶液。 糊化过程可以分为三个阶段： 一是可逆吸水阶段，这时水分子是单纯地进入淀粉粒微晶束的间隙中，与无定形部 分的游离羟基相结合，淀粉粒缓慢吸收少量水分，产生有限的膨胀，悬浮液粘度无显著 变化，淀粉粒外形未变，内部保持原来的晶体结构和双折射性，冷却干燥后，淀粉粒的 形状没有什么变化。 二是不可逆吸水膨胀阶段，进一步加热至糊化温度时，水分子进入淀粉粒内部，与 一部分淀粉分子结合，淀粉粒不可逆地迅速吸收大量水分，颗粒突然膨胀( 至原体积的 6 0 1 0 0 倍) ，由于外界的热使氢键断裂破坏了分子日j 的缔合状态，双螺旋伸直形成分离 状态，破坏淀粉的晶体结构( 双折射性和偏光十字很快消失) 。比较小的直链淀粉从颗 粒中渗出，粘度大为增加，淀粉乳变化为粘稠的糊化液体，透明度增加，冷却后淀粉粒 的外形已变，不能恢复原来的晶体状态。 三是高温阶段，淀粉糊化后，继续加热，则大部分淀粉分子溶于水中，分子| b j 作用 力减弱，淀粉粒全部失去原形，微晶束相应解体，变成碎片，最后只剩下最外面的一个 环层，即不成形的空囊，淀粉糊的粘度继续增加，若温度再升高到1 i o 。c ，则淀粉粒全 部溶解。 因此，在一般情况下，淀粉糊中不仅含有高度膨胀的淀粉粒，而且还有被溶解的直 链淀粉分子和支链淀粉分子以及部分的微晶束。 2 广西大掌硕士掌位论文术薯抗性淀粉的酎 法制- i 和和埋研究 影响糊化的因素主要有：( 1 ) 一般来说，小颗粒淀粉内部结构紧密，糊化温度比大 颗粒高，直链淀粉分子间结合力较强；因此直链淀粉含量高的淀粉比直链淀粉含量低的 淀粉难糊化。( 2 ) 电解质可破坏分子间氢键，因而促进淀粉的糊化，如o h 一、n a + 、k + 等可明显降低糊化温度。( 3 ) 非质子有机溶剂，如二甲基亚砜在低温或室温下可破坏分 子日j 氢键。( 4 ) 脂类一直链淀粉与硬脂酸形成复合物，加热难被破坏。 i i 4 淀粉的回生 淀粉稀溶液或淀粉糊在低温下静置一定的时间，混浊度增加，溶解度减少，在稀溶 液中有沉淀析出，如果冷却速度快，特别是高浓度的淀粉糊，就会变成凝胶体( 凝胶长 时间保持时，即出现回生) ，这种现象称为淀粉的回生。回生本质是无序的糊化淀粉分 子在温度降低时由于分子运动减慢，此时直链淀粉分子和支链淀粉分予的分支部回头趋 向平行排列，互相靠拢，彼此以氢键结合，重新组成混合微晶束，使淀粉糊具有硬的整 体结构。其结构与原来的生淀粉粒的结构相似，但不成放射状。 回生后的直链淀粉非常稳定，加热加压也难溶解，如有支链淀粉分子混存，仍有加 热成糊的可能。当淀粉凝胶被冷冻和融化时，淀粉凝胶的回生是非常大的，冷冻与融化 淀粉凝胶，破坏了它的海绵状的性质。 影响回生的因素：( 1 ) 分子组分( 直链淀粉的含量) ，直链淀粉的链状结构在溶液 中空i 日j 障碍小，易于取向，故易于回生；支链淀粉呈树状结构，在溶液中空间障碍大， 不易于取向，故难于回生。( 2 ) 分子的大小，直链淀粉若链太长，取向困难，也不易回 生；相反，若链太短，易于扩散( 不易聚集，饰朗运动阻止分子的相互吸收) ，不易定 向排列，也不易回生( 溶解度大) ，所以只有中等长度的直链淀粉才易回生。( 3 ) 淀粉 溶液的浓度一水分，淀粉溶液浓度大，分子碰撞机会高，易于回生；浓度小则相反。一 般水分3 0 6 0 的淀粉易于回生，水分小于1 0 的干燥状态则难于回生。( 4 ) 温度， 接近0 4 c 时贮存可加速淀粉回生。( 5 ) 冷却速度，缓慢冷却，可使淀粉分子有充分时 间取向平行排列，因而有利于回生。迅速冷却，可减少回生( 如速冻) 。( 6 ) p h ，p h 值 中性易于回生，在更高或更低的p h 值，不易回生。 广西大掌硕士掌位论文术l 抗性淀粉的酶法制鲁和书悝研究 1 2 抗性淀粉 1 2 1 抗性淀粉的定义与分类 随着食品营养学的发展，7 0 年代以来人们丌始认识到植物食品中的纤维对于肠道有 很好的保健作用，能预防若干种疾病，大大有益于身体健康。于是把膳食纤维作为一类 营养素，与碳水化合物、脂肪、蛋白质等并列。膳食纤维是指植物食品中不能被消化的 物质。人们一直认为：食品中的淀粉在人的小肠被完全水解吸收，该假设的基础是：人 体胰脏分泌的淀粉酶超过淀粉完全水解所需的量。但近二十几年发现有少部分淀粉受某 种因素或加工过程的影响，其结构发生变化，在小肠中产生抗消化现象1 2 】 即在人体肠 胃中仍不被淀粉酶水解。抗性淀粉属于多糖类，其功能视同膳食纤维。这引起了世界各 国的广泛关注。英固生理学家e n g l y s t l 3 1 将其定义为抗性淀粉( r e s i s t a l l ts t a r c h ，简称r s ) 。 1 9 9 3 年，e u r e s t a ( e u r o p e a nf l a i r c o n c e r t e d a c t i o no nr e s i s t a n ts t a r c h ) 将抗性淀粉定 义为；不被健康人体小肠所吸收的淀粉及其降解物的总称【4 1 。 抗性淀粉因其天然来源或加工方法不同，含量会有很大的差别( 见表1 1 ) 。1 9 9 2 年e n g l y s t 等人根据其抗消化性的不同进一步将其分为四类：r s l 、r s 2 、r s 3 、r s 4 【5 1 。 r s - 指的是由于物理屏蔽作用，被锁定在植物细胞壁上使其不能为淀粉酶所作用的 部分。它主要存在于粗磨或粗碾过的谷物、豆科类的种子中。这类r s 易受咀嚼或加工 方式影响。 表i - 1 抗性淀粉含量与其来源嘲 t a b l e1 - 1t h ec o n t e n ta n ds o l l r c e so f r e s i s t a n ts t a r c h 抗性淀粉含鼙举例 很低( 兰l ) 低( 1 一2 5 ) 中( 2 5 一5 ) 高( 5 1 5 ) 很高伫1 5 ) 煮熟十豆( 热) 、蒸透米饭( 热) 、淀粉糊( 热) 饼干、面包、煮熟十豆( 冷) 、冷米饭 玉米片、炸士豆、 煮过豆类、生玉米、高乐锅煮后冷却淀粉 生十豆、链下米淀粉、凝沉链淀粉 4 广西大掌硕士掌位论文术| 抗佳淀粉的翻 法制鲁和审u 重研究 r s 2 包括植物淀粉中自然固有的抗酶解的淀粉颗粒和不能完全糊化的淀粉颗粒。它 常存在于生的或未被加工过的马铃薯、绿香蕉和高直链淀粉中。r s l 和r s 2 这两类抗性 淀粉经过适当加工之后仍可以被淀粉酶降解【 。 r s 3 主要由糊化淀粉经冷却回生后形成，常存在于冷米饭、冷面包、油炸土豆片中。 这类抗性淀粉是由于淀粉分子在凝沉过程中分子重聚集成有序的结晶结构的缘故坤1 。由 于结晶区的出现阻止淀粉酶靠近结晶区域的葡萄糖苷键，并阻止淀粉酶活性基团中的结 合部位与淀粉分子结合，因而就不能完全被淀粉酶作用，从而产生抗酶解性。这类抗性 淀粉包括r s 3 a 和r s 3 b 两种。其中r s 3 a 为凝沉的支链淀粉，r s 3 b 为凝沉的直链淀粉。 r s 3 b 的抗酶解性最强，而r s 3 a 经过再加热可被淀粉酶降解。r s 3 是最重要也是最主要 的抗酶解淀粉。 r s 4 指淀粉经过物理或化学变性后，由于淀粉分子结构的改变以及一些化学官能团 的引入而产生的抗性淀粉片段，如乙酰基、羟丙基淀粉和热变性淀粉中的抗性淀粉片段。 1 2 2 抗性淀粉抗性淀粉测定和评价 r s 的测定有体内测定和体外测定。 体内测定法一是检测回肠中不消化淀粉的含量。从回肠中取样可通过插管法或回肠 造口术获得；二是通过检测呼吸h 2 ，这是一种半定量法。插管法是直接应用在健康人 体的一种方法，但在回肠的管子影响肠胃功能，减缓胃排空，缩短r s 在小肠的通过时 间，导致高估食物中的r s 含量。c a i r n s l 9 1 通过对六位回肠造口术志愿者的研究发现回肠 造口术法和体外法获得的分析结果相似。 r s 体外测定法分为直接法和日j 接法f 1 0 】。1 9 8 6 年b e r r y i 1 1 提出了直接法，即将可消 化淀粉除去，测定剩下的淀粉。1 9 9 2 年e n g l y s t l 5 1 提出了间接法，即分别测出总淀粉和 可消化淀粉，两者的差就是r s 的量。但间接法的测定结果不够准确，尤其是对于低含 量抗性淀粉的测定，主要是由于两次测定结果的误差进行累积。因此r s 的含量测定大 都采用直接法，常用的方法主要有a a c c 7 6 - - 1 3 标准法，g o n i 法，a o a c ( 2 0 0 2 0 2 ) 法。 a a c c 7 6 - 1 3 标准方法经过美国谷物化学协会认定，其主要步骤是：先加入耐热口- 广西大掌硕士掌位论文术| 抗性淀粉的酶号圣涮j p 和和u 匣研究 淀粉酶分解大分子淀粉，用葡萄糖淀粉酶水解易酶解淀粉，离心后用氢氧化钾或二甲基 亚砜将抗性淀粉全部溶解，用耐热p 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶将其水解为葡萄糖，最后测 定葡萄糖含量，再换算为r s 含量。 g o n i i 拉1 法足在b e r r y 法的基础上改进而来。主要步骤是：用胃蛋白酶除去蛋白质， 用胰铲淀粉酶水解可消化淀粉，经分离后，在残渣中加入氢氧化钾将淀粉溶解，再用葡 萄糖淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，测定葡萄糖含量，再换算为r s 含量。此法模拟了体 内消化条件，排除了蛋白质的影响，且具有较好的重现性，该法测定值可作为r s 含量 标示于食品标签上。 a o a c ( 2 0 0 2 0 2 ) 法考虑了胰淀粉酶的浓度、静置液体p h 、振荡和搅拌对r s 测定 结果的影响。此法的主要步骤为：在样品中加入马来酸钠缓冲液( p h = 6 ) 、胰淀粉酶和 葡萄糖淀粉酶，在3 7 下振荡1 6 h 。再用5 0 的酒精冲洗，离心，重复2 次。在残渣中 加入氢氧化钾将淀粉溶解，冰浴并搅拌2 0 m i n ，加入醋酸钠缓冲液( p h = 3 8 ) ，再加入 葡萄糖淀粉酶，在5 0 水浴中保温3 0 m i n ，取0 1 m l 样品加入g o p o d 试剂( 即含有葡 萄糖氧化酶过氧化物酶和4 氨基安替比林的试剂) ，在5 0 。c 水浴中保温2 0 m i n ，在5 1 0 n m 下测样品和葡萄糖标准( 1 m g o 1 m 1 ) 的吸光度，以空白对照为零，再将其换算为抗性 淀粉含量。a o a c ( 2 0 0 2 0 2 ) 法获得的测定结果和已发表的体内法结果一致。它适用于 2 - 6 4 含量r s 的测定，但不适用于测定r s 含量小于1 的产品【1 3 i 。 1 2 3 抗性淀粉生理功能与应用 ( 1 ) 生理功能 膳食纤维对人体健康的贡献，主要是在肠道发酵生成的短链脂肪酸1 1 4 】，而抗性淀粉 也不被小肠吸收，能原封不动地进入大肠，部分为肠内菌发酵利用而产生短链脂肪酸如 丁酸等，较同等量膳食纤维产生的丁酸还要多，见表l 一2 。抗性淀粉可控制血糖、调整 血脂【1 5 】、增加肠道的有益菌、稀释致癌物质、增加排泄物、促进矿物质的吸收【1 6 1 ，在预 防糖尿病、心脑血管疾病和结肠癌等方面有较好的作用1 1 7 】。 6 广西大掌硕士掌位论文术量 抗性淀粉的酎 法制鲁和审u 匣研究 表1 之抗性淀粉，淀粉和膳食纤维产酸百分率对照表 t a b l e1 - 2t h ea c i dp e r c e n to f r e s i s t a n ts t a r c h s t a r c ha n dd i e t a r yf i b e r a ) 控制血糖 在生物功能上r s 是无能量的旧j ，r s 的摄入可延缓糖分的吸收，抑制正餐后的血 糖上升，降低胰岛素的分泌，并可改善糖尿病人的新陈代谢，对糖尿病有一定的预防作 用【2 02 ”。王竹【2 2 1 等研究发现：食用r s 后，r s 吸收缓慢，血糖和1 3 c 一血糖水平明显低 于食用葡萄糖和可消化淀粉：机体分泌较少的胰岛素即可维持j 下常血糖，可能具有增强 胰岛素敏感性的作用。 丁玉琴2 3 1 等将w i s t a r 大鼠随机分为糖尿病对照组、抗性淀粉组和普通淀粉组，观察 抗性淀粉对2 型糖尿病大鼠血糖的影响。结果显示：抗性淀粉组大鼠血糖 ( 1 7 1 士3 4 ) m m o l l 】明显低于高消化淀粉组【( 2 1 4 士3 1 ) m m o l l 和糖尿病对照组【( 2 1 9 士3 0 ) m m o l l ，表明抗性淀粉能降低2 型糖尿病大鼠血糖，具有减轻糖尿病症状的作用。大 量研究表明，西方人的膳食纤维摄入量较少，因此糖尿病的发病率较高。 b ) 降低血清中胆固醇和三酸甘油酯水平 w o o l 2 4 l 等人分别用含玉米抗性淀粉和大米抗性淀粉的饮食喂养小鼠，发现两者均能 降低血清中的脂质和胆固醇浓度，这是因为r s 能吸附胆酸、胆周醇等，抑制总胆固醇 浓度升高，降低胆酸和胆固醇在肠道中的吸收，并促进胆酸和胆固醇的排泄。d e c k e r e l 2 5 j 等人也发现抗性淀粉有降低血清中胆同醇和三酸甘油酯的作用。 广西大掌硕士掌位论文木l 抗性淀粉的荫i 法制鲁和机理研究 c ) 保护肠道 抗性淀粉经发酵生成短链脂肪酸( s c f a ) 一主要为乙酸、丙酸、丁酸，可降低肠 道的p h 值，促进有益菌的生长，抑制有害菌的增殖，从而降低结肠癌发率27 1 。何梅 等探索抗性淀粉( r s ) 及其不同类型的摄入对大鼠肠道常见菌群的影响，发现r s 2 和r s 3 均可明显增加大鼠粪便中双歧杆菌菌落数，显著减少肠球菌落数：盲肠内容物的 s c f a 随r s 2 摄入量增加而增加；r s 可降低大鼠盲肠内容物和粪便的p h 值，降低效果 随r s 摄入量增加而加大，且r s 3 降低效果优于r s 2 。 d ) 预防结肠癌 r s 具有较好的膨胀性，吸水后使肠道中的食物膨胀变软，能促进肠道蠕动，缩短 排泄物在肠道的停留时间。食用r s 后，可明显增加排泄物重量，稀释致癌物质的浓度， 减少致癌物质对肠壁的刺激，从而降低结肠癌发病率2 们。排泄物的增加主要是由于：一 是排泄物中较高的脂质直接影响排泄物的物质重量；二是发酵产生的短链脂肪酸，可能 被排泄物中的微生物利用，微生物的增殖增加排泄物的重量。 e 1 其他 抗性淀粉在回肠中经肠内微生物发酵产生短链脂肪酸而降低肠道的p h ，促进矿物 元素钙、镁等的溶解，增加可溶性钙镁的浓度，从而可促进c a 、m g 在回肠内的吸收。 r s 还有助于减肥。一方面由于r s 具有很强的吸水膨胀性，在肠胃内吸水以后，使 肠胃扩张，产生饱腹感，减少进食量；另一方面，r s 含热量极低，且在肠胃内限制了 部分糖和脂质的吸收，促使体内脂肪的消耗。此外，丁酸可促进胃运动，有助于加速排 空，减少胃胀。 ( 2 ) 抗性淀粉的应用 随着人们生活水平不断提高，“文明病”( 糖尿病、心血管病、肥胖、肠道痛、便秘等) 越来越普遍，加之人口老龄化严重，人们对食品要求不再停留在口感和感官上，而是更 加讲究功能性。抗性淀粉安全无毒，具有良好的生理功能和特殊的物理性质p m 。它可以 提高人们日常饮食的营养价值，且不会掩盖住食品美味和香味，可广泛应用于食品、保 健品中，让人们在j 下常饮食中提高抗性淀粉的摄入量，更好的预防糖尿病、肥胖症、结 肠癌和心脑血管疾病。 r 广西大学硕士掌位论文术摹f 抗性淀粉的酶法制鲁和和u 堑研究 抗性淀粉色白3 ”、颗粒细、风味淡、持水力较低、成膜性好。当它作为食品配料时， 不会影响食品的口感，不会改变食物风味及组织，且不影响其抗消化性。因此，抗性淀 粉可作为食品的膳食纤维功能成分，广泛应用于碳水化合物食品饮料中。 r s 颗粒度小，将它作为面包的配料，可以和其他配料充分混合，不会改变面包的 感官特性，可以提高面包的冷冻和烘烤稳定性1 3 2 l 。 抗性淀粉为水不溶性物质，且具有较好的黏度稳定性、很好的流变特性，将它添加 到饮料中可用来增加饮料的不透明度及悬浮度，不会产生沙砾感，也不掩盖饮料风味。 此外，r s 可增加食品的酥脆性，提高挤压谷物和小吃食品的膨化系数；办可将它 添加于乳品中作为益生元，促进益生菌的生长，提高乳品的营养价值。 据营养学家估计，人体每天应补充抗保健品的生产性淀粉3 2 9 4 9 3 克，平均每天 4 1 l 克。除同常食品外，食用含抗性淀粉的保健品也是一个有效方法。 1 3 国内外研究现状及水平 研究发现抗性淀粉跟膳食纤维一样不被小肠吸收1 3 4 l ，能原封不动地进入大肠，可以 在大肠中被微生物菌丛发酵或部分发酵1 35 1 。发酵产生的短链脂肪酸足肠道上皮的特殊营 养因子陬3 7 3 引，可维护肠道上皮细胞的完整性，并对粘膜免疫细胞有维护作用，且可 维持肠道酸性环境，促进毒素的分解与排出。抗性淀粉由于潜在的生理功能，已经引起 生理学家和营养学家的广泛关注1 3 。国内外对其展丌了大量研究，认为抗性淀粉在控制 血糖、调整血脂、增加排泄物、促进矿物质的吸收，在预防糖尿病、心心脑血管疾病和 结肠癌等方面有较好的作用，具有广阔的应用前景。 由于r s l 和r s 2 在加热或加工过程中会损失大部分，国内外研究人员感兴趣的是 r s 3 ，其抗性最强，可将其添加到食品中，以提高食品功能性。对抗性淀粉的分类，制 备及其影响因素已有了一些认识。酶工程和精细化工的发展也推动了抗性淀粉研究热 潮。国内对于抗性淀粉生理功能的研究较少，r s 是否影响其它营养在小肠中的吸收， 过量摄入是否产生副作用有待进一步研究。抗性淀粉的制备已经从传统的酸解法、挤压 法、压热法转向酶法。酶法制备主要用耐热淀粉酶和普鲁兰酶。蹇华丽4 0 1 以玉米淀 9 g - 西大掌硕士掌位论文术| 抗性淀粉的酶法制鲁和机理研究 粉为原料，在糊化时加入一定量的耐热p 淀粉酶处理后再进行脱支处理，在较优条件下， 抗性淀粉含量可高达1 9 0 2 ，高于用其他方法制备的结果。 现在，国外己有抗性淀粉的生产，如国民淀粉公司用冷热处理高直链玉米淀粉研制 出了r s 含量4 7 6 0 的颗粒状产品，如n o v e l o s e 2 4 0 和2 6 0 等系列产品，也是全球首 个商用天然抗性淀粉，它是澳大利亚农业研究、专业制造技术与食品技术的成果。抗性 淀粉已被用于提高消化系统功能、控制血糖、排毒养颜、润肠通便、分解脂肪方面保健 品的生产。美国路易斯安那州南部研究中心( s r r c ) 已经发明了一种以大米为基质的抗性 淀粉产品。抗性淀粉在消化道中不被消化，适合于肥胖和糖尿病患者。但r s 还没有形 成大规模工业生产，需对抗性淀粉的工业化开发作更多的研究，以加快其工业化进程。 1 4 研究意义与研究内容 1 4 i 研究意义 随着生活水平的提高，人们越来越关注食品的功能化。世界各国都规定了每同膳食 纤维推荐摄入量。由于膳食纤维本身的缺点，添加到食品中时会引起口感、风味、品质 等的变化。而抗性淀粉是无异味的白色粉末，持水性低，不像一般纤维会吸收大量水分， 当它作为食品原配料添加到低水分含量产品如脆饼、曲奇等时，不会影响其口感，也不 会改变食品风味及组织。用于食品加工可提高纤维含量，克服传统膳食纤维的某些缺点， 改进食品的品质。因此，抗性淀粉可作为食品的膳食纤维添加到烘烤食品、低热、低脂 人造奶油、冷冻甜点等或作为一种单独的添加剂加入食品配方中，抗性淀粉作为低热、 高膳食纤维含量功能食品成分将具有重要的工业应用价值。 酶法制备抗性淀粉具有较多优点：不需要高温、高压的水解条件，可以节约能源， 操作方便，产品的纯度高4 1 4 2 1 。用酶法制备抗性淀粉远远优于传统的酸解法、挤压法、 压热法、微波处理法、湿热处理法、浸泡法。酸解法操作简单、生产周期短l ”1 、设备投 资少；但酸法工艺在水解程度上不易控制，酸对设备腐蚀比较严重，反应中生成副产物 g l 多t 4 4 1 。压热法对反应条件要求较高。其它方法制备抗性淀粉含量较低。实验中采用的 切枝酶为普鲁兰酶，可切断淀粉链中的铲l ，6 糖苷键【4 5 l ，从而使淀粉分解为直链淀粉， 1 0 广西大掌司e 士掌位论文木j f 抗性淀粉的青法制j 和私u 嘎研究 有利于抗性淀粉的形成。 近几年，国内对采用玉米、马铃薯淀粉制备的抗性淀粉进行初步研究，但对采用木 薯淀粉制备抗性淀粉方面研究在国内尚未见报道，特别是通过酶处理对淀粉中直链淀粉 含量的影响来探讨制备抗性淀粉的形成机理的研究甚少。 采用木薯淀粉为原料，酶法制各抗性淀粉的工艺研究和作用机理研究可望为以后的 工业生产的放大实验提供依据，具有极其重要的学术价值，有利于加快其工业化进程， 既可扩大淀粉的应用领域，也可增加功能性食品的种类和应用。 1 4 2 研究内容 本课题以木薯淀粉为原料，确定合理的抗性淀粉测定评价方法，研究用酶法( 普鲁 兰酶) 制备抗性淀粉的作用机理，找出各种因素对抗性解淀粉含量的影响规律，进行正 交试验，从而优选出合适的工艺条件，并进行抗性淀粉的结构和理化分析，以及和原淀 粉的比较。 1 4 3 研究途径 初步确定抗性淀粉测定方法，通过研究其中影响因素的影响，以确定合理的抗性淀 粉测定方法。通过单因素实验，找出各因素对产品制备的影响。通过j 下交实验，确定产 品最佳工艺条件。通过检测酶作用后，直链淀粉含量的变化，及其结晶程度对制各的影 响等方面来研究酶法制备抗性淀粉的作用机理。通过进行x 射线衍射、扫描电镜、持水 力分析，了解抗性淀粉的理化性质。 广西大掌硕士掌位论文术鼍 抗性淀粉的酮法制鲁和和嚏研究 2 1 实验原理 第二章抗性淀粉的制备 采用酶法制备抗性淀粉的主要原理如下：首先将淀粉糊化，淀粉颗粒在糊化过中， 分子结晶区大部分氢键断裂，原有的结构受到破坏，导致淀粉双螺旋结构的展开和解离， 此时淀粉糊容易接受酶的作用，经调节温度和p h 值，加入普鲁兰酶。普鲁兰酶作用于 a - 1 ，6 葡萄糖苷键，使淀粉分解出直链分子。将处理过的淀粉糊静置并于低温下凝沉， 形成晶体结构，即形成抗性淀粉。 抗性淀粉的测定原理：先用耐热弘淀粉酶和糖化酶将样品中的易酶解淀粉全部降解 除去，再用氢氧化钾溶解余下的残渣，抗性淀粉经氢氧化钾溶解后，又能重新被耐热铲 淀粉酶和糖化酶降解为葡萄糖，然后用酶分析法进行测定葡萄糖，就可计算出样品中抗 酶解淀粉的含量。 葡萄糖测定采用分光光度法。试剂为：葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和4 - 氨基安替比 林。葡萄糖在葡萄糖氧化酶( g o d ) 作用下，生成葡萄糖酸及过氧化氢。受过氧化物酶( p o d ) 催化，过氧化氢与扯氨基安替比林和苯酚生成稳定的红色络合物醌亚胺i 删。醌亚胺在 5 1 0 h m 波长处有最大吸收，所产生颜色的深浅和被测葡萄糖的量成正比。 c 矗。2 0 64 - 0 2 坠! 兰jc 口l p 6 + h _ ( ) 2 h p 2 + c 口i o h + c ? t h i 潮3 0 墨坚c 洱制o + h 2 0 2 2 材料与仪器 2 2 1 试验原料及试剂 1 2 广西大掌硕士掌位论文术| - 抗性淀粉的酶法制备和审嚏研究 袁2 _ l 原料与试剂 t a b l e2 - im a t e r i a la n dr e a g e n t 3 广西大掌硕士掌位论丈木| 抗性淀粉的i 法制鲁和和嚏研究 2 2 ，2 试验仪器设备 表2 2 仪器与设备 t a b l e2 2i n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t 2 3 试验方法 2 3 1 抗性淀粉的制备 称取一定量木薯原淀粉，放入2 5 0 r a l 三口烧瓶中，加入一定数量的去离子水，在 沸水中水浴一定的时日j ，使淀粉充分糊化，降温，调节p h ，加入普鲁兰酶作用一定时 问后，自然冷却至室温，放入冰箱中冷藏一段时日】，取出后于室温下放置5 h ，然后在 6 0 。c 烘干，粉碎，过8 0 目筛，得到成品。 1 4 g - 西大学硕士掌位论文 术t l - 抗性漶粉的酶法制- i l l - 二l , t , 私u 墼研究 2 3 2 单因素试验方案 为探索淀粉浓度、糊化温度、普鲁兰酶用量、普鲁兰酶作用时i 日j 、储存温度、储存 时目j 、酶解温度对抗性淀粉形成的影响舰律，进行单因素实验。通过改变某个因素的水 平，固定其它因素水平来考察特定因素对抗性淀粉形成的影响规律。 2 3 3 抗性淀粉含量的测定步骤 ( 1 ) 称取1 0 0 m g ( ：b 5 m g ) 样品于1 5 m l 离心试管，加1 0 m lk c i h c i 溶液( p h 为1 5 ) ， 加o 2 m l 胃蛋白酶溶液( 坦胃蛋白酶1 0 m l k c l h c i 溶液) ，3 8 。c 恒温6 0 m i n ，保持不断 震荡，以除去样品中的蛋白质； ( 2 ) 取出，自然冷却至室温，调节p h 至6 o - 6 4 ，加入3 0 0 u 的耐热弘淀粉酶，置于 9 5 c 恒温振荡器中振荡3 0 m i n ( 振荡转速为2 0 0 r m i n ) ，水解其中的可消化淀粉，离心 ( 3 0 0 0 r r a i n ，1 睢1 5 m i n ) ： ( 3 ) 冷却至室温，用醋酸钠缓冲液调p h 值至4 5 ，再加入5 0 0 0 活力单位的糖化酶( 6 0 * ( 2 水浴振荡6 0 m i n ) ，完全水解其中的可消化淀粉为葡萄糖； ( 4 ) 冷却、离- t = l , ( 3 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，小心弃去上清液，水洗，重复3 次，洗去其中 的葡萄糖； ( 5 ) 加入2 m l k o h 溶液( 4 m o l l ) ，水浴加热、振荡使沉淀中的抗性淀粉充分溶解； ( 6 ) 力1 1 a h c i 中和k o h ，调节p h 至4 5 ，j j 日a 5 0 0 0 活力单位糖化酶，6 0 * ( 2 恒温水 浴3 0 m i n ，保持不断震荡，水解溶解出的淀粉为葡萄糖； ( 7 ) 冷却，离一t j , ( 3 0 0 0r m i n ，1 5 m i n ) ，收集上清液，水洗，重复3 次，合并上清液， 加去离子水定容至1 0 0 m l ； ( 8 ) 取离心上清液l m l 于比色管中，往每支管中加入3 m l 的酶盼混合试剂，然后在 5 0 c 水浴中保温显色2 0 m i n ； ( 9 ) 以试剂空白为0 ，在5 1 0 n m 处用分光光度计测定样品的吸光度，并从葡萄糖标准 曲线上找出对应的葡萄糖浓度。 抗性淀粉含量的计算： 广西大掌司e 士掌位论文 木| 抗性淀粉的酶法制备和书u 量研究 r s ：丝旦1 0 0 1 0 0 ( 2 一1 ) 1 8 0 其中：c 一从葡萄糖标准曲线上找出对应的葡萄糖浓度 职一淀粉样品的质量 1 0 从1 0 0 m l 葡萄糖溶液中取l m l 1 6 2 1 8 0 一葡萄糖与脱水葡萄糖基之| h j 的换算系数 2 3 4 葡萄糖标准曲线的绘制 ( 1 ) 实验试剂的配制 a 、o 1 m o l f l 磷酸盐缓冲液( p h 7 0 ) 称取无水磷酸氢二钠8 6 7 9 及无水磷酸二氢钾5 3 9 溶 于蒸馏水8 0 0 m l q b ，用1 m o l l 氢氧化钠( 或i m o i l 盐酸) 调p h 至7 o ，用去离子水定容 至1 l 。 b 、酶试剂称取过氧化物酶1 2 0 0 u ，葡萄糖氧化酶1 2 0 0 u ，4 - 氨基安替比林1 0 m g ，叠 氮钠1 0 0 m g ，溶于磷酸盐缓冲液8 0 m l 中，用i m o l ln a o h i g p h 至7 0 ，用磷酸盐缓冲 液定容至1 0 0 m l 。置4 。c 保存，可稳定3 个月。 c 、酚溶液称取苯酚1 0 0 m g 溶于蒸馏水1 0