（发酵工程专业论文）牛乳铁素的制备分离纯化及其抗菌活性的研究.pdf

摘要牛乳铁素是牛乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用n 端释放的一段由2 5 个氨基酸组成的多肽，具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、调控基因表达、调节免疫等功能。牛乳铁素作为抗菌肽应用于食品、保健品、医药等行业，具有广阔的应用和开发前景。本研究采用离子交换方法，结合离心、超滤以及冷冻干燥等工艺实现了高纯度牛乳铁素的制备。在测定牛乳铁素最小抑菌浓度的基础上研究了几种常用食品添加剂对其抗菌活性的影响。另外还初步进行了牛乳铁蛋白抗炎性能的研究。实验结果表明：酶解牛乳铁蛋白制备乳铁素的最佳酶解条件为：底物浓度为5 ( w v ) ，酶与底物浓度比为i ：3 0 ( w w ) ，酶解时间为6 0 m i n 。选用截留分子量为1 0 0 0 0 d a 和6 0 0 0 d a 的超滤膜进行超滤后，用b u t y 卜t o y o p e a r l6 5 0 m 型阳离子交换树脂吸附，p h = 5 0 的柠檬酸一磷酸缓冲液洗脱，l o m m 盐酸作为洗脱剂可以得到纯度为9 5 6 的牛乳铁素( 还可分别得到纯度为4 0 6 、8 0 5 的l f c i n b ) 。牛乳铁素对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1 5 儿g m l ，测定了四种合成甜味剂，四种天然甜味剂，四种防腐剂对牛乳铁素抗菌活性的影响。关键词：牛乳铁蛋白；牛乳铁素：分离纯化；抗菌活性；抗炎l a c t o f e r r i c i nb o v i n ei sp r o d u c e db yp e p s i nd i g e s t i o no fn t e r m i n a lr e g i o no fb o v i n el a c t o f e r r i ni na c i d i cc o n d i t i o n i ti sap e p t i d e ss e c t i o nc o m p o s e do f2 5a m i n oa c i da n dh a st h ef u n c t i o n so fa n t i b a c t e r i a l ，a n t i - v i r u s ，r e s t r a i n i n gt h eg r o w t ho ft u r n o u tc e l l s ，a d j u s t i n gt h ee x p r e s so f g c n ea n di m m u n i t y a sa l la n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ，l a c t o f e r r i c i nbc a r lb ea p p l i e di nf o o d s ，h e a l t hf o o d s ，m e d i c i n e ，a n ds oo n ，w i t ht h ew i d ep r o s p e c t so fa p p l i c a t i o na n de x p l o i t u r e i nt h i sp a p e r , h i g hp u r i t yl a c t o f e r r i c i nbw a sp r o d u c e db yi r o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw i t i lt h et e c h n i c so fc a n t r i f u g a t i o n ，u l t r a f i l t r a t i o na n df r e e z e - d r y i n g b a s e do nm e n s u r a t i n gt h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no fl a c t o f e r r i c i nb ，t h ep a p e rs t u d i e dt h ee f f e c t so fs e v e r a lf o o da d d i t i v e so ni t sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s i na d d i t i o n , t h ep a p e rg a v ea ne l e m e n t a r ys t u d yo rt h ea n t i p h l o g i s t i ca b i l i t yo fb o v i n el a c t o f e r r i n t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u me n z y m eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gl a c t o f e r r i c i nbb yp e p s i nd i g e s t i o no fb o v i n el a c t o f e r r i nw c 陀s u b s t r a t e5 ( w v ) ，e n z y m e ：s u h s t r a t er a t i o 【e s 1 ：3 0 ( w w ) a n dt i m e6 0m i n u t e s i tw a sf o u n dt h a tt h ep u r i t yo fl a c t o f e r r i c i nbo f9 5 c o u l db ep r o d u c e dw i t ht h eo p e r a t i o n s ：f i r s t ，u l t r a f i l t r a t i n gt h ec r u d ei s o l a t i o ns o l u t i o nw i t hu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n eo fm w c 0 1 0 0 0 0 d aa n d6 0 0 0 d a ；s e c o n d ，a d s o r b i n gt h el a c t o f e r r i c i nbw i t hc a t i o n e x c h a n g em e d i u mb u t y l - t o y o p e a r l6 5 0 m ；a n dt h e nr i n s i n gt h em e d i u mw i t hp h 5 0b u f f e ro fc i t r i ca i c i d -p h o s p h o r i ca c i d ；t h el a s t ，d e s o r b i n gt h ei a c t o f e r r i c i nbw i t h10 m mh c l ( 1 a c t o f e r r i c i nbo fp u r i t y4 0 6 a n d8 0 5 c o u l da l s ob ep r o d u c e d1 t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no fl a c t o f e r r i c i nba g a i n s te c o l iw a s1 5 1 a g m l t h ee f f e c t so f f o u rk i n d so f c o m p o s i t es w e e t e n e r s ,f o u rk i n d so f c r u d es w e e t e n e r sa n df o u ra n t i s e p t i co nt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so f i a c t o f e r r i c i nba l b em e n s u r a t e d k e yw o r d s ：b o v i n el a c t o f e r r i n ；l a c t o f e r r i c i n ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；a n t i p h l o g i s t i ca b i l i t y第一章前言第一章前言1 1 课题的研究背景1 1 1 乳铁素( l a c t o f e r r i c i n ) 的发现乳是营养丰富、各成分配比合理、生理功能比较全面的理想食品，是新生哺乳动物的主要食物来源，也是成年人饮食的一个重要组成部分。天然牛初乳富含蛋白质，头乳蛋白质浓度可以达到常乳的4 5 倍，脂肪和糖含量较低，铁含量为普通乳汁的1 0 - 1 7 倍，维生素a 和维生素d 分别为成熟乳汁的3 倍和l o 倍；初乳具有独特生理功能，初乳的蛋白质大多数为免疫球蛋白，它能够形成抗体，与病原微生物及毒素等抗原结合，在哺乳动物新生幼仔滋生免疫系统发育成熟、正常运作之前，可以保护其免受病原侵袭l i i 。而且初乳中含有大量的纤维连结蛋白和许多功能性组份，如免疫球蛋i 刍( i m m u n o g l o b u l i n ) 、乳铁蛋白( l a e t o f e r r i n ) 、乳过氧化物酶( l a c t o p e r o x i d a s e ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 、胰岛素样生长因子( i n s u l i n - l i k e g r 0 hf a c t o r ) 、转化生长因子( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ) 、富含脯氨酸多肽( p r o l i n e r i c hp o l y p e p t i d e ) 和表皮生长因子( e p i d e m a lg r o w t hf a c t o r ) 等。它们对婴儿生长发育，增强免疫，预防疾病具有无可替代的作用。其中的牛乳铁蛋白( l a e t o f e r r i n ，l f ) 是一种相对分子质量约为8 0 0 0 0 d a 的铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，如乳汁、眼泪、唾液等。乳汁，尤其是初乳中l f 的含量很高，如牛初乳中的l f 质量浓度约为i g l 。l f 具有许多独特的生物学功能：增强铁的传递和吸收；广谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用：促进肠道茵群的平衡：作为生长因子；抗炎症；抗病毒：抗癌症作用等【2 】。乳铁素( l a c t o f e r r i c i n ，简写为l f c i n ) 是乳铁蛋自在酸性环境下经胃蛋白酶作用n端释放的一段多肽【3 ，4 1 ，经过研究发现，l f c i n 与乳铁蛋白的功能密切相关，除了不能结合铁离子之外，l f c i n 具备乳铁蛋白的所有生物学活性。l f e i n 不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，而且同其他抗菌肽一样具有广谱杀菌活力，此外可能还有抑制病毒和真菌增殖、抑杀肿瘤细胞等多种生物学功能。而对真核细胞几乎没有毒性【5 】。目前，在众多的抗菌肽中，牛乳铁素是独一无二的，因为它除了具有抗菌能力以外，还具有强大的生物学功能及安全性等优点，显示了其替代抗生素的巨大潜能，因此，吸引了国l第一章前言内外众多学者对牛乳铁素的研究。乳铁素的发现是一个渐进的过程。最初h o r o a k i1 6 肄在研究酸性条件下l f 的热稳定性时发现，经热处理后l f 发生明显地被降解，但抑菌活性却强于未经处理的l f ，于是推测在l f 加热降解后产生了抑菌活性强于l f 的多肽。1 9 8 9 年s u z u k i p l 等研究表明，用胃蛋白酶或者胰蛋白酶处理l f ，尽管很容易破坏l f的铁结合能力和抗原性，但却不能消除l f 的抗菌活性。这说明l f 的某些酶解片断仍具有活性，并有可能在幼仔胃肠消化道中继续发挥其抗菌作用。后来的研究发现用胰蛋白酶水解乳铁蛋白的产物主要成分是一些3 5 k d a 和2 3 k d a 的短肽。1 9 9 0 年t o m i t a 等研究了牛乳中l f 经蛋白酶水解后的活性多肽的抑菌性能，发现经猪胰蛋白酶的作用水解得到的小分子多肽具有广谱的抑菌效果，可以抑制一些g + 和g 一细菌的生长，甚至包括一些l f 作用不明显的菌株，水解多肽的抑菌活性明显要高于l f 。向活性多肽中添加f e ”，其抑菌活性并不会降低，这一点与l f 的抑菌表现完全不同。1 9 9 1 年s a i f o 等研究发现，l f 在p h = 4 0 的酸性条件下对热处理具有较强的耐受力，但在p h = 2 0 时热处理，则会导致l f 发生不同程度的水解，水解率达1 0 时的产物( 1 2 0 c 水解1 5 分钟) 在l o 肛g m l 的浓度条件下，显示出比未经酸热处理的l f 更强的抗菌活性。具有抗菌活性的l f 水解产物不具有结合铁离子的能力，并且比天然l f 的抗原性低。但其在富含铁离子的培养基中仍可保持抗菌的活性，表明它具有与l f 不同的抗菌机制。用反相高效液相色谱分离该水解产物，发现了分子量约为5 0 0 0 d a 的具有极强抗菌活性的小肽，它的抗菌机制与l f 的不同之处在于其抗菌活性与铁离子螯合物无关，从而推测在l f 上有一些抗菌位点。该位点存在于l f 的活性多肽上，并在l f 发生部分水解时被激活，显示出很强的抗菌作用。此后，b e l l a m y 等在牛l f 酶解产物中分离得到一段n 端多肽，其抗菌活性比l f 强4 0 0多倍f 7 】，将其命名为l a c t o f e r r i c i n ( 简写为l f c i n ) 。来源于牛乳铁蛋白( b l f ) 的这种短肽被命名为乳铁多肽b ( 1 a c t o f e r r i c i nb o v i n e ，l f c i n b ) ，经测序发现l f c i n b 氨基酸序列为b l f 上近n 端1 7 到4 1 的一段氨基酸残基，分子量约为3 1 2 6 d a 。此后，相继在人、小鼠、山羊和猪【8 】等动物的l f 中发现了l f c i n 的同源物。来源于人乳铁蛋白( h l f ) 的短肤被命名为乳铁多肽h ( 1 a c t o f e r r i c i nh u m a n ，l f c i n h ) 。l f c i n 具有多种生理活性，是乳铁蛋白活性中心。其中，由于l f c i n b 的抗菌活性最强而成为研究热点，而l f c i n h 由于来源特殊，因此也成为了主要的研究对象。2第一章前言虽然从牛乳铁蛋白中发现了抗菌活性非常高的多肽，但是人们对b l f 的研究并没有停止。1 9 9 6 年d i o n y s i u s 和m i l n e 9 又从牛乳铁蛋白的胃蛋白酶水解产物中分离到三条有抗菌活性的多肷：多肽i ，多肽，多肽m 。其中多肽i 和已经发现的l f c i n b 结构非常相似，是8 l f 上1 7 到4 2 的一段氨基酸残基，分子量为3 1 9 5 d a ，具有很高的抗菌活性。1 1 2l f cin b 的基本结构和理化性质l f c i n 的一级结构具有较高的同源性，虽然不同动物的l f c i n 所包括的氨基酸长度有所不同，但是总体来说均包括1 7 - 4 2 这一段小肽。l f c i n b 来源于b l f 的1 7 - 4 1 位氨基酸，由2 5个氨基酸残基组成，l f c i n b的氨基酸顺序为p h e 。l y s 。c y s 。h r g 。a r g 。t r p 。g l n 。t r p 。a r g 。m e t 。l y s 。l y s 。l e u 。g l y a l a p r o 。s e r 。i l e 。t h r 。cy s v a l a r g a r g a l a - p h e io 】，包括5 个a r g 、3 个l y s 和多个芳香族氨基酸残基，具有强碱性，等电点大于8 5 ，分子量为3 1 2 6 d a ，其中的2 个c y s 通过形成分子内二硫键使l f c i n b分子呈不完全的桶状，而且研究表明，二硫键在抗菌过程中作用并不大，被破坏后l f c i n b的抗菌活性并不减弱【l l 】。人乳铁蛋白经胰蛋白酶水解后释放的肽较大，它包括整个蛋白质分子的第1 - 4 5 个氨基酸：胰蛋白酶也能水解u 与1 2 位氨基酸之间的肽键，但是n 一端仍f然通过二硫键与其他部分相连。人乳铁素( l f c i n h ) 为人乳铁蛋白1 7 - 3 9 位的一段氨基酸残基( 图1 ) 。公山羊乳铁蛋白肽( 1 a c t o f e r r i c i nc a p r i n e ，l f c i n c ) 为乳铁蛋白n 端1 4 4 2的氨基酸片段。在l f c i n 的一级结构中，1 8 个氨基酸残基靠一个二硫键结合而形成一个环，而且a n d e r s e n 等研究发现，分子的环状结构对l f c i n 的抗病毒活性十分重要，l f c i n 只有保持环状结构才具有抗病毒的活性，二硫键的缺失会对引起其抗病毒活性的丧失。第一章前言i t c t n 蛋- 一r n s p i q c i乎sig 嘲宅阳乏s 腿“f c l l b誓k k lrg薏拿器圈1l f c i a 的蝴- - w g t $ 成的环状结构其中的1 1 个氨基酸具有与完整的l f c i n b 相同的抗菌活性，而且这1 1 个氨基酸残基中富含t r p a r g 的区域( r r w q w r ) 是保持抗菌活性所必须的，属于保守氨基酸序列【l l l 。( 图2 ) 。图21 f c m b , q 的三维结构( 来源于s c h t b l i ，1 9 9 9 ：熙色代衷是t _ r p 3 和r a p s 残基：银灰色代表的是a 玛l , a r 9 2 和a r g o 残嘉翁4冬skr，譬警第一章前言l f c i n b 的立体结构远比完整的乳铁蛋白分子简单的多。天然状态下，l f c i n b 在完整乳铁蛋白分子中呈一段q 一螺旋结构和一段b 一折叠结构，当从完整蛋白分子中解离下来后原先的a 一螺旋结构消失 1 2 1 ，在溶液中里反平行的两段8 一折叠结构，并且第3 位和第2 0位的半胱氨酸之间形成二硫键，起到稳定分子结构的作用。对l f c i n b 的溶液状态进行核磁共振( m r ) 研究显示在该9 一折叠为主的两亲性结构中，几乎所有的疏水基团( f nc a 、w 6 、w 8 、p 1 6 、1 1 8 、c 2 0 ) 集中于b 一折叠的一侧，而亲水基团集中在另一侧。图3l f c i n b 在溶液中的结构模型图中除包括主链结构及二硫键外，还包括 r g ，l y s 侧链( a ) 和芳香族集团( b )l f c i n b 的抗菌作用与它的这种b 一折叠结构及色氨酸密切相关，b 一折叠结构使l f c i n b易于贴近细胞膜表面，而色氨酸的存在使l f c i n b 分子更易于插入细胞膜的脂质双分子层中，破坏细胞壁的膜结构及膜电位，使细菌内容物泄漏并最终导致细菌死亡。从而解释了l f c i n b 抗菌活性明显强于乳铁蛋白的原卧幢l 。s t r o m 等用丙氨酸( a l a ) 替换l f c i n b 上的第六位色氨酸( t r p ) ，发现替换后的抗菌活性明显降低。进一步研究证明，增加色氨酸的数量，能增强抗菌肽的活性。因此通过分子改造，增加l f c i n b 中的色氨酸数目而不改变其b 一折叠结构来提高其抗菌活性是一种可行的途径。l f c i n h 在完整的人乳铁蛋白分子中也是以a 一螺旋结构存在。目前尚未发现通过实验方法测定l f c i n h 三维结构的报道。f a r n a u d 等利用计算机分析软件模拟分析了l f c i n h 的空间结构，发现l f c i n h 与l f c i n b 相似。1 4 位的6 1 n 至2 6 位的氨基酸残基在人乳铁蛋白分子中形成的一螺旋结构【l ”，当从乳铁蛋白分子解离后，其中1 7 位a l a 与2 3 位t r p 间的结构由q 一螺旋转变为b 一折叠链结构，l f c i n h 的c 一端结构也发生同样的转变，同l f c i n b结构相似。关于l f c i n h 中结构序列和抗菌效果之间的关系研究报道较少，只是根据其他抗菌肽的作用机制推测，其中的a 一螺旋结构对抗菌活性可能起重要作用。5第一章前言1 1 3l f c i n b 的生物学功能i 1 3 1 抗菌l f c i n 含有多个精氨酸和赖氨酸，属典型的阳离子型抗菌肽。l f c i n 的抗菌活性主要表现为抑菌和杀菌作用【i o l 。不同细菌对l f c i n 的敏感性有所不同，对于敏感细菌来说，l f c i n b 浓度在0 1l lg m l 时，对细菌的生长就具有明显的抑制作用。一般细菌细胞膜中磷脂分子和脂多糖的含量较高，是带负电荷的，而普通真核细胞的细胞膜是近中性的，所以阳离子型抗菌肽l f c i n b 更容易与细菌细胞膜相结合，达到选择性杀灭细菌的效果。并且一般抗菌肽对血清蛋白的亲合性较低，即使在加入1 0 ( w v ) 小牛血清的情况下，抗菌肽对细菌的灭活作用仍不受影响。l f c i n 抗菌广谱，包括许多g + 和g - 病原菌，例如大肠杆菌( ec o l d 、肠炎沙门氏菌( s m m o n e l l ae n t e r i t i d i s ) 、绿脓杆菌( p s u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、产气荚膜梭菌( c l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n s ) 、肺炎克氏杆菌( k l e b s i o l l ap n e u m o n i a e ) 、普通变形菌( p r o t e u sv u l g a r i s ) 、小肠结肠炎耶氏森氏菌( y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a ) 等【卯。不同种类的抗菌肽的抗菌作用机制多种多样。目前国内外对l f c i n 抗菌活性的作用机制的观点主要有两种。一种观点认为l f c i n 阻断细菌对铁源的利用1 1 6 1 ，除乳酸杆菌以外，几乎所有的细菌正常的生长代谢都需要铁的参与。不同病原细菌从其所处的周围环境或寄主中获得铁离子有不同的吸收机制，如在膜上形成孔道吸收外界的铁离子，或者在细胞膜上表达相关受体来获取铁或含有铁的有机分子，细菌中存在的类似功能的受体包括转铁蛋白、血红蛋白、血红素等，而l f c i n 可与这些受体结合，并将受体从细胞膜上解离下来，阻断铁的吸收途径，从而使细菌内部与铁离子有关的代谢过程不能正常进行，导致细菌的正常生长由于缺乏铁源而受到抑制：另种观点认为，l f c i n 能够与细胞膜上的某些组分特异性的结合，破坏细胞膜，使细胞膜去极化，膜内外p h 梯度消失，或在膜上形成孔洞，杀死细菌旧。肠细菌的细胞膜的双分子层由内侧的磷脂( p l ) 分子和外侧的脂多糖( l p s )组成。当未折叠的l f c i n b 依靠静电作用吸附到带负电荷的膜表面时，抗菌肽所携带的正电荷被磷脂分子头部集团所带的负电荷所中和。然后抗菌肽氨基酸序列中的疏水性基团发挥作用，促使抗菌肽折叠成更稳定的结构，使抗菌肽在细胞膜上的位置插的更深，造成细6第一章前言胞膜结构的改变，进一步引发形成离子通道，然后依靠疏水结构插入细胞膜使膜裂解，引起内溶物外泻，致使细菌死亡依照这种机制猜测，不同菌株对同一种抗菌肽的敏感性不同可能是因为细胞膜上磷脂分子的含量不同，即抗菌肽与膜结合的几率不同所导致选择性抗性。然而，有资料表明，l f c i n 既不裂解细胞，也不引起脂质体释放，而是进入细胞，使细胞质内脂质体融合，但这种脂质体融合的生物学意义以及具体的杀菌机制还不清楚，有待进一步研究【1 8 , 1 9 。1 1 3 2 抗真菌假丝酵母又称念珠菌，是一种单细胞真菌，由于近年来人类在医疗过程中大量使用抗生素，导致念珠菌耐药性上升，念珠菌病呈明显上升趋势，研究假丝酵母致病性和治疗药物的工作也曰益增加。关于l f c i n b 的抗真菌活性早期的研究结果主要是通过大量的关于假丝酵母的实验得到的。和细菌一样，l f c i n b 对假丝酵母的抑制作用的研究也是起始于完整的乳铁蛋白的铁离子结合特性对假丝酵母茵丝生长的影响，进而将研究方向转移到n 端抗菌肽对假丝酵母生长的抑制作用上来p o 。另外，l f c i n b 对抗a z o l e 类抗真菌剂假丝酵母的菌丝生长的抑制作用也已经得到证实。实验中所选假丝酵母均对a z o l e 类抗真菌剂的有较高抗性【2 l 】。假丝酵母在单独使用a z o l e 类抗真菌剂时，菌丝生长基本不受抑制，但是在使用l f c i n b 时，即使在低于最小抑菌浓度( n i i c ) 时，仍可以使菌丝的生长受到明显的抑制。另外，在使用a z o l e 类抗真菌剂的培养基中添加l f c i n b ，可以使a z o l e 的m i c 由原先的 2 5 6ug m e 下降到0 2 5pg m l 。l f c i n b 和传统抗真菌剂的协同作用机制还有待于进一步研究。另外，w a k a b a y a s h i 等和y a m a u c h i 等对皮肤真菌t r i c h o p h y t o n 也做了大量工作。1 i 3 3 抗病纠2 2 ，2 3 2 4 矧关于l f c i n b 抗病毒活性的研究工作展开的更晚一些，研究结果表明l f c i n b 可以明显降低病毒的侵染能力，其中既有包膜病毒也有裸鳝的病毒，例如单式疱疹病毒( h e r p e ss i m p l e xv i r u s ) 、细胞巨化病毒( c y t o m e g a l o v i r u s ) 、腺病毒( a d e n o v i r u s ) 和轮状病毒( r o t a v i r u s ) 等。另外l f c i n b 和乳铁蛋白对人们目前普遍关注的h i v 病毒也有抑制作用。通过对l f c i n 及其衍生物的研究结果表明，静电作用是其抗病毒活性的主要原因，但是也7第一章前言不能简单的通过带电荷数的大小来判断抗茵活性的高低。其它诸如疏水性的强弱，分子量的大小，疏水性和电荷的空问排布等同样会影响到l f c i n b 的抗菌活性的强弱。但l f c i n b的抗病毒机制还不十分清楚。病毒感染后般要经历吸附、穿入、脱壳、核酸复制、转录翻译、包装等多个阶段。阻碍任一过程均可防止病毒复制，最有效的预防病毒感染的措施应针对病毒吸附和核酸复制两个阶段。目前对于l f c i n b 与病毒的相互作用，被人们普遍接受的观点是：抑制作用发生在病毒侵染的早期，并不是发生在目标细胞被侵染以后在细胞的内部抑制病毒的复制。对于许多敏感的病毒来说l f c i n b 很可能直接与病毒颗粒结合。另一种可能的抗病毒机制是l f c i n b结合在细胞表面病毒侵染时所需要的受体上，以阻止病毒的侵染过程的发生。o 一螺旋结构的抗菌肽，如m a g a i n i n s 、c e c r o p i n s 、c l a v a n i n s 等对h s v - i 和h s v 一2 病毒无作用，而一些b 一折叠结构的抗菌肽，如o e f e n s i n 、t a c h y p l e s i n 、p r o l e g i n i n s 和l f c i n b 则能够抑制这两种病毒和h i v 对宿主细胞的感染。因此认为，l f c i n b 作为一种阳离子型抗菌肽，可能其p 一折叠结构在抗病毒过程中起着关键作用。1 1 3 4 调节免疫l f c i n 作为一种阳离子型抗菌肽，由于带有正电荷，能够与带有负电荷的免疫原结合，封闭其抗原性，阻断其对机体的免疫刺激作用1 2 6 捌。脂多糖( l p s ) 是g 。细菌细胞膜上的主要成分，包括许多内毒素类物质都属于l p s 类，在通常情况下，l p s 从细菌细胞膜上释放后会导致免疫反应，而l f c i n 可以与l p s 靠静电作用结合，使其毒性丧失，研究表明，l f c i n分子中的t r p 在结合中起关键作用 2 8 1 。细菌d n a 中含有大量未甲基化的c p g 二核苷酸元件，能够激活机体免疫反应，如促进b 细胞c d 8 6 的表达，而l f c i n 可以同含c p g 核苷酸元件的寡核苷酸结合，封闭其抗原性，从而对免疫反应起到下调作用。免疫反应的激活通常需要免疫趋化因子来介导，趋化因子与不同免疫细胞膜上的特异性受体结合，引导免疫细胞到达炎症部位【2 9 1 。近来研究表明，一些阳离子型抗菌肽，如嗜中性粒细胞颗粒释放的q 、d 防御素，能够与免疫细胞膜上的趋化因子受体结合，发挥免疫趋化因子的这种趋化作用。防御素与免疫细胞膜上的趋化因子受体结合主要是依靠防御素表面的正电荷与受体间的静电作用，而l f c i n b 同样是带有强正电荷的阳离子型抗菌肽，也可能通过趋化性来达到调节免疫反应的功能【3 们。第一章前言1 1 3 5 抑制肿癯细胞生长肿瘤的发生是个复杂的生物学过程，涉及多种因素，如原癌基因与抑癌基因的表达调控及相关调控因子的活性调节等。l f c i n b 抑制肿瘤细胞生长的主要原因可能是可以诱导非正常细胞即肿瘤细胞的程序性死亡【3 1 1 。细胞的程序性死亡和一般的细胞死亡有着本质的区别。细胞程序性死亡在胚胎发育、肿瘤症发生和调节免疫系统的成熟过程中起着很重要的作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞成分也发生较大变化，其中一些种类的肿瘤细胞质膜上含有的磷脂头部成分转变成由磷脂酰丝氨酸( p s ) 组成，而正常细胞仅在质膜胞液中才含有p s 。p s 与磷脂酰甘油相似，带有净负电荷，因此推断，l f c i n 对肿瘤细胞的抑制作用与其细胞膜上的p s 等负电荷成分有关。乳铁蛋白经蛋白酶消化降解产生的功能性片断l f c i n b 就具有这种诱导肿瘤细胞程序性死亡的生物活性。在以前的报道中，牛奶经s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 来源的蛋白酶消化后可以诱导患白血病病人血液中白细胞的程序性死亡。在体外实验模型中，嗜中性前髓细胞系h l - 6 0 在白血病病人的细胞增值过程中起着关键的作用，在实验中显示l f c i n b 对h l 细胞系的这种毒性可以归因于诱导细胞的程序性死亡 3 2 1 。1 1 3 6 调控基因表达大量研究表明，l f c i n 能够进入细胞质或核中，可以作为第二信使启动某一信号转导通路，调控基因表达。蛋白激酶i i ( c k 2 ) 是一种广泛存在于真核细胞中的一种多功能s e r t h r 蛋白激酶，在d n a 复制与转录过程中起重要作用 3 4 1 。l f c i n 能够与c k 2 结合，增强c k 2 活性，特异性磷酸化一些介导或调控因子，影响细胞功能，如促进骨髓细胞增殖、中性淋巴细胞激活、促进细胞分化等1 3 5 1 。同时，l f c i n 可以直接作为转录因子，调控基因表达，k a n y s h k o v a 等发现牛乳铁蛋白n 端一段具有抗菌性质的多肤能与d n a 结合，l f c i n也能与r n a 结合，干预细胞功能。与b l f 相比，l f e i n b 不但具有更强和更广的抗菌活性，而且近几年的研究结果表明，l f c i n b 相对于b l f 具有其独特的理化和生物学特性【3 6 , 3 7 1 ：能耐受动物消化道内蛋白酶或多肽酶的降解作用；l f c i n b 的亲水脂性也赋予其乳化功能，这对营养物质消化吸收非常9第一章前言有益；l f c i n b 属于小分子活性物质，不会引起动物抗原性反应：可促进抗生索穿越细菌细胞膜【3 8 】，与多种抗生素具协同作用：对肠道菌的抑制作用具有选择性，动物肠道有益菌如粪链球菌、双歧杆菌和乳酸菌等对l f c i n b 具有强抗性。1 2l f c i n b 的国内外研究进展乳铁蛋白和乳铁素独特的作用引起了国内外学者的重视，很多研究者通过不同的方法来制备l f c i n 。目前在制备l f c i n 的方面，美国处于领先地位。1 9 9 1 年s a i t o 等用猪的胃蛋白酶水解乳铁蛋白，然后经过加热灭酶，并用过滤和反渗透等方法进行分离和浓缩。经过冷冻干燥获得了用于婴儿食品的乳铁索制品。1 9 9 2 年b e l l a m y 等采用两步疏水层析分离法【9 j 将其纯度提高到9 5 。反相高效液相色谱法。先将c 1 8 反相色谱柱用0 1 2 氟醋酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d ，t f a ) 平衡，再以5 m l m i n 的速度上样，然后用t f a 清洗柱子上的杂蛋白直至清洗液在2 8 0 n m处的吸光度降为0 ，最后用洗脱液( 9 0 已腈与0 0 9 2 - - 氟醋酸以2 0 ：8 0 混合) 洗脱目的产物，洗脱液冷冻干燥，保存在一2 0 的环境中。此种方法适合于制备纯度较高( 9 5 以上)的毫克级的l f c i n ，用于分析或者检验l f c i n 的纯度氨基酸合成法。通过多肽自动合成仪，可以准确地合成一定氨基酸顺序的多肽，但是该技术合成的l f c i n 价格十分昂贵，仅适用于少量合成l f c i n 及其多种衍生物，可以作为研究l f c i n 活性与结构的关系、明确l f c i n 作用机制、调节l f c i n 的功能以及开发具有特定功能与性质的l f c i n 衍生物的重要方法与手段。另一种制备l f c i n 的方法是利用d n a 合成仪直接合成编码l f c i n 的d n a ，构建表达载体，在乳腺反应器或微生物中高效表达l f c i n 。这一方法具有一定的可行性，但由于l f c i n抗菌广谱，宿主表达的l f c i n 可能会对微生物宿主本身产生反馈性抑制作用，达不到高效表达的理想结果。因此在构建l f c i n 表达体系的同时，要考虑筛选对l f c i n 具有一定抗性的宿主微生物，这虽然增加了基因工程生产l f c i n 的难度，但因生物技术的迅速发展。仍不失为实现l f c i n 产业化的最佳途径之_ _ 5 2 , 5 3 , 5 4 1 。一直以来，国内外关于l f c i n 的研究工作有很大部分都集中在l f c i n b l 5 的衍生肽方1 0第一章前言面 3 9 1 t o m i t a 等和w a k a b a y a s h i 等人实验结果表明截短的牛乳铁蛋白肽衍生肽，虽然没有了二硫键的存在，但是同样展示出较强的抗菌活性；r e k d a 等人提出牛乳铁蛋白肽的前1 5肽( 1 7 3 1 ) 同样展示出抗菌活性，虽然序列比l f c i n b 缺少c 末端l o 个氨基酸，但是抗菌活性只有很小程度的下降。s t r o m 等根据丙氨酸扫描原理，合成一系列l f c i n b l 5 衍生肽，并对其活性进行鉴定，期望通过这种方法对l f c i n b 的抗菌活性进行解释，同时对l f c i n b l 5中各个氨基酸对展示抗菌活性的影响进行评估。由于l f c i n b 的1 5 肽衍生肽l f c i n b l 5 一w 4 ，l o 氨基酸序列的优化，其功能活性较l f c i n b 有较大提高，而且l f c i n b l 5 一w 4 ，1 0 不同于传统抗生素的抗菌机制，在实际应用中不易产生耐药性菌株，在替代传统抗生索方面显示了巨大的潜力和广阔的应用前景，中国农业科学院正在研究利用基因工程技术构建l f c i n b l 5 一w 4 ，1 0 重组表达载体，以期构建基因工程菌株，高效表达l f c i n b l 5 - w 4 ，l o ；佳木斯大学合成了一段短链乳铁蛋白肽f k c r r w q w r m ，并检测它对酵母细胞和吞噬细胞的作用；四川大学做了l f c i n b 基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达的研究。l f c i n b 具有多种生物学功能，作为一种免疫增强剂已较广泛应用于提高人体非特异性免疫功能。除了继续寻找新的抗菌肽，研究它们的抗菌特性、作用机制和基因结构与调控外目前乃至今后相当长一段时间内，热门的研究方向仍是抗菌肽基因工程，着力解决提高l f c i n b 和其他抗菌肽的生产效率。国外已经有人把人工合成的天蚕素c e c r o p i n b 类似物的基因导入烟草植株，增强了对烟草致病菌的抵抗能力。但是，目前国内的研究工作主要还是在乳铁蛋白的分离纯化方面，因此，国内应在完善l f c i n b 制备工艺的基础上加快其研究前沿方面的工作，使l f c i n b 尽快为社会发挥其应有的作用。1 3 开展此课题的依据目前国内外对乳铁素的前体物质即乳铁蛋白的研究已经非常深入，特别是国外对l f c i n 及其衍生物的研究也非常细化，这为我们进行研究提供了很多宝贵的可借鉴之处。现在已经可以采用超滤法、饱和硫酸铵沉淀法、层析法、亲和色谱法、离子交换法等多种方法制得不同纯度、不同产量的乳铁蛋白【4 0 l ，这也极大的降低了制备乳铁蛋白的成本，可以实现其商业化生产。本实验室也已经较好的掌握了制备高纯度乳铁蛋白的技术，这些都第一章前言为我们进行乳铁蛋白的水解来制备乳铁素提供了有利条件。本实验室在前面的工作中也已经对牛乳铁索进行了初步探索，这为我们以后的研究提供了宝贵的经验。乳铁素作为一种新型的抗菌肽，显示了强大的生物学功能，结合消费者对绿色、天然、健康的需求，使乳铁素可在食品、乳品、药品、化妆品等领域广泛应用，这些为乳铁紊的生产提供了一个巨大的市场，显示了乳铁素广泛的应用前景。所以本课题开展的关于乳铁素的分离提取与其抗菌性的研究不仅具有理论和实践依据，而且具有广阔的开发和应用前景。1 4 开展本课题的意义众多会造成食品污染的致病菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌等，其活性都会在l f e i n b 的作用下受到抑制或失活【4 “。鉴于l f c i n b 的广谱抑菌性，它可以作为天然的防腐剂广泛地应用于食品、化妆品，还可以作为预防和治疗感染性疾病的新型临床食品和医药制品中的功能性成分，对于剐出生的婴儿尤其有益。并且，l f c i n b具有广泛而独特的生物学功能和理化特性，在饲料工业中应用具有独特优势，比如它具有广谱的抗细菌、病毒、真菌作用，可用来预防和治疗畜禽疾病；l f c i n 耐热性好，如作饲料添加剂，在加工过程中不易变性失活 4 2 , 4 3 1 ；它清除内毒素，可以保证畜禽健康：它调节免疫系统活性，可以增强家畜对疾病的抵抗力；它具有抗真菌和抗脂质氧化的作用，可用作防霉剂和抗氧化剂：它具有乳化作用，可以促进脂肪消化吸收。目前国内在制备较高纯度的l f e i n 方面进行的研究较少，多是通过简单水解乳铁蛋白，然后将含有l f c i n 的水解产物添加到饲料中，观察其对动物生长的影响。在许多应用中，包括护眼制品、口服卫生制品、化妆品、护肤制品、临床食品等，都发现较纯的乳铁索制品( 纯度在9 0 以上) 比粗的制品要好，特别是在免疫原性和抗菌活性方面，纯的乳铁素要远远优于粗的乳铁素。因此，乳铁素的分离纯化是非常必要的。如今，b l f 已成为乳品工业的种新型产品，以此为初始原料，大规模地生产l f c i n b 是完全可以实现的。虽然关于活性多肽的完整的生理功能的描述还不尽完善，用于不同类型的食品及化妆品、保健食品中的有效l f c i n b 浓度还有待于进一步的研究和确定，但可以肯定的是，l f c i n b 作为一种天然的抑菌剂，符合人们日益增长的对不含人造防腐剂的绿色产品1 2第一章前言的追求，可以广泛地应用于商业产品中因此，我们开展了乳铁素的分离纯化及其抗菌性的研究，这课题具有理论意义和实际应用价值。第二章材料和方法第二章材料和方法2 1 牛乳铁索粗品的制备2 1 。l 牛乳铁蛋白的制备2 1 1 1 材料新鲜牛初乳( 天津海河乳业公司) ：盐酸( 天津市化学试剂五厂，分析纯) ：氢氧化钠( 天津市凯通化学试刺有限公司，分析纯) ；c m - s c p h a d e xc 一5 0 树脂( p h a r m a c i a l )氯化钠、硝酸银等均为分析纯。2 1 1 2 仪器牛奶分离机( 青海农牧机械制造有限公司) ；w h 8 4 0 1 5 0 型多功能电动搅拌器( 天津市威华仪器设备有限公司) ：h r w s 2 4 水浴锅( 天津市中环实验电炉有限公司) ；p h s - 3 c 精密p h 计( 天津市盛邦科学仪器技术公司) ；s t - 2 实验室超滤装簧( 天津市科学器材公司科技星火部) ；l g j 1 0 冷冻干燥机( 北京四环科学仪器厂) ；k d c 1 6 0 h r 离心机( 科大创新股份公司中佳分公司) ；酶标仪( m u t i s k a nm k 3 ) ( 上海雷勃分析仪器有限公司) ；9 6 孔酶标板( c o s t a r 公司) 。2 1 1 3 方法i( 1 ) 初乳的脱脂：将采集到的新鲜牛初乳( 一般为乳牛产犊后前三天) 通过牛奶分离器的处理脱去脂肪，得到脱脂乳；( 2 ) 乳清的分离：将脱脂乳按体积稀释两倍后置于磁力搅拌器上，边搅拌边向其中加入i m o b l 盐酸溶液调整其p h 值到4 6 ( 酪蛋白的等电点) ，4 0 水浴加热3 0 r a i n ，离心除去酪蛋白( 4 ，4 0 0 0 r m i n ，3 0 r a i n ) 。保留上清液：1 4第二章材料和方法( 3 ) 树脂活化，根据需要称取一定量树脂，用去离子水浸泡( 常温下卜2 d ，或沸水l - 2 h ) ，收集树脂再浸泡于1