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高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 摘要 硒是维持人体正常生命活动所必需的元素之一，缺硒会导致多种疾病的发 生。天然食品中硒含量普遍较低，紧靠天然食物中的硒并不能满足人的正常需要， 膳食硒的低水平摄入对人体健康有潜在威胁，要保证人体健康，防治有关疾病， 就应当有充分的硒摄入，通过摄取足够的硒来预防有关疾病的发生显得尤其重 要，而无机硒毒性较高不能被人类所利用，通过植物和微生物将无机硒转化成有 机硒是目前研究的热点，但植物体内的硒含量普遍较低，因而通过微生物转化可 以为人类提供高产价廉的有机硒产品。 本文以本实验室保存的酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei t ) 为出发菌株进 行了微生物富集硒的研究，主要工作如下： ( 1 ) 通过对出发菌株的梯度耐硒驯化、d e s ( 硫酸二乙酯) 化学诱变、紫 外诱变，获得了一株高生物量、高硒含量的菌株u v p t 2 。生物量提高到9 6 8 9 l ， 硒含量提高到9 6 7 2 5 p g g 。 ( 2 ) 对诱变后菌株u v p t 一2 的发酵培养条件和培养基进行了优化，通过 p l a c k e t t b u r m a n 实验得出转速、温度、初始p h 对富硒酵母的生物量影响较大。 通过响应面优化实验得出最适转速为2 0 3 r m i n ，最适发酵温度为3 0 3 ，最适 初始p h 为4 5 2 ，最后确定富硒酵母的培养条件为：温度3 0 3 c ，初始p h 4 5 2 ， 转速2 0 3 r m i n ，接种量8 ，装液量4 0 m l 2 5 0 m l ，培养时间4 0 h 。亚硒酸钠添加 方式为梯度添加。最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母膏。 ( 3 ) 富硒酵母通过梯度耐硒驯化、d e s ( 硫酸二乙酯) 化学诱变、紫外诱 变，在最适发酵培养条件和培养基条件下，生物量从6 5 9g l 提高到10 9 2g m ， 硒含量从6 8 3 6 2 1 x g g 提高到1 2 0 6 9 6 r t g g 。 ( 4 ) 对中草药保健酒浸提工艺的优化，通过单因素实验和响应面分析法最 后确定保健酒最佳浸提工艺为：加糖量1 0 ，酒基酒精度5 9 0 ，温度4 0 ，浸提 时间6 d 。 ( 5 ) 通过对酵母细胞的超声波破碎，有机硒的提取，从而制成一种新型的 富硒保健酒。降度后成品酒的理化指标为：酒精度：3 0 a ：5 0 ( v v ) ；含糖量：7 8 ；总酸：1 8 2 o g l ；总酯：2 o 2 2 9 l ；人参皂甙：3 7 5 6m g l o o m l , v i i 有机硒含量：2 0 0 2 2 0 p g l ；黄酮：1 8 3 6m g l o o m l ；生物碱：2 6 0 m g 1 0 0 m l 。 ( 6 ) 最后在整个实验基础上设计了生产工艺流程。 关键词：诱变；富硒酵母；硒蛋白；响应面；人参皂甙 v i i i b r e e din go fs e e nric h e dy e a s ts t r ainwit hhig h bio m a s s a n dt h es t u d yo ns e e n ric h e dh e ait h wir e a b s t r a c t s e l e n i u m ( s e ) i sa l le s s e n t i a lm i c r o n u t r i e n tt h a ti sr e q u i r e di nav a r i e t yo f m e t a b o l i cf u n c t i o n s ，a n dh a sn u m e r o u sh e a l t he f f e c t s t h es ec o n t e n ti na r t i f i c i a lf o o d i sl o w , t h es ec o n t e n ti na r t i f i c i a lf o o dc a l ln o ts a t i s f yp e o p l e sr e q u i r eu pt os n u f f , m e a ls ea b s o r b e di nl o wl e v e lh a sl a t e n c ym e n a c et oh u m a n sh e a l t h ，i no r d e rt o a s s u r eh u m a n sh e a l t h , a n dp r e v e n ta n dc u r er e l a t ed i s e a s e ，t h ea b u n d a n ts ea b s o r b e d i se s s e n t i a l ，b u ti n o r g a n i cs ec a nn o tb eu s e di nf o o db e c a u s eo fi t sh i g h e rt o x i c i t y p l a n t sa n db a c t e r i ah a v eb e e ns h o w nt op l a yak e yr o l ei nt h eb i o l o g i c a lc y c l eo fs eb y t r a n s f o r m a t i o nf r o mi n o r g a n i cs et oo r g a n i cs ei nt h ee n v i r o n m e n t g e n e r a l l y , s ei s t r a c ea m o u n t si np l a n t s s oi tw e i g h sh e a v i l yf o rb i o s y n t h e s i so fl a r g eo n t p n ta l lc h e a p s e - e n r i c h e do r g a n i cp r o d u c t i o nb ym i c r o o r g a n i s m s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a su s e df o rs m d y i n gt h ea b i l i t yo fe n r i c h i n gs ei n m i c r o o r g a n i s m ，t h em a j o r i t yo f w o r ka sf o l l o w s ： ( 1 ) as t r a i nn a m e du v - p t - 2 晰t 1 1h i g h e rb i o m a s s ，h i g h e rs ec o n t e n ti so b t a i n e d a f t e r b e a r i n g s e a d a p t e dc u l t i v a t i o n ，c h e m i c a lm u t a g e n e s i s a n du l t r a v i o l e t m u t a g e n e s i s t h eb i o m a s si su pt o9 6 8 9 l ，t h es ec o n t e n ti su pt o9 6 7 2 5 p g g ( 2 ) t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n dc u l t u r em e d i u mi sd e t e r m i n e d t h e r e s u l ts h o w st h a tr o t a t es p e e d ，t e m p e r a t u r ea n dt h ei n i t i a lp hh a v eah i g he f f e c to nt h e b i o m a s so fs e - e n r i c h e dy e a s t sb yp l a c k e t t - b u r m a ne x p e r i m e n t t h eb e s tc o n d i t i o n s b yr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sm e t h o da r et h a tt h eo p t i m u mr o t a t es p e e di s2 0 3 r m i n ， t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ei s3 0 3 c ，t h eo p t i m u mi n i t i a lp hi s4 5 2 t h e o p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r e a sf o l l o w e d ：t e m p e r a t u r e3 0 3 c ，i n i t i a lp h 4 5 2 ，r o t a t es p e e d2 0 3 r m i n ，i n o c u l a t i o nv o l u m e8 ，v o l u m e l o a d i n g4 0 m l 2 5 0 m l ， c u l t u r et i m e4 0 h t h ei n o 玛a n i cs ei sa d d e dg r a d u a l l y t h eo p t i m u ms o u r c eo fc a r b o n i sg l u c o s e ，t h eo p t i m u ms o u r c eo fn i t r o g e ni sy e a s te x t r a c t ( 3 ) u n d e rt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n dc u l t u r em e d i u m ，t h eb i o m a s s i x o fs e e n r i c h e dy e a s t si sf r o m6 5 9g ，lu pt o10 9 2g l ，t h es ec o n t e n ti sf r o m 6 8 3 6 2 p g gu pt o12 0 6 9 6 1 x g g ( 4 ) t h eb e s te x t r a c t i o np r o c e s sh a sb e e nf o u n db ys i n g l ef a c t o ra n dr e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i sm e t h o d t h eb e s te x t r a c t i o np r o c e s s e sa r ea sf o l l o w e d ：s u g a rc o n t e n t 10 ，l i q u o rd e g r e e s5 9 0 ，s o a k i n gt e m p e r a t u r e4 0 * ( 2 ，s o a k i n gt i m e6 d a y s ( 5 ) an e ws e - e n r i c h e dh e a l t hw i n ei s m a d eb ya d d i n go r g a n i cs ea f t e rc e l l b r e a k i n ga n dt h ee x t r a c to fo r g a n i cs e t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a li n d i c a t o r so f f i n i s h e dh e a l t hw i n ea f t e rd i l u t e da l ea sf o l l o w e d ：l i q u o rd e g r e e s3 0 5 。( 蝴；s u g a r c o n t e n t7 1o ；t o t a la c i d1 8 2 0 9 l ；t o t a le s t e r2 o 2 2 9 l ，g i n s e n o s i d e s 3 7 5 6m g lo o m l ，o r g a n i cs e2 0 0 - - 2 2 0 p g l ，f l a v o n o i d s18 3 6m g 10 0 m l ，a l k a l o i d s 2 6 0 m g 10 0 m l a tl a s t ，i td e s i g n st h ep r o c e s sf l o wo fp r o d u c t i o no nt h eb a s eo ft h ew h o l et e s t s k e yw o r d s ：m u t a g e n e sis ：s e - e n r ic h e dy e a s t ；s eie n o p r o t ein s ；r e s p o n s e s u r f a c e ；g in s e n o sid e s x 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 (_ ) 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位做作者龆粥峭 签字日期：u 。夕年多月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： v 一字：帛 签字日期：加。7 年f 月日l 电话： 邮编： 芍日 k 石 ：w易卜 月；广6 名 年 登鼽y 者 沙 馋 文 期 沦 日 位 字 学 签 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 1 前言 1 1 微量元素硒的概述 硒是人和动物必需的微量元素。人们对各种营养元素的认识，是随着科技进 步而不断深入的，对硒的认识也是如此。硒元素是瑞典化学大师j j b e r z e l i u s 和j g g a h a 于1 8 1 7 年发现的i 。1 9 3 4 年人们发现牛的“碱病”与“蹒跚病 与硒的摄入量有关，因此，硒一直被看作有毒元素2 】【3 】【4 】。直到1 9 5 7 年s c h w a r z 和f o l t z 才首次发现硒的营养作用1 5 j ，并提出硒是机体不可缺少的一种微量元素； 1 9 5 9 年o l d f i v e l d 等证明了缺硒会引起动物的白肌病嘲；1 9 7 3 年r o f r u e k 等发现 硒是动物体内谷胱甘肽过氧化酶的必需成分 7 1 ，这一发现对正确认识硒的生物化 学作用和硒、维生素、含硫氨基酸之间的关系起了十分重要的作用。硒与人体健 康的关系引起了普遍的关注，1 9 7 3 年世界卫生组织专家委员会正式宣布，硒是 人体生理必需的微量元素之一【8 】f 9 】，并把硒誉为“生命的火种 、“具有保健作用 的神奇矿物”。1 9 8 8 年，中国营养学会也将硒列为人体必需的1 5 种每日膳食营 养元素之一【1 0 1 。越来越多的医学研究证明，硒对人体健康起着至关重要的作用， 这些作用主要是通过各种硒酶和硒蛋i 刍( s e l e n o p r o t e i n s ) 来实现的。随着人们对硒 的生理功能、硒与心血管疾病、免疫功能的关系的逐步加深，以及社会保健需求 的增多和人口老龄化的加剧，富硒食品的开发已成为一个研究热点。预计未来相 当长的一个时期，富硒保健食品市场将会是一个迅猛发展的大好时期。一大批颇 具中国特色的硒资源保健食品将脱颖而出，它将给我国保健食品行业注入新的生 机与活力。 1 1 1 硒的存在形式 硒位于第六主族，原子量为7 8 9 6 ，属氧族元素，原子序数是3 4 ，位于元素 周期表中第四周期的砷和溴以及位于氧族元素硫和碲之间，电子构型 a r 3 d 1 0 4 s 2 4 p 4 。在自然界中以负二价、零价、四价和六价形式存在，所形成的 化合物与元素硫类似。由于在元素周期表的位置，其上方和右方是非金属，下方 和左方是准金属，因此硒除具有非金属性外，还有部分金属性。自然界中，硒主 要存在于岩石、化石燃料和海洋环境中，其存在形式主要有三种：无机态、有机 态以及吸附态。与同族的硫和碲相似，无机态的硒以四种价态存在：还原态的硒 化物s e 2 。( 2 ) 、单质硒s e o ( o ) 和氧化态的亚硒酸盐s e 0 3 2 。( + 4 ) 及硒酸盐s e 0 4 2 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 ( + 6 ) ，有机态的硒化物直接与碳成键。生物体内，硒的存在形式主要有两类， 一类是含硒氨基酸，主要是硒代半胱氨酸( s e c y s ) 和硒代蛋氨酸( s e m e t ) ； 另一类是含硒蛋白质，硒以两种形式存在于蛋白质中，一种是以可离解的因子存 在，另一种以共价键形式存在。硒主要以s e c y s 或s e m e t 的形式参入蛋白质， 其中s e c y s 是由密码子u g a 介导经复杂而特殊的翻译过程参入到蛋白质中1 1 1 】， 一般把以s e c y s 形式参入到多肽链的蛋白质称为硒蛋白，而把其它结合硒的蛋 白质称为含硒蛋白。 1 1 2 硒的生物学功能 硒是人体红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分【1 2 】，其主要作用是参与 酶的合成，保护细胞膜的结构与功能免遭过度氧化与干扰，具有许多重要的生理 功能。 硒的生物学功能是多方面的，主要通过硒酶和硒蛋白再发挥作用，抗氧化性 是硒的最重要的生物学功能之一。 1 1 2 1 抗氧化作用 硒是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，在体内特异地催化还原谷胱甘肽 与过氧化物的氧化还原反应，如过氧化氢、超氧阴离子、羟游离基、脂酰游离基， 从而保护生物膜免受损害，维持细胞的正常功能【1 3 1 。硒的抗氧化作用主要通过 g s h p x l 酶促反应清除脂质过氧化物1 4 1 。硒在人体生长繁殖功能上与维生素e 的作用相类似，对维护组织弹性，延缓不饱和脂肪酸的氧化，防止早期衰老均有 积极作用。硒对过氧化物酶的抗氧化能力要比维生素e 高出5 0 0 倍。硒与维生素 e 构成了动物机体抗氧化的两条防御途径，两者共同发挥作用，硒可与维生素e 抗氧化作用相互补充【1 5 】。维生素e 控制着磷脂上不饱和脂肪酸不被氧化，成为 抗氧化的第一道防线1 6 1 。硒以g s h p x 的形式催化脂质过氧化物的还原，在整个 细胞中将过氧化物迅速分解成醇和水，使细胞中的膜结构免受过氧化物的损害， 起第二道防线的作用【1 7 1 。 1 1 2 2 抗衰老作用【1 8 】 硒作为必需微量元素，一方面作为体内有害自由基的清除剂，并防止体内氧 化损伤；另一方面，在一定条件下，硒的化合物由可作为产生活性氧自由基的催 化剂。它可催化g s h h 2 0 2 或( 0 2 ) 体系产生0 2 、h o 一等活性氧自由基。在不同 2 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 的条件下，硒化合物既能清除自由基，又能产生自由基，视其在研究体系或体内 的浓度而定：在较低的浓度下，硒主要表现出对活性氧自由基的清除作用；而在 较高浓度下，硒主要表现出活性氧自由基的催化作用。 衰老是机体组织中持续进行的自由基反应而引起的有害物质积累的结果，过 氧化脂质( l p o ) 是机体自由基反应的主要产物。实验表明，人体内l p o 与年龄 呈正相关，长寿者血液中的硒含量是正常人的3 倍之多，充分说明硒具有抵抗衰 老的功能。 1 1 2 3 提高免疫功能 硒的免疫作用：硒几乎存在于所有免疫细胞中，抗氧化剂如辅酶q 、半胱氨 酸、维生素e 等都需要硒的参与和激活才能增加免疫功能。硒可以激活淋巴细胞 的某些酶，从而加强淋巴细胞的抗癌作用。硒能刺激免疫球蛋白及抗体的产生， 增强机体对疾病的抵抗力。缺硒可导致嗜中性白细胞杀伤力降低，抗体滴定度降 低并延迟体液免疫的现象。补充足够硒能明显提高人体免疫功能，增强机体对病 原体的抵抗能力【1 9 1 。 1 1 2 4 解毒作用 硒能拮抗重金属毒性，与金属有很强的亲和力，在体内与重金属如汞、甲基 汞、镉及铅等，结合形成金属硒蛋白复合物而解毒，并使金属排出体外【2 0 1 。动物 实验还发现硒可降低黄曲霉毒素b 1 急性损伤、减轻肝中心小叶坏死的程度与死亡 率。 1 1 2 5 其他生理功能 硒还有保护心血管、防癌、促进生长、保护视觉器官等作用。已有实验证明 硒是生长和繁殖所必需，缺硒可导致生长迟缓。硒有保护视神经，预防白内障， 增强视力的功能【2 1 1 。人眼的巩膜、水晶体、视网膜内含硒量很高。有趣的是视力 敏锐的骛鹰，其视网膜内含硒量比人高1 0 0 倍。这是硒具有特殊光电效应的特点 在动物器官内的体现 2 2 1 。白内障及糖尿病性失明者补充硒后发现视觉功能有所改 善。硒还能够提高动物的繁殖能力【2 3 1 ，精子本身就含有硒蛋白，硒存在于精细胞 尾部中段，该处含有线粒体，鼠精细胞由于硒的缺乏会引起线粒体杂乱无章，胞 浆含量过多，核心处原生质膜附着疏松、不规则。研究证明，环绕在线粒体周围 的富含硒代半胱氨酸的多肽能起连结作用，在精细胞生成过程中能使线粒体螺旋 3 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 稳定。 1 1 3 有机硒和无机硒 在研究补硒时，人们常把硒的化合物分成有机硒和无机硒两大类。有机硒的 生物活性较高，能够有效地在体内同化，且毒性比无机硒小，又有利于在生物体 内吸收。无机硒中硒的价态是s e 4 + 、s e 6 + ，如n a s e 0 3 、n a 2 s e 0 4 、c a s e 0 3 。不同 形态的硒在生物体内有不同的吸收机制【2 4 】【2 5 1 【2 6 】。大量研究表明，有机硒对动物 的毒性明显低于无机硒，且来自膳食中的天然有机硒在动物组织中的保留量大于 无机硒。 无机硒以氧化态存在，由肠道被动吸收，被还原为硒化物，然后转运到肝脏， 合成硒蛋氨酸一硒的可溶性形式，或被转运到肾脏通过尿液排出。19 8 5 年， w o l f f r a m 等用大鼠进行实验，比较来自硒酸盐和来自亚硒酸盐中的硒的吸收机 制，首次发现硒酸盐中的硒在鼠的灌注回肠段较小肠的其他肠段吸收速度快【2 7 1 。 同年，a r d u s e r 等用实验证实了硒酸盐中硒的逆浓度吸收机制。在灌注实验中， 硒酸盐中硒的主动运输受到抑制，n a + 的存在有助于其在肠粘膜的吸收，这在回 肠段效果相当明显【2 引。随后，一些学者用来自不同动物的离体的小肠刷状缘粘膜 进行实验，揭示了硒酸盐与n a + 协同运输，这与硫酸盐的吸收有共同的机制，并 进一步证实，硒酸盐的小肠刷状缘粘膜吸收受到硫代硫酸盐、硫酸盐、铬酸盐、 锡酸盐等的抑制【2 9 1 。动物体内亚硒酸盐与硒酸盐的吸收机制不同。小肠对亚硒酸 盐的吸收是通过不依赖n a + 的简易扩散方式进行，且亚硒酸盐中的硒吸收不受硫 酸盐及o h 影响【3 0 】，但离体的刷状缘粘膜实验表明来自亚硒酸盐中的硒广泛结合 于细胞膜表面，原因可能是亚硒酸盐与肠膜细胞间的s 0 4 2 。发生了反应。该反应 可通过亚硒酸进入细胞维持化学梯度来增加亚硒酸盐中硒的扩散吸收。 有机硒中硒的价态通常是以s e 2 价存在，或者与其他物质结合成络合态。有机 硒的基本形式为硒蛋氨酸、硒胱氨酸等，以还原态存在，并与氨基酸结合，以主 动形式吸收。在动物天然来源的饲料中，其中硒的总含量中有相当大的一部分以 硒代氨基酸的形式存在，如硒代蛋氨酸( s e l e n o m e t h i o n i n e ，s e m e t ) 、硒代胱氨酸 ( s e l e n o e y s t i n e ) 、硒代半胱氨酸( s e l e n o e y s t e i n e ，s e - c y s ) 。m c c o n n e l l 和c h o 证实 l s e m e t 以主动运输的方式通过仓鼠的小肠壁，但s e c y s 不是如此。随后，他们 进一步证实m e t 与s e m e t 之间存在相互抑制。用离体的猪小肠的刷状缘膜进行实 4 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 验，可以看至i j m c t 与s e m e t 以相同的氨基酸载体与n a + 一起以次级主动运输的方式 通过小肠刷状缘膜【3 l 】。看来这种运输机制也可适用于c y s 和s e c y s ，可被一些基 本氨基酸载体所调节，因c y s 的运输可被s e c y s 、l y s 和m g 竞争性抑制【3 e l 。有机 硒是生物体通过代谢过程将环境中的无机硒通过与体内的生物大分子相结合形 成含硒有机物，有机硒在生物体内停留时间较长，在人体硒营养状况良好的情况 下，有机硒可贮存起来，当人体硒营养摄入不足时，贮存的有机硒能够补充到生 理代谢中，从而满足硒的需求。因此通过生物将无机硒转化为有机硒，是生产富 硒食品及添加剂的一种安全有效的方法【3 3 1 。 1 1 4 硒与疾病【3 卅 临床研究表明，血硒含量的高低与疾病发生率和死亡率呈负相关，硒与人和 动物的几十种疾病相关p 5 1 。动物补硒可防治各种疾病如癌症【3 6 1 、糖尿病【3 7 1 【3 8 】【3 9 】、 克山病、心血管疾病、白内障 4 0 1 、抑制爱滋病病毒等。 1 1 4 1 硒与癌症 流行病学研究表明许多癌症都与硒有关。硒在降低消化、呼吸系统癌症发病 率、抑制淋巴肉瘤生长、治疗急慢性白血病、抑制乳腺癌和结肠癌、防治肝癌等 方面具有重要作用。研究表明，肿瘤的发病率和死亡率与硒的分布呈负相关【4 1 1 。 1 1 4 2 硒与克山病 缺硒会使骨骼肌萎缩和呈灰白色条纹、发生白肌病，同时心肌受损、心肌细 胞致密性变化、脂质增多、钙质沉积、导致克山病。故补充硒可防治白肌病和克 山病。 1 1 4 3 硒与心血管疾病 缺硒被认为是冠心病发生的危险因素。我国冠心病和心肌病患者的缺硒水平 也较正常人群低。这是因为硒与细胞增殖、蛋白质合成、心脏生理及机械功能关 系密切，同时心肌组织中的g s p - p x 为含硒抗氧化酶，它参与清除h 2 0 2 和脂质过 氧化物，从而保护心肌细胞膜和线粒体等细胞器官的正常功能。 1 1 5 我国硒营养现状 人体内硒的总积累量约1 4 - - 2 1 m g ，在摄入与排泄中保持动态平衡。世界上 许多缺硒的国家都根据本国人民的生活水平和营养状况，规定了每人每天的补硒 量，1 9 7 6 年国际硒学会推荐标准是6 0 t g ，美国科学院食品与营养委员会的推荐标 5 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 准是5 0 - - - - 2 0 0 p g ( 7 岁以上) ，中国营养学会1 9 8 8 年推荐标准是每天5 0 p g 。而我国1 3 个省市的营养调查表明，成人每日的摄硒量仅2 6 6 3 1 t g 。因此，现阶段我国缺硒 现象是普遍存在的，通过各种途径补充硒元素，尤其是通过食品途径强化补硒， 己成为目前功能性食品的研究热点之一。 1 2 硒生物转化的研究动态 利用生物具有转化性富硒能力，可将无机硒转化为有机硒。用这种富集法生 产有机硒食品称为人工转化补硒营养食品。该类产品中的硒以类似天然食物的有 机硒形式存在，如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸，既可提高硒的生理活性与吸收率， 又可降低其毒性，有利机体吸收。目前，人们获得有机硒的主要途径是生物转化 【4 2 j o ( 1 ) 植物转化法：主要用施硒肥和喷硒气雾剂的方法使粮食作物、茶叶、 蔬菜和水果等植物增加硒含量，是改善机体低硒状态的另一途径。我国四大富硒 地区利用当地硒资源，人力开发富硒粮油、蔬菜、水果食品。如恩施的富硒玉米、 富硒小麦、富硒大米、富硒魔芋、富硒茶、富硒天麻等已形成产业化生产格局。 利用无机硒生产出富硒藻类等富硒海洋植物保健食品及添加剂。 ( 2 ) 动物转化法：用含硒量较高的饲料饲喂动物1 4 3 ，可生产富硒肉、蛋、 奶、禽产品，如富硒蛋、富硒蜂蜜、富硒肉食制品。 ( 3 ) 微生物富集法：主要有富硒酵母和富硒食用菌。富硒酵母是将酵母菌 放入无机硒( 亚硒酸钠) 的培养基中培养而制得。动物实验表明，富硒酵母无毒， 直接食用安全，生物利用率高，能有效地提高动物或人体体内的血硒水平，可作 为一种硒营养添加剂，用于开发生产富硒保健食品。富硒酵母在保健食品生产方 面有很高的应用价值，而且它具有比亚硒酸钠更高的生物活性和更高的食用安全 性。天然食用菌中的硒含量较低，通过富含无机硒的培养基料接种入菌种，可生 产出富硒食用菌，主要包括一些平菇、凤尾菇、金针菇和香菇等l 4 4 】，但硒的转化 效率不高且硒含量不能达到很高的水平。 目前关于硒的生物转化研究主要集中在植物转化4 5 1 和微生物转化的研究上， 植物虽然能够有效的将无机硒转化成有机硒供给人体所需要，但也存在大多数植 物富硒能力低；生长周期长；产量低；生产受季节气候的制约，不易于人工控制 等问题。针对这些问题，研究者逐渐将视线转移到微生物对硒的转化研究上，同 6 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 时又因为微生物易变异，可采用物理、化学、生物学方法定向诱变育种，从而获 得优质的生产菌株m 。 在微生物类群中，酵母菌富硒能力强，而且又安全可实用性微生物。酵母菌 是单细胞真核微生物，酵母菌的细胞壁的厚度为2 5 一- 7 0 n m ，主要成分为葡聚糖、 甘露聚糖、蛋白质和几丁质，另有少量脂类，酵母菌独特的细胞壁结构决定了它 对无机硒有一定的耐受性。大量研究表明，酵母菌具有高度的富硒能力和将无机 硒转化为有机硒的能力。酵母菌细胞体积小，表面积大，代谢旺盛，繁殖速度快， 生产速率高，且生产不受季节气候的制约，易于人工控制。同时培养基的原料来 源广，可利用某些工农业废料如麦芽汁、糖蜜等，解决了大规模生产的成本问题。 单细胞的酵母菌容易诱变，比植物品中容易改良，可采用物理、化学、生物学方 法定向诱变育种，从而获得高产优质的生产菌株。富硒酵母即是在酵母培养过程 中加入无机硒，通过酵母对硒进行自主吸收和转化，使硒与酵母细胞内的蛋白质、 氨基酸、多糖等结合，从而将无机硒转化为纯天然的有机硒【4 7 1 。 1 2 1 富硒酵母的研究进展 1 2 1 1 微生物的富硒机理 许多微生物( 细菌、真菌、酵母等) 都能具有转化亚硒酸钠的能力，目前关于 微生物转硒的机理，存在多种假说4 8 1 。不同的微生物，由于所含酶类及参与氧化 还原反应物质的不同，可能存在不同的硒还原机理。1 9 9 8 年，t u r n e r 等结合多种 微生物转硒机制的研究成果，推测在大肠杆菌中，亚硒酸钠存在如图1 - 1 所示的 代谢途径4 9 1 。其中，亚硒酸钠中硒的终产物主要包括：单质硒、硒代氨基酸、硒 蛋白及含硒核酸等。 7 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 辫i 辫 吖k - z ，r 品截一 彳i 70 ， t 镂飞 鬣，彤【 图卜1e s e h e r i c h i a f 中硒的代谢途径( t u n e re t 甜，1 9 9 8 1 f i g u r e l it h em e t a b o l i s ma p p r o a c hi ne s c h e r i c h i a c o i l 硒的生物有机化方法即通过生物转化来开发有机硒源是一种安全有效的补 硒途径。其中，微生物对无机硒有较强的转化能力，当前人们己厂泛地应用微生 物作为硒的生物有机化载体进行富硒产品的研究和开发。 121 2 酵母富硒的机理 酵母富硒的作用机制相当复杂。富硒过程一般分为胞外结合与沉积、胞内吸 收与转化2 个阶段。 酵母从溶液中吸附硒离子，酵母在吸附金属离子的同时经常会伴随其他离子 的释放，释放出的c a 2 + 、m 9 2 _ 、h + 等离子的总电荷大致等于被吸附的电荷数。因 而吸附的过程可以被看作是一个离子变换过程。酵母对硒的富集特性决定于酵母 自身代谢系统对s e 和s 的识剧能力 5 1 和细胞质组分将硒还原的能力。含硒游离氨 基酸和整合到蛋白质中的硒代氨基酸，都是硫的类似物，当细胞处于亚致死计量 时，或比正常的微量元素的浓度高时，硒代替部分硫进入氨基酸中，从而进入蛋 白质中。由于t r n a ”“不能区分蛋氨酸和硒蛋氨酸，所咀有一部分硒蛋氨酸在蛋 白质翻译中可替代蛋氨酸掺入到蛋白质中【5 ”。硒代半胱氨酸本身由u a g 编码， 在编码硒蛋白的m r n a 中有一段硒代半胱氨酸插入序列s e d i s 所构成的强结 构，帮助硒代半胱氨酸t r n a 识别这种密码子，在蛋白质翻译过程中，在一些特 定的酶作用下掺入其中口“。其它硒化合物如硒胱氨酸、甲基硒胱氨酸，即使土壤 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 中的硒含量较高，它们在植物中仍处于比较低的水平，而且也不能参入到蛋白质 中。 1 2 1 3 酵母作为富集硒元素载体的优越性 目前表示动物机体对硒的生物学利用率是以全血中g s h p x 活性，全血中或 红细胞中的硒浓度、畜产品( 如乳i 蛋、肌肉组织) 硒水平来衡量。以谷胱甘肽过 氧化物酶为测量指标，有机硒和无机硒均可有效地被动物利用。以肌肉中硒储备 量或其他途径( 如乳或蛋中硒的含量，胎盘通过能力等) 为衡量指标，富硒酵母的 效果明显优于无机硒。与无机硒相比，酵母作为富集硒元素载体具有无污染、无 毒、安全有效的优点，具体体现在： ( 1 ) 富硒酵母中的硒取代含硫氨基酸中的硫，形成硒代氨基酸，进一步组 成蛋白质，克服了无机硒过氧化作用。 ( 2 ) 酵母营养丰富：酵母化学组成中蛋白含量丰富，含有8 中必需氨基酸， 其中赖氨酸和甲硫氨酸的含量相对较高，而赖氨酸和甲硫氨酸在营养学上是第 一、第二限制性氨基酸。酵母的蛋白质消化率约为8 0 。同时酵母富含各种维生 素，特别是富含b 族维生素，而b 族维生素在一般的粮食作物里含量相对较低， 同时含有丰富的麦角固醇。 ( 3 ) 体内某些重要组织器官如甲状腺、精子等可优先利用硒来合成蛋白， 富硒酵母可满足机体这一机制，而无机硒则不能。这是所有氨基酸微量元素具有 良好的组织定向性的表现。 ( 4 ) 人与动物的实验结果表明，富硒酵母中的硒的生物效力是无机硒的1 0 - 2 0 倍，这就意味着富硒酵母更适用于提高动物性食品中硒的浓度，这必将对人类 的保健产生积极影响。 ( 5 ) 富硒酵母具有高度的富集硒能力和将无机硒转化为有机硒的能力，能 进行大规模工业化生产，降低成本。 1 2 1 4 国内外富硒酵母的研究进展 酵母具有高度的富硒能力及将无机硒转化为有机硒的能力。经检验分析，硒 酵母中的硒化合物主要是s e m e t ，毒性大大低于亚硒酸钠，且生理活性较无机 硒高，在提高机体血液含硒水平及存留在机体内的数量方面均明显高于亚硒酸 钠，是一种很好的富硒产品。目前，国内对富硒酵母进行的研究为数不少，国内 9 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 报道的富硒酵母一般是将普通的酵母在添加有适量亚硒酸钠的发酵培养基中，于 一定条件下培养，获得的硒含量一般在3 0 0 2 0 0 0 1 t g g 。国外对富硒酵母的研究较 早，国外从7 0 年代末相继研制出硒酵母、铬酵母等以酵母为载体的富含微量元 素的食品。9 0 年代，日本旭化成工业股份有限公司生产的硒酵母，硒含量为 1 0 0 0 p g g 以上。目前，国外研究的富硒酵母细胞硒含量达到1 2 0 0 5 0 0 0 p g 9 1 5 3 】【5 4 】【5 5 】【5 6 1 。硒酵母的一项美国专利u s p a t n o 6 ，1 9 7 ，2 9 5 ，其硒浓 度为1 0 0 0 - - 5 0 0 0 p g g 。国外有报道利用酵母来吸收废水中的有毒物，使其转化为 有机物，减少毒性，综合利用为硒酵母的开发利用提供了新的思路。 1 3 保健酒的简介 中国的酒文化与中草药有着悠久的历史，渗透于整个中华五千年的文明史 中。而保健酒的起源与酒的产生是分不开的，我国在酿酒发酵上有悠久的历史和 重要贡献，且我国的中草药资源丰富，这些都为我国的保健酒发展奠定了坚实的 基础。酒本身就是一味中药。中医学认为，酒乃水谷之气，具有上升和发散的特 性，可通血脉、散淤血、行药势、御寒气、消冷积、温肠胃、矫臭味，在治疗 上能扶正祛邪，增强机体免疫力，提高机体适应性等特点【5 7 1 。酒有助于药物有效 成分的溶出，酒还有杀菌、防腐作用5 引。保健酒在中国时间应用了几千年，积累 了许多宝贵经验，应用范围越来越广。保健酒可以用于治疗疾病，也可用于保健， 并具有其它药剂所没有的优点。正确的选用，适量地饮用保健酒可以促进身体健 康。 1 3 1 保健酒的制备方法 保健酒的制作主要有酿制法、浸提法和渗漉法三种方法【5 9 1 。其中浸提法是主 要方法。浸制法又分为冷提取法和热提取法【印1 。基础酒多用白酒，也可用黄酒、 葡萄酒等。 1 3 1 1 浸提法 浸提法是指用适当基础酒和方法，从药材中浸出提取有效成分制成。树脂类 和矿物类中草药中可溶成分无细胞结构，可直接溶解于基础酒中，动植物药材多 具有细胞结构，药材的大部分生物活性成分存在于细胞中。中药是来自天然的药 物，其采收有季节性，多采收后干燥后使用。新鲜药材经干燥后，组织内水分蒸 发，细胞皱缩，形成空腔，有利于基础酒向细胞内渗透和对活性成分的溶解。药 1 0 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 材经粉碎后，破碎细胞所含成分可被溶解，完好细胞内的成分浸提，仍需经过由 药材固相转移到基础酒液相的传质过程。这个传质过程包括对药材的浸润与渗 透、成分的解吸和溶解，以及成分的扩散等几个相互联系的阶段。使用的方法有 冷浸、热浸等不同的工艺操作。 1 3 1 2 渗漉法 渗漉法是将药材粗粒置渗漉器内基础酒连续地从渗漉器的上部加入渗漉液 不断从下部流出，从而浸提出药材中所含可溶性成分的方法。渗漉提取装置由渗 漉器，循环泵和循环管路组成。保健酒中杂质少，挥发组分损失小，有效成分损 失小；设备结构简单，不需要特殊的辅助设备，节省能源，维持费用低。但这种 方法在保健酒的生产中很少应用。 1 3 1 3 酿制法 酿制法通常所用方法是将营养成分较丰富的原料( 通常为中药) 配合造酒的 原料，通过酵母等微生物发酵产生酒精，同时得到深层发酵产物，其中含有许多 有效成分，如：多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、核 酸、氨基酸、维生素、m n s o d 、具抗生素作用的化合物等【6 l 】【6 2 1 ，发酵液经过加 工精制，制成具有保健作用的保健酒。目前，此法在保健酒的生产中应用较少。 1 3 2 保健酒的质量标准 合格的保健酒应该有一定的质量标准，具体分析见图卜2 【6 3 】。其芳香的风味 成分应为酒香、药香相结合。较好的口感应为入口绵软，不刺喉，不上头，药味 不突出，酒香味与药香味结合完美。最重要的条件是要有功能性如免疫调节、抗 疲劳、延缓衰老、调节血脂、改善胃肠道、改善睡眠等，但必须经过动物实验及 人体科学实验，临床验证结果有疗效，获得卫生部门合格证明，并应严格遵守食 品卫生条例，才能称为保健酒嗍。 高生物量富硒酵母的选育及富硒保健酒的研制 保健酒质量标准 k r 堂堋、 指标 指标 控制 成分 特征 图1 - 2 质量标准指标构成要素 f i g u r e l 。2i n d e xc o n s t i t u e n te l e m e n t so fq u a l i t ys t a n d a r d s 准基本要素 准扩展要素 1 3 3 保健酒的研究现状 目前对保健酒的研究，按功能划分，主要集中在延缓衰老，补寿益气；增强 免疫，抗肿瘤，抗癌；滋容养颜，活血美肤；补肾壮阳和缓解神经衰弱者几个方 面。而在研究内容上主要集中在生产工艺的优化和有效成分的分析及功效研究。 在生产工艺的优化【6 5 】上，目前保健酒的生产，大多是采用传统的浸制法。工 艺上，主要对影响提取效率的因素，如温度、乙醇浓度、浸泡时间以及药材的粉 碎度进行优化。 在有效成分的分析及功效研究 6 6 1 6 7 】【6 8 1 ，有效成分的分析研究主要集中在对 保健酒中有机酸及其酯类、中药材中的活性成分，如皂甙类、黄酮类、生物碱类、 萜类与甾体类以及多糖类等的检测与研究。其中对有效成分的分析，大多采用色 谱分析法；对功效的研究，均采用动物实验中的小鼠喂养实验。 1 3 4 保健酒的发展现状 现代保健酒概念的提出距今只有2 0 多年时间，但它对我国的酒类市场产生 了极其巨大的影响。1 9 8 1 年，劲酒有限公司率先提出了保健酒的概念，与市场 上的传统的药酒相区别。 当前在白酒销量下滑、葡萄酒混战、啤酒占霸主地位的酒类市场中，保健酒 似乎又给白酒销售市场带来了一丝希望，很多专家预言一中国保健酒的时代已经 1 2 高