【毕业学位论文】（Word原稿）甘蓝型油菜木质素单体合成基因COMT和F5H的克隆及表达调控作物遗传育种学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 甘蓝型油菜木质素单体合成基因 克隆及表达调控 5H . 5H . I 摘 要 油菜是世界上食用植物油和植物蛋白的主要来源之一，也是我国重要的油料作物，占国内植物油料总产 40%左右。 菌核病和倒伏是影响油菜高产、优质的两个重要因素，而且其发生互相促进，使油菜遭受更严重危害。目前 尚未 发现菌核病的 抗源，化学农药的使用和农业栽培措施有一定的作用，但不能根本解决菌核病和倒伏的危害 , 抗性品种的培育是公认最有效的方法，植物基因工程技术开辟了植物育种的广阔前景。 本研究 采用同源序列法，参考 5 抗（耐）菌核病和抗倒伏油 菜品种 中双 9号 5 油菜木质素合成的代谢调控奠定基础， 进而分析采用反义 5达活性对 植物产生的影响。本研究旨在利用基因工程技术， 探索提高 以增强 植物 抗（耐）病和抗倒伏能力的可行性。主要研究结果如下 : 1. 测序片段间对应区段同源性达 96%以上，与拟南芥2%，所翻译的氨基酸序列均包含 克隆测序表明油菜 其中一个完整编码区段作为插入片段， 采用主要在木质部特异表达的 构建植物反义表达载体 2. 5已发表 翻译的氨基酸序列包含相应功能保守域。 多个 克隆测序，发现一个与已发表 明油菜 个成员。以其中一个 采用主要在木质部特异表达的 构建植物反义表达载体 5个克隆进行 原核表达 ， 得到与 预测结果一致的融合蛋白。 得多个 5在开花前， 转基因株系和空白对照 生长发育情况大致相同；进入生殖生长阶段后，转基因烟草株系的茎杆较细，叶片较小，总体表现为长势单薄，开花结实较差；收获种子后挖掘根系，绝大多数转基因烟草株系表现为 须根 发育极少而有明显的主根， 空白对照为繁茂的须根而无 明显的主根。 在开 花结实阶段，选择生长发育情况一致的烟草植株，冰冻超薄切片，进行组织化学染色。茎秆 木质素的沉淀分布发生了变化。 体 ，农杆菌介导转化甘蓝型油菜，获得 5个。 关键词： 甘蓝型油菜，木质素， 农杆菌介导的转化 he 0% be up 0% to a no to be to it 0%0% is in of is of of In of a in at G is of a of to 5H to of In 5H ， is in 5H. We to by as 1. of to in of , by of 6% of 2% It 2. to in of by of 5H a 5H it at 5H . of 5H 4. of 0 5H of In of in of In in to a be to of in of S of is to up of of of of of up of of of of of to to 5. 0 5H in ., 录 第一章 前言 . 1 物抗倒伏研究及其与木质素的关 系 . 2 物抗倒伏研究 . 2 物抗倒性与木质素的关系 . 3 物抗病性机制及其与木质素的关系 . 3 物的抗病性机制 . 3 盘菌的致病机制 . 4 质素与植物抗病性的关系 . 5 质素生物合成及其基因工程研究进展 . 6 质素的分布及组成 . 6 质素的生物合成与调控 . 8 质素生物调控的问题与展望 . 16 究目的与意义 . 17 第二章 甘蓝型油菜 因的克隆 . 18 料与方法 . 18 验材料 . 18 物总 抽提 . 18 转录 一链 . 19 检索 同源基因 . 19 离克隆 因片段 . 19 果与分析 . 22 因片段的比对与分析 . 22 5H 基因片段的比对与分析 . 28 第三章 甘蓝型油菜 因的原核表达 . 30 料与方法 . 30 验材料 . 30 核表达载体的构建 . 30 因的诱导表达 . 32 种蛋白的 胶电泳 . 32 果与分析 . 34 因的原核表达 . 34 5H 基因的原核表达 . 35 第四章 反义 烟草中的表达 . 37 料与方法 . 37 验材料 . 37 V 物表达载体的构建 . 37 性重组质粒转化农杆菌 . 37 杆菌叶盘法转化烟草 . 38 基因烟草的 定 . 39 基因烟草的性状分析 . 40 果与分析 . 40 物表达载体的构建 . 40 基因烟草的获得 . 41 反义 因烟草的生长发育及性状分析 . 42 第五章 反义 甘蓝型油菜中的转化 . 45 料与方法 . 45 验材料 . 45 杆菌 介导甘蓝型油菜子叶柄的遗传转化 . 45 基因油菜的 定 . 47 果与分析 . 47 性 油菜的获得及繁育 . 47 反义 因油菜的分子鉴定 . 47 第六章 讨论与总结 . 49 论 . 49 于同源序列法克隆基因 . 49 于反义 制基因表达 . 50 于油菜的遗传转化 . 51 结 . 52 参考文献 . 54 致 谢 . 62 作 者 简 历 . 63 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 0 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 硫酸铵 酰丁香酮 6 6基对 血清蛋白 苄青霉素 六烷基三甲基溴化胺 培品种 2,4 2,4， 4碳酸二乙酯 丙基硫代 D 半乳糖苷 那霉素 道尔顿 2-(-(乙磺酸 酸 密度值 酸氧化酶 丙烯酰胺凝胶电泳 利福平 二烷基硫酸钠 酸链霉素 ,N,N,N,N,中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前言 油菜是世界上食用植物油和植物蛋白的主要来源之一，也是我国重要的油料作物，占国内植物油料总产 40%左右。我国是世界上最大的油菜生产国， 2000年以来 年 种植面积已突破 积和总产均 约 占世界的三分之一，长江流域是世界油菜最大的产区，面积约占世界四分之一。虽然杂交油菜和双低油菜品种的选育成功及在生产上的大面积推广显著地提高了油菜的产量和品质，但是一些因素 如病虫害、倒伏等问题却限制着油菜增产潜力的发挥。 油菜菌核病是由真菌核盘菌 染引起的一种世界性病害，在我国长江中下游和东南沿海冬油菜主产区发病尤为严重 ,一般年份产量损 失 10%30%，严重时可达 80%。由于菌核病菌属广谱性非专化病原物，到目前 为止，仍没有找到对菌核病免疫的有效抗源，只是在一些品种中表现出对菌核病一定程度的抗性。尽管化学农药的使用和农业栽培措施防治对菌核病的危害有一定的 抑 制作用，但仍未从根本上改变油菜菌核病严重危害的局面 ,抗病品种的培育无疑是最有效的方法。目前国内外对油菜抗菌核病的研究主要集中在生理生化抗性的研究方面，如草酸氧化酶和一些酚类物质等，而对植物组织结构物质参与抗性反应则研究较少。 倒伏 是影响油菜高产、优质的 另一个 重要因素 。 油菜倒伏后不仅产量比正常油菜减产 10% 30%, 含油量亦比正常油菜低 10% 30%，并且倒伏后郁 闭的环境更加重病菌的侵染与扩展。虽然一些矮秆基因已经被广泛地应用于改良小麦和水稻等作物的抗倒伏性 (2003; 2001)，但属于无限花序的油菜如果矮化，可能引起结荚数的减少从而导致其产量下降，所以限制了矮秆基因在油菜上的应用（ 2004）。 木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质 ,具有重要的生物功能。木质素能够与纤维素、半纤维素等其他细胞壁成分相互交连形成结构复杂的细胞外基质，增强植物细胞和组织的机械强度与负重能力；木质素具有疏水的化学特性，使植 物细胞不易透水，为水分、矿物质和有机物在植物体内的长距离运输提供了可靠保证；同时这种结构在客观上也形成了一个物理屏障，有效地阻止了各种植物病原菌的侵染，增强农作物的抗病能力。 木质素是复杂的苯丙烷单体聚合物，由香豆醇（ 松柏醇（ 芥子醇（ 3种主要的木质醇以多种不同化学键连接而成，分别形成了 3种类型的木质素：紫丁香基木质素（ 愈创木基木质素（ 对 本研究 探索利用基因工程技术，提高 增强 植物 抗（耐）病和抗倒伏能力，主要依据以下几点： 第一， 裸子植物的木质素主要为 其中 5%是 被子植物中，木质素主要为 而 键，其间以更多稳定的 成高致密 的 木质素结构， 士学位论文 第一章 前言 2 散。裸子植物的木质结构比被子植物的致密。制浆中化学降解的目标是非致密的 而由 第二，当植物受到环境的胁迫而偏离其自然生长状态时，就会启动独特的生长方式而竭力回复到自然生长状态。在针叶树中，茎秆或树枝的弯曲导致形成特殊 的 木质组织，统称为压缩木质。此压缩木质的木质素含量更高，尤其是含有更大比例 构单元， 可以与其他单体以更多稳定的 而形成高致密的 木质素结构（ 1986； 1990）。1985）发现压缩木质中的 致密 木质素也参与植物抵抗病源侵染的反应。 第三， 以降低木质素含量、提高 S G 比值而提高制浆效率的木质素调控 研究 已取得了许多进展，大多数转基因植物的输导系统和支持系统仍足以抵御自然逆境 （ 2003）。 物抗倒伏研究及其与木质素的关系 物抗倒伏研究 作物的抗倒性是一个复杂的多基因控制的性状，其 抗性可能涉及许多方面，包括根部的稳定能力，茎秆的负重能力，冠层部分的特性等，可分为茎倒伏和根倒伏两类 。 关 于评价抗倒伏性的指标及抗倒性的测定，许多研究者作了有益的探索。对于根倒伏， 1997）用强度系数来评价玉米根的抗倒伏能力，表明根的直径、数量和生长角度与强度系数之间存在很好的相关性； 蒲定福 等（ 1999）提出“品种倒伏系数”的概念，综合考虑了植株的高度、重量、茎秆机械强度和根量等因素的影响，能较客观、准确地评价小麦品种抗根倒伏性，并证明茎秆机械强度和根量与品种抗倒性关系最密切。对于茎倒伏， 1958)根据从垂直茎秆方向的拉力和回到原来位置的速度，把茎秆的弹性表示为 10 个梯度； 1992）利用茎秆穿透计来研究玉米茎秆的强度，由于这种方法的精确性较高，在玉米抗倒性研究方面得到了广泛的应用；王勇等（ 1998）等采用茎秆抗折力（即用弹簧秤拉断茎秆时所用的力）为评价指标，研究小麦品种茎秆的质量和解剖学性状的关系；肖世和等（ 2002）利用杆强测定仪研究小麦品种的茎秆强度，其原理是将植株某一部位弯曲成一定的角度后，纪录茎秆对仪器的反作用力，这种方法可在田间直接、无损伤、可重复 、快速地测定大量材料的茎秆强度值。 关 于作物的抗倒伏，相关报道集中在小麦、水稻、玉米等大田作物上，油菜抗倒伏的研究较少。 1994）研究四个冬小麦品种的抗倒能力，结果倒伏抗性与茎秆的强度、硬度无相关，而决定于根的形态、机械特性。对于油菜，以往的研究，一般着重于从栽培管理措施以及植株外部形态等方面来研究其与倒伏的关系 , 如氮肥的使用量、土壤湿度、油菜栽培方式、茎段生长情况等。 2001）深入研究了甘蓝型油菜主根的锚地机制，对于反映其主根锚地力量大小的锚地力矩，主根抗弯曲性的贡献率为 40%，土壤对压力抗性的贡献率为 60%，在一定范围内，根系长度的延长比粗壮度的增加更有利于提高植株的稳定性；并提出了根倒伏和 茎倒伏的安全系数，用来估计 根倒伏和 茎倒伏发生的可能性，结果 根倒伏 的安全系数大于茎倒伏的安全系数，说明茎易于发生倒伏。姜维梅等（ 2001）观察表明 : 表皮、皮层细胞的厚薄以及维管束排列疏密与油菜中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 3 的倒伏有密切的关系。 植株内部的解剖构造与茎秆质量的关系密切。王勇等（ 1998）认为茎秆的质量决定于以下几个方面：（ 1）机械组织的发达程度。优质茎秆的机械组织发达，表现为细胞层数多，细胞壁增厚早且 快，木质化程度高。（ 2）维管束的大小和数目。茎秆质量好的，其大维管束长且宽，数量多。（ 3）薄壁组织木质化程度。优质茎秆的薄壁组织木质化早，且木质化速度快、程度高。（ 4）纤维细胞的长度和粗度。纤维细胞越短、粗，其机械性能越强，茎秆质量越好。相似的试验结果在玉米上也有报道（王群瑛， 1991）。 物抗倒性与木质素的关系 细胞壁是植物的骨骼 ,作为细胞壁主要成分的纤维素、半纤维素和木质素等与 茎秆质量 有着内在的联系。 细胞壁 木质化 过程中 ,木质素渗入到细胞壁中 ,填充于细胞壁构架内 ,加大了细胞壁的硬度 ,增强了细 胞的机械支持力，同时由于木质素的化学特性 ,如不可溶性和复杂的酚类聚合物，使得木质部具有细胞壁疏水性 ,也增强了抗病虫能力。 从生理角度来讲，茎秆中贮藏物质的多少及组成成分与作物的抗倒性有一定的关系（王勇等 ，1996）。 1971)发现在玉米的 质素含量显著下降与茎秆强度明显减低相关。黄玉鸾 （ 1988）分析小麦茎秆中全糖含量与抗倒性的相关达极显著水平 ( r=认为可能是由于多糖的积累促进了木质素、纤维素等高分子化合物的合成，加强了茎秆机械强度的缘故。 当前，已有作物 抗倒性与木质素相关的分子生物学方面的研究。 1995）在玉米的其为木质素单体合成中的关键酶， 推测由于 而造成了木质素含量和植株的抗倒伏能力的下降。 2001）在根抗倒伏能力不同的玉米品系中，找到两个差异表达的 段，其中一个与细胞色素 一个属于逆境诱导蛋白，均在抗倒性强的品系中表达水平较高。 2002）在小麦中克隆了与两个与 93%）的 基 因在根、茎、叶中均有表达，茎秆中为 2003）对玉米抗倒伏性进行 与茎杆强度 现有参与木质素合成的基因。尽管木质素与作物的抗倒伏性可能存在相关性，但是尚无通过基因工程技术调控作物木质素生物合成以提高其抗倒伏能力的研究报道。 物抗病性机制及其与木质素的关系 物的抗病性机制 植物的病原有真菌、细菌、病毒、类病毒等几类。一般来说，病原菌 的致病手段主要有以下几种方式：分泌破坏寄主细胞的酶类如角质酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、磷脂酶、蛋白酶等水解酶，使寄主发生软腐；分泌破坏寄主细胞膜的和正常代谢的毒素，