【毕业学位论文】（Word原稿）苜草素对小鼠巨噬细胞NO、IL-6、TNF-α分泌的影响及其机理研究免疫营养学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 苜草素对小鼠巨噬细胞 泌 的影响及其机理研究 O、 O、 目 录 英文缩略表 . I 摘 要 . . 言 . 一章 绪 论 . 1 1 巨噬细胞分泌活性物质的功能与调控 . 1 . 1 . 3 . 4 2多糖对巨噬细胞功能影响 及机制 . 6 糖对巨噬细胞活性的影响 . 6 糖增强巨噬细胞活性的机理 . 8 3 黄酮类化合物对巨噬细胞功能的影响及机制 . 10 . 10 . 11 酮类化合物对巨噬细胞分泌功能影响的机理研究 . 12 4皂苷对巨噬细胞功 能的影响及机制 . 14 . 14 苷对巨噬细胞分泌功能的影响及机理研究 . 14 5 丝裂素活化蛋白激酶的作用 . 16 38 . 16 38 . 17 38 . 18 6 立题依据及总体构思 . 19 第二章 试验研究 . 21 试验一 苜草素对 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活 性、细胞代谢活性的影响 . 21 试验二 苜草素对 小鼠巨噬细胞 噬活性和 泌量的影响 . 24 试验三 苜草素对巨噬细胞 达量的影响 . 32 试验四 苜草素诱导 泌和表达中的作用 . 45 第三章 主要结论与有待进一步研究的问题 . 48 1 本论文的主要结论 . 48 2 本研究的创新点 . 48 3 有待进一步研究的问题 . 48 参考文献 . 49 附录 . 60 致 谢 . 64 作 者 简 历 . 65 I 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 氧化氮 导型一氧化氮合成酶 介素 6 瘤坏死因子 多糖 of 4 白细胞分化抗原 补体受体 3 细胞介素受体相关激酶 核因子 B B, 核因子 制剂 蛋白激酶 C 蛋白激酶 A 裂原活化蛋白激酶 基末端激酶 胞外信号调节蛋白激酶 丝裂原活化蛋白激酶 激酶 扰素 介素 达核因子 化生长因子 瘤坏死因子受体相关因子 单核细胞趋化因子 1 2 环氧合酶 要 巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成份 ,具有吞噬、杀伤、递呈抗原、分泌生物活性物质、调控局部组织微环境以及抑制肿瘤等多种功能 ,构成了机体非特异防御的主要基础。本研究室前期研究发现苜草素对肉仔鸡的免疫机能具有增强作用，对小鼠外周淋巴细胞的增殖具有促进作用。为了 进一步研究揭示苜草素对动物免疫系统的作用效果及其机理，以 c 小鼠为实验动物，通过活体上观察、细胞培养、细胞因子及其 达量检测、信号转导等多层次和系统的试验分析，研究了苜草素对巨噬细胞功能的影响及其机理。 试验一 苜草素对 c 小鼠 腹腔巨噬细胞吞噬活性、代谢活性的影响 为了检测苜草素在体内对小鼠巨噬细胞功能的影响，本试验以 50 只雄性， 6龄 机分为四组：空白组， 300mg/d、 500 mg/d、 1000 mg/组 10只。每天灌胃给药一次 ,空白对照组用等体积的 理盐水代替 , 连续 14d。于第 14d 处死，制备腹腔巨噬细胞，测定苜草素对其吞噬活性、代谢活性的影响。结果发现，随着苜草素剂量的增加，巨噬细胞的吞噬活性逐渐增加，并在 1000 mg/到显著性差异（ P但是对巨噬细胞的代谢活性没有显著影响。 试验二 苜草素对巨噬细胞 噬活性和 泌量的影响 为确定苜草素对巨噬细胞吞噬活性和 泌量的影响，以不同浓度（ 苜草素处理 噬细胞，结果发现， 随着苜草素浓度的增加 吞噬活性也逐渐增加趋势，在 开始呈现显著性差异 （ P，在1mg/巨噬细胞的吞噬能力达到最高达到最大值，这与活体观察结果相一致。对于 着苜草素浓度的增加，其逐渐降低了 导的 分泌。与 理组相比，P在 1mg/且 苜草素逐渐抑制了 相比，从 P,并逐渐降低，在 1时抑制作用达到最大程度。苜草素增加了 随着苜草素剂量的增加， 分泌量逐渐升高， 与空白组相比，从 P,在 1mg/ 试验三 苜草素对巨噬细胞 达量的影响 为进一步确定苜草素对 O、 先确定了 以 不同浓度的苜草素 ( .0 mg/和脂多糖（ 10 g/理 后检测细胞因子 果发现 随着苜草素剂量的增加， 表达量逐渐下降，这与前期检测 分泌减少相吻合。因此可以推测，苜草素降低 表达。苜草素对 其相反， 其显著增加了巨噬细胞 与前期检测 综上所述， 苜草素通过调节巨噬细胞 因的转录，进而调节了 分泌量。 验四 苜草素通过 控 表达和分泌 为了研究 否在苜草素对 调控中起到作用，首先确定了 苜草素刺激巨噬细胞的最佳浓度和最佳时间，然后 以 1、 5、 10、 20 g/ 制剂以抑制 后 在最适的苜草素浓度和最适时间下再处理巨噬细胞，然后检测 苜草素处理的巨噬细胞 们发现 达量的 上升。根据此结果可以确定，苜草素是通过 关键词： 苜草素 巨噬细胞 of an in in In we in of To on in on in in To on in 50 c 0 00mg/d,500 mg/d,1000 mg/d, in Pin no on on O, In to on O, in a in a of .4 P .6 .0 mg/P In NO PS in a to PP in in O, in o to O, in on 10g/ml）of we V PS O, at of in an in in To if in we ,5,10,20 g/ml)of at It is in by c 言 苜蓿（ ）英文名 属豆科、多年生草本植物 种类繁多，分布极广 ，全世界共有 60多种，我国有紫花 苜蓿 、黄花 苜蓿 、南 苜蓿 、天蓝 苜蓿 、褐斑 苜蓿 及矩镰荚 苜蓿 等种。其中紫花苜蓿，是人类迄今发现对人体健康营养最全面的草本植物之一， 最有栽培价值，其他大多数为野生类型。紫 花苜蓿 经长期栽培，已适应一定的生态环境，形成了优质高产抗病抗寒耐旱等品种或地方品种。 （耿华珠等， 1995） 紫花苜蓿最早是阿拉伯人发现的可食用健身的蔬菜 ，取名为“苜蓿” 含意为食物之父，已有 3000 余年的种植、食用、饲用的悠久历史。苜蓿具有免疫调节，降血糖、降血脂、抗炎、抗疲劳、抗衰老等功效。大量试验证明，苜蓿能防止试验动物的高胆固醇血症和动脉粥样硬化，也能加速试验动物的高胆固醇血症和动脉粥样硬化斑块的消退。（何 云等， 2005）苜蓿在我国畜牧业生产中有很高的利用价值，主要表现为：促进动物生长发育，提高免疫机能；改善胴体品质，提高瘦肉率；调节脂肪代谢，可降低血清中血脂含量；对内分泌激素的分泌产生影响。 关于苜蓿在动物生长、脂肪代谢和免疫调节方面的积极作用 ，已有不少的相关研究报道。然而人们很少对苜蓿中有效成分进行深入研究。中国农业科学院畜牧研究所自 1996 年开始，针对苜蓿中有利于动物健康的有效成分进行深入研究。经过多年研究成功研发出了“苜草素”（ 其以多糖、黄酮、皂苷为主要活性成分。本实验室经过动物饲养试验证明，苜草素可显著抑制肉仔鸡腹脂沉积，并对其机理进行了深入研究。 同时我们也发现苜草素可显著提高淋巴细胞转化率和新城疫病毒抗体滴度。这说明苜草素具有免疫调节作用。 巨噬细胞具有吞噬、杀伤、递呈抗原、分泌生物活性物质、调控局部组织微环境以 及抑制肿瘤等多种免疫功能，是机体非特异免疫的重要组成部分。为了进一步了解苜草素是如何调节机体免疫系统，为 其在饲料添加剂和动物营养代谢调控中的科学使用提供实验依据，我们选择了巨噬细胞作为研究对象，观察苜草素对巨噬细胞功能的影响并进行了深入的机理研究。中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 巨噬细胞分泌活性物质的功能与调控 功能与调控 生物体内重要的信使分子和效应分子，是一种短期的生物活性分子，在免疫系统、神经系统和 心血管系统的调节中发挥重要作用。 族是 们可以催化 O。 别为神经元型 (内皮型 (诱导型 (前两种为结构型 表达依赖细胞内钙离子激活，而 在通常情况下不表达。但在内毒素、 , 噬细胞、中性粒细胞、组织中的免疫细胞和胰岛细胞等通过启动基因转录合成 达即具有催化活性，因而体内高于生理浓度的 常是 稳定，半衰期很短 (3可迅速和水、氧及机体中的超氧阴离子反应，生成硝酸盐和亚硝酸盐。 可以协助机体杀伤受感染组织和肿瘤细胞，但是 在循环性休克和炎症的病理过程中均可见到 大量产生，过量释放的 直接作用于血管平滑肌，使其麻痹性舒张，对血管活性药物出现低反应性，造成难治性低血压。另有报道认为 性介质。 仅作为第二信使和神经递质在细胞一细胞间信息传递中起着重要的调节作用，也可以介导免疫效应和炎症。 O 进而引起血管扩张充血和水肿，导致低血压，抑制U 血小板聚集，还可以促进其它炎症介质如 感染性休克病理生理过程中起十分关键的作用。 表达所产生的过量 全身感染循环衰竭密切相关。动物实验显示，给大鼠腹腔注射内毒素后，其体内 产量是对照组的 10 倍。临床研究亦表明，感染性休克病人血浆中 代谢产物一硝酸盐和亚硝酸盐的浓 度显著升高。另一方面，抑制 活性可显著改善感染性休克动物及病人血管低反应性，纠正低血压。而且，将小鼠 毒素即不能引起严重低血压。 随着小鼠 们发现 管， 1992） 。将 端（包括启动子）与报告基因融合证明 ， 1993； . J， 1993; W,1993） 。人 端 16结构和调控方式是很复杂的 (E ,1996)。至今已发现多个转录起始位点，具有控制作用的顺式作用元件已经被鉴定了，但是其中涉及的转录因子和功能元件还不是很清楚。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 小鼠 在已经发现参与了 后，在大鼠和小鼠的肺泡巨噬细胞、内皮细胞血管平滑肌细胞也发现了 的调控作用。其中 c 个复合物中还有很多转录因子没有被鉴定。 (等， 1994； 1996) 至于 扰素调节因子 1（ 失的小鼠体内不能 等， 1994） 。通过突变、凝胶阻抑、血清学和 等 1994） 。 至今在 4个转 录因子的结合位点。现在的研究主要集中在位于227 209的低氧效应元件（ 其主要对 皮考啉酸 和缺氧进行响应（ 等， 1995） 。此外，在 反应元件被定位在启动子的 333 48区域。（ ,等， 1996） 病理水平的糖皮质激素可以抑制 在已经报道了多种机制，其中涉及到转录水平和转录后水平的影响。 4可以延迟 成剂量关系。但是巨噬细胞失活因子、 巨噬细胞刺激蛋白 1以及 何调控 等， 1996； 等，1994； 1994; 等， 1991； 1992； 等， 1995. H 等， 1994； 1993） 。 图 1 在小鼠巨噬细胞中，已知的最有效的 缺陷的小鼠中 且低剂量 可以抑制的 体外的研究表明， 降低了 迟了 反，在大鼠血管平滑肌细胞中 抑制了 等， 1994;中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 等 ,1996 ； 1996； A 等， 1994） 。 巨噬细胞中，已经证明了血红素的调控作用。 因血红素的去除导致了 A 等， 1996； . 等， 1994） 。 在小鼠原代巨噬细胞中 是这种修饰剂量关系和功能的意义还不是很清楚。与 蔻酰化 和 棕榈酰化 。在小鼠巨噬细胞中发现大约 50的 电镜下 观察，这些膜结构不同于溶酶体和过氧化酶体。这种胞质体和小泡之间的区分很可能是因为功能之间不同，但是这种假设还需进一步证明（ 等， 1995； 。 功能与调控 生物学功能 一种单核因子，主要是由单核细胞和巨噬细胞产生。有非常广泛的生物学作用（ 等， 2003） 。它可活化单核细胞和巨噬细胞，提高其杀伤活性；可通过上调巨噬细胞 高其抗原递呈能力；还可提高中性粒细胞的吞噬能力，增强超 氧阴离子产生，增强 激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶；活化 挥细胞毒作用（ 等， 1989； 等， 1988； 等， 1992）。 同时， 可以对成脂相关基因具有抑制作用，抑制脂肪细胞分化，促进脂肪分解（ 等， 2004） 。 调节脂肪代谢中具有很重要的功能，在培养的脂肪细胞中， 低了脂蛋白脂酶活性，抑制了脂肪酸的合成过程，并且刺激脂肪分解的增加。此外 在小鼠体内注射 增加了瘦素的含量，而瘦素通过作用于下丘脑摄食中枢减少摄食，增加能量消耗，减少脂肪沉积。 方面通过降低 脂肪组织中脂蛋白脂酶的活性而降低甘油三脂类的清除 率，另一方面增加脂肪脂肪酸的从头合成，造成低密度脂蛋白的增加。 图 1症因子和外界应激对脂肪细胞中调控脂肪代谢和分化关键转录因子的影响 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 转录水平调控 中包括不同革兰式阴性细菌来源的脂多糖、 有趣的是，不同细菌来源的脂多糖制剂可以诱导 如 E. 诱导持续高水平的 P. 关于 要是在体外纯化的巨噬细胞中进行（ 等 , 2002 ;等 ,2000; 等 2003） 。在 表达研究中，尤其在体外，调控在哺乳动物和鱼类十分相似。在体外，单核 /巨噬细胞受刺激 后 小时到 12小时之间。姜勇等研究 表明 成的重要机制。 激单核细胞显著增加 在 激和 外， 异性抑制剂 导的 些结果表明 而基因转录的调控是 姜勇等， 1999； 1992)。 很多研究表明 的特异性抑制以抑制 表达，说明 参与了 录水平的调控（ 2003） 。 转录后水平调控 此外， 认为 成调节的主要机制是在转录后水平。 等， 2002）。这段在 3 间的相互作用来进行转录后的调控。这种结合会导致 （ 等，1990 2002） 。因此， 3 哺乳动物的体外研究中， 录本的半衰期在 40分钟左右(等， 2003)。还有研究表明 ,短暂的氢化可的松（ 100处理巨噬细胞可抑制多种促炎因子基因的表达其中就包括 2003）。 究表明，无论是 氢化可的松预处理还是氢化可的松与 可抑制 此，氢化可的松对促炎因子表达的抑制作用是通过皮质醇糖皮质激素受体复合物与启动子区的固醇反应元件结合或是抑制 诱导的转录实现的。 功能与调控 生物学功能 一种多效性细胞因子，多种淋巴样和某些非淋巴样细胞均可产生 要由单核 激单核细胞产生 些单核巨噬细胞系如 可分泌 机体发生炎症时，单核细胞和巨噬细胞时最早产生 反应细胞，使局部及全身平 升高。 促进细胞分化。 进 B 细胞分化， 分泌和再次免疫应答；促进 化，协同 强 穿孔素基因的表达，并增加 T 细胞 生和 达；可以刺激 T 细胞增殖、活化与存活（ ， 1999； ， 2000）而且可以调节抗原递呈细胞的功能与存活 ( 等 2000)。主要表现在 明显刺激抗原特异性细胞毒性 T 细胞的中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 增殖并抑制童贞 T 细胞的凋亡 (000); 因敲除小鼠不能有效促发特异性 T 细胞反应 ;促树突状细胞自分泌或旁分泌 诱导抗自身抗原的免疫反应（ 等， 2001）。诱导神经细胞和大鼠嗜铬细胞瘤 胞的分化，诱导垂体产生 同 导干细胞分化和巨核细胞成熟，明显促进小鼠骨髓移植后免疫功能的重建；促进 胞的分化和杀伤活性。 制单核细胞 产生，促进 分泌，促进单核细胞和中性粒细胞氧呼吸爆发反应。 节肿瘤细胞生长和分化。 制小鼠 样白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化；抑制黑素 瘤细胞系 腺癌细胞生长。使 胞生长停留在 1期，其机制可能与 响参与细胞周期调控的转录因子的有关。 在炎症反应时 ,为肝细胞刺激因子 ,诱导肝细胞产生急性反应蛋白 ,对宿主自身破坏性炎症起增强作用 （ 张青 等， 2004） 。在多项感染性疾病研究中说明 ,血清 平与疾病严重程度相关 , 用于评价全身炎症反应的程度 ,可作为监测炎症疗效的指标。 也认为检测血清中 细菌性肺炎具有诊断性意义 （ 等， 1995） 。 近期的临床研究 也发现某些自身免疫性疾病 ,如系统性红斑狼疮 (糖尿病部分患者存在 表达。 转录水平表达调控 尽管目前 调控表达、信号转导等已进行了较为深入的研究 ,但主要局限于 B 细胞或 等， 2003）而对于目前已知的抗原递呈细胞的 动子的功能、调控研究较少。目前已知人的 动子 区有 3 个起阳性调控作用的 件 ,它们分别