生物选修基因工程的基本操作程序上课用

1、能够发光的热带能够发光的热带 鱼鱼 基因工程的基本操作程序 （1 1）目的基因的获取 （2 2） （3 3）将目的基因导入受体细胞 （4 4）目的基因的检测与鉴定 基因基因表达载体表达载体的构建的构建 1.1.什么叫基因文库？什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断， 导入到中储存，各个受体菌分别含 有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因组文库：用限制酶切割一种生物的全部DNA ，可以得到大量的DNA片段，然后将这些DNA片段 与载体连接，再转化到细菌中去，让受体菌不停 分裂。这样，每个受体菌包含有特定的基因组 DNA片段，整个受体菌群体就包含这种生物的全 部基因称为

2、基因组文库。 2 2、部分基因文库：、部分基因文库： 部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因 ，这种基因文库叫做部分基因文库，例：cDNAcDNA文 库。用某种生物发育的某个时期的mRNAmRNA为模板， 经反转录酶催化，在体外反转录成cDNAcDNA，与常用 载体噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每 个细菌含有一段cDNAcDNA，并能繁殖扩增，这个受体 菌群体就叫做这种生物的cDNAcDNA文库。 基因组文库的构建模式图 通过对 受体菌 的培养 而储存 基因 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较 cDNA文库和基因组

3、文库的比较 文库类型cDNA文库基因组文库 文库大小小大 基因中启动子无有 基因组中内含子 无有 基因多少某种生物的部分 基因 某种生物的全部 基因 物种间的基因交 流 可以部分基因可以 补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构 非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动， 并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA 聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编

4、码蛋白质。编码蛋白质。 ：能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编 码 区 非 编 码 区 原 核 细 胞 的 基 因 结 构 有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。 非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 启动子终止子 真核细胞的基因结构 编码区非编码区非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子

5、不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子内含子： 外显子外显子： 结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA 结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA 真 核 细 胞 的 基 因 结 构 编码区 非编码区非编码区: : 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列 有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。 非编码序列： 包括非编码区和内含子 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞 不同点不同点 编码区是编码区是 _的的 编码区是间隔的、编码区是间隔的、 _的的 相同点相同点 都由能够编码蛋白质的都由能

6、够编码蛋白质的_ _ _ 和具和具 有调控作用的有调控作用的_ 区组成的区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与 真核细胞基因结构一样长吗？真核细胞基因结构一样长吗？ 连续连续不连续不连续 编码区编码区 非编码非编码 依据：目的基因的有关信息依据：目的基因的有关信息 如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性 （1 1）从基因组文库中获取：）从基因组文

7、库中获取： 限制酶限制酶 供体细胞中的供体细胞中的DNADNA 许多许多DNADNA片段片段 运载体运载体 与载体连接与载体连接 受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状 导入导入 外源外源DNADNA扩增扩增 目的基因目的基因 分离分离 以目的基因转录成的信使RNARNA为模板，再反转录酶的 催化下反转录成互补的单链DNADNA，然后在DNADNA聚合酶的作用 下合成双链DNADNA，即cDNAcDNA，从而获得所需的基因。 （2 2）从部分基因文库中获取（例cDNAcDNA文库的构建 方法） 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点优点缺点缺点 从

8、基因组文库中 获取 从部分基因文库 中获取 根据已知氨基根据已知氨基 酸合成酸合成DNADNA法法 操作简便操作简便 广泛使用广泛使用 工作量大，盲目，专一性工作量大，盲目，专一性 差，分离出来的有时并非差，分离出来的有时并非 一个基因一个基因 专一性强专一性强 操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不很不 稳定，要求的技术条件较稳定，要求的技术条件较 高高 专一性最强专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少仅限于合成核苷酸对较少 的简单基因，适用范围小的简单基因，适用范围小 称多聚酶链式反应 穆里斯等人于1988年发明的。 PCR是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术。 123

9、45 22 55 72 94 时间（min） 温度 （） PCR反应 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复13步 2530轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNADNA双螺旋双螺旋 DNADNA单链单链 与引物复性与引物复性 DNADNA变性 变性 形成形成2 2条单链条单链 子链延伸子链延伸 DNADNA加倍加倍 模板DNA 95 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点50 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶

10、() 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95 50 72 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72 第2轮结束 PCR的基本反应步骤 变性 90-95C 延伸 70-75C 复性复性55-60C PCRPCR总结总结： 变性：加热至90 95双链DNA解链成 为单链DNA 复性：冷却至55 60部分引物与模 板的单链DNA的特定 互补部位相配对和 结

11、合 延伸：加热至70 75以目的基因为 模板，合成互补的 新DNA链 变性 复性 延伸 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 前提条件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。 原理：_ 方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_ _ _（n n为扩增为扩增 循环的次数）循环的次数） 结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 DNA引物 热稳定DNA聚合酶 指数指数 2 2n n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 模板DNA PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCRPCR技

12、术技术DNADNA复制复制 相相 同同 点点 原理原理 原料原料 条件条件 不不 同同 点点 解旋解旋 方式方式 场所场所 酶酶 结果结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下 变性解旋 解旋酶催化 体外复制细胞核内 热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段形成整个DNA分子 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n

13、循环次数 从基因文库中获取从基因文库中获取 利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成 归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端黏性末端 同一种限制酶同一种限制酶 相同的黏性末端相同的黏性末端 切口切口 D

14、NADNA连接酶连接酶 1.过程: 二基因表达载体构建 核心 质粒质粒DNADNA分子分子 限制酶处理 一个切口一个切口 两个黏性末端两个黏性末端 两个切口两个切口 获得目的基因获得目的基因 DNADNA连接酶连接酶 重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 同一种 过程过程: : 2.构建基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败， 才获得成功。才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因插入载插入载

15、体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗 虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子 ( (抗虫基因首端抗虫基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉，导入棉花受精卵，长成的棉 花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动 子、抗虫基因的质粒中插入子、抗虫基因的质粒中插入终止子终止子( (抗虫基因末抗虫基因末 端端) )，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了 抗虫能力。抗虫能力。 作为基因工程表达载体

16、， 只需含有目的基因就可以完成任务 吗？为什么？（P15） 不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达 并发挥作用，还需要有其他控制元件，如 启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自 身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将 编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一 些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率 的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任 何位置(上游或下游

17、)上都发挥作用。）等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的 什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做 成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白 基因等。 3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 调节基 因 操纵基 因 结构基因 RNA聚合酶 半乳糖苷酶 酶 酶 RNA聚合酶 启动子 RNA聚合酶 启动子启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断， 它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能 驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 思考思考1 1： 表达载体为什么一定要有启动子？表

18、达载体为什么一定要有启动子？ （1 1）生物之间进行基因交流，只有使 用受体生物自身基因的启动子才能有 利于基因的表达； （2 2）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没 有启动子，只将编码序列导入受体细 胞无法转录。 思考思考2：终止子的作用是什么？终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特 殊的DNADNA片断，能终止mRNAmRNA的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目 的基因，从而将有目的基因的细胞筛选 出来。 思考3：标记基因有什么作用？ 载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分 DNADNA片段。表达载

19、体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止 子三部分结构。子三部分结构。 注意 用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连连 接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷 酸二酯键。酸二酯键。 启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。 目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方必需以表达载体的方 式携带进去。式携带进去。 基 因 工 程 技 术 路 线 三

20、、将目的基因导入受体细胞 借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。 （一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程 受体细胞 稳定表达 （二） 方法 将目的基因导入将目的基因导入 植物细胞植物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 动物细胞动物细胞 将目的基因导入将目的基因导入 微生物细胞微生物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 显微注射法显微注射法 感受态细胞感受态细胞 1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管

21、通道法花粉管通道法 （1）农杆菌转化法 特点： 易感染双子叶植物和裸 子植物，对大多数单子叶植 物没有感染能力 原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞， 并整合到受体细胞染色体的DNA上。 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表 达 载 体 导入 植 物 细 胞 插入植物细胞 染色DNA 表达 新 性 状 转入 农 杆 菌 基因枪法又称微基因枪法又称微 弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压 缩气体产生的动力缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表 面的表达载体面的表达载体DNADNA打打 入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目 的基因与其整合并表的基因与其整合并表 达

22、的方法。达的方法。 （2）基因枪法 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头 上萌发后，花粉管要 穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形 成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后， 滴加DNA（含目的基 因），使目的基因借 助花粉管通道进入受 体细胞。 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄 蕊 雌 蕊 2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 （1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提 纯，用显微仪注射到受精卵中） （2）操作程序: 提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体 取受精卵取受精卵 显微注射显微注射 移植到子宫移植到子宫 受精卵

23、发育受精卵发育 新性状动物新性状动物 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：过程： Ca2+处理大肠 杆菌 感受态细 胞 表达载体与感 受态细胞混合 感受态细胞感受态细胞 吸收吸收DNADNA 3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 思考：为什么要用思考：为什么要用 Ca2+处理受体细胞？处理受体细胞？ 用用CaCa2 2 处理，增加细菌细胞 处理，增加细菌细胞 壁的通透性壁的通透性 培养培养 培养培养 培养培养 导入导入 含目的基因的重组质粒导入大肠杆

24、菌含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌 含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完全培养基的完全培养基 含有四环素的含有四环素的 完全培养基完全培养基 两种培养基均不能生长大肠杆两种培养基均不能生长大肠杆 菌菌 Ca2+ 处理细胞处理细胞 形成感受态细胞形成感受态细胞 检测检测 （培养不具有氨苄青霉素（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌） 只有氨苄青霉素只有氨苄青霉素 抗性基因质粒抗性基因质粒 只具有氨苄青霉素只具有氨苄青霉素 抗性基因大肠杆菌抗性基因大肠杆菌 不具有氨苄青霉不具有氨苄青霉 素素 抗性基因和抗性基因和 四环素抗性积基四环素抗性积基

25、因的大肠杆菌因的大肠杆菌 完全培养基完全培养基 导入导入 接种培养接种培养 接种培养接种培养 接种接种 培养培养 含有四环素的含有四环素的 完全培养基完全培养基 完全培养基完全培养基 大肠杆菌不含大肠杆菌不含 抗四环素基因抗四环素基因 证明：证明： 不存活不存活 含有四环素的含有四环素的 完全培养基完全培养基 证明：证明： 大肠杆菌大肠杆菌 的受体细胞含的受体细胞含 有目的基因有目的基因 四环素四环素 抗性基因抗性基因 四环素四环素 抗性基因抗性基因 存活存活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 存活存活 导入导入 接种接种 培养培养 接种接种 培

26、养培养 接种接种 培养培养 接种接种 培养培养 含有四环素的含有四环素的 完全培养基完全培养基 完全培养基完全培养基 大肠杆菌不含大肠杆菌不含 抗四环素基因抗四环素基因 证明：证明： 不存活不存活 含有四环素的含有四环素的 完全培养基完全培养基 证明：证明： 大肠杆菌含抗大肠杆菌含抗 四环素基因四环素基因 证明：证明： 大肠杆菌大肠杆菌 的受体细胞含的受体细胞含 有目的基因有目的基因 四环素四环素 抗性基因抗性基因 四环素四环素 抗性基因抗性基因 完全培养基完全培养基 存活存活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 受体生物受体生物 植物植物 动物动

27、物 微生物微生物 受体细胞受体细胞 导入方法导入方法 受精卵 体细胞 受精卵 细胞/个体 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注 射技术 用Ca2+处理成 感受态细胞 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确 的是（） A.将毒素蛋白注射到受精卵中 B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细 菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并 进入受精卵 D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 检测检测: : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否转录

28、是否转录 是否翻译是否翻译 鉴定鉴定: : 分子水平鉴定分子水平鉴定 个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定 1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA； （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记, ,以此做以此做 探针探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示出杂交带若显示出杂交带, ,表明表明 染色体已插入染色体染色体已插入染色体D

29、NADNA中。中。 （一）检测 ： 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子分子 的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的 碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在 一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列 的部位，仍然是两条游离的单链。的部位，仍然是两条游离的单链。 （二）鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法:分 子 杂 交 方法: 抗原-抗体杂交 过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出 现杂交带,表

30、明目的基因转录出了mRNA。 提取 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注 射小鼠体内 从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出 血液分离出抗血液分离出抗Bt 毒素的抗体毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现 杂交带 脱分化 组织培养 怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？ 没有抗虫基因 的棉植株 有抗虫基因的 棉植株 棉铃虫 虫没有死 虫被杀死 没有表达 目的基 因表达 鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基 因未表达。

31、如虫吃后中因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。 类类 型型 步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示 分分 子子 检检 测测 第一第一 步步 目的基因是否进目的基因是否进 入受体细胞入受体细胞 DNADNA分子杂交分子杂交 （DNADNA和和DNADNA之间）之间） 是否成功显示是否成功显示 出杂交带出杂交带 第二第二 步步 目的基因是否转目的基因是否转 录出录出mRNAmRNA 分子杂交技术分子杂交技术 （DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间） 是否成功显示是否成功显示 出杂交带出杂交带 第三第三 步步 目的

32、基因是否翻目的基因是否翻 译出蛋白质译出蛋白质 抗原抗原抗体杂交抗体杂交 是否成功显示是否成功显示 出杂交带出杂交带 个个 体体 水水 平平 鉴鉴 定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及 抗性的程度；抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是 否相同等。否相同等。 提示： DNA分子杂交技术首先提取受体细 胞中的DNA，然后高温解成单链，再与 同位素标记的DNA探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是 用表达出的蛋白质注射动物进行免疫， 产生相应的抗体，并提取出而来的。 归

33、纳: : 基因工程的基本操作程序 1.1. 获取目的基因获取目的基因 u 从基因文库从基因文库 u 利用利用PCRPCR u 化学方法人工合成化学方法人工合成 2.2. 构建基因表达载体构建基因表达载体 u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因 3.3. 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 u 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法 （动物）（动物） 4.4. 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译 为什么要构建基因文库？直接从含有

34、目的基因的 生物体内提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是 唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可 以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获 得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得， 不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只 知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得 许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有 多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不 同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物 的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面 有关细胞器功能的知

35、识，结合基因工程操作程序的 基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以 用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质 网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存 在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在 大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。 寻根问底： 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机 理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单 子叶植物的原因吗?若将

36、一个抗病基因导入小麦中, 理论上讲你应该怎样做? 要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌 菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组 织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的 基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。 酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合 成，通常不存在于单子叶植物中 4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异 常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如 让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白， 想一想，应如何进行设计？ （1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。 （2）将cDNA前

37、接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外 加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在 含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入 大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果 培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入 其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破 碎后从中提取-珠蛋白。 检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的 基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交， 看是否有杂交带。 检测是否转录出了mRNA，利用分子杂交技术，目的基因 DNA一条链（作探针）与受体细胞中提

38、取的mRNA杂交，看 是否有杂交带。 检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗 原抗体杂交，看是否有杂交带。 还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。 提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然 后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质 注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 放 射 自 显 影 照 片 DNA链末端合成终止法 1.1.下列有关PCRPCR过程的叙述中不正确的是（ ） A A变性过程中破坏的是DNADNA分子内碱基对之间的氢 键，也可利用解旋酶实现 B B复性过程

39、中引物与DNADNA模板链的结合是依靠碱基 互补配对原则完成 C C延伸过程中需要DNADNA聚合酶、ATPATP、四种核糖核苷 酸 D DPCRPCR与细胞内DNADNA复制相比所需要酶的最适温度较 高 C 3.PCR技术扩增技术扩增DNA,需要的条件是（需要的条件是（ ） 目的基因目的基因 引物引物 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶等聚合酶等 mRNA 核糖体核糖体 A、 B、 C、 D、 A 2.2.获取目的基因的方法有多种，下列获取目的基因的方法有多种，下列 不属于目的基因获取方法的是（不属于目的基因获取方法的是（ ） A A、从基因组文库中获取、从基因组文库中获取 B B、

40、从、从cDNAcDNA文库中获取文库中获取 C C、从含目的基因生物细胞中获取、从含目的基因生物细胞中获取 D D、利用、利用PCRPCR技术获取技术获取 C 2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母 绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白 基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基 因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达 出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在 该研究中的主要作用是 A追踪目的基因在细胞内的复制过程 B追踪目的基因插入到染色体上的位置 C. 追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 D追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构。 C 继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器 的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基 因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合