大肠杆菌质粒和噬菌体

1、大肠杆菌、质粒和噬菌体郑丽舒 中国疾控中心 病毒病预防控制所2015.04.15一、大肠杆菌：一、大肠杆菌：概述概述 应用应用 基本操作基本操作二、质粒：二、质粒：常见质粒常见质粒 质粒的分离纯化质粒的分离纯化 感受态细胞感受态细胞 质粒转化质粒转化三、噬菌体：三、噬菌体：噬菌体及其载体噬菌体及其载体 M1313噬菌体及其载体噬菌体及其载体四、分子克隆四、分子克隆主主 要要 内内 容容大肠杆菌大肠杆菌 大肠杆菌大肠杆菌中文名称：中文名称：大肠杆菌大肠杆菌外文名称：外文名称：Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)界：界：原核生物界原核生物界门：门：变形

2、菌门变形菌门(Bacteria)纲：纲：-变形菌纲变形菌纲(Proteobacteria)目：目：肠杆菌目肠杆菌目(Enterobacteriales)科：科：肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)属：属：埃希氏菌属埃希氏菌属(Escherichia)种：种：大肠杆菌种大肠杆菌种(E. coli)大肠杆菌一般特征大肠杆菌一般特征 原核生物，原核生物，G G- -棒状杆菌棒状杆菌( (红色红色) ) 有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜 DNADNA长度约为体长的长度约为体长的10001000倍倍 染色体是长约染色体是长约30kb30kb的环状的

3、环状dsDNAdsDNA 生长需求非常简单，在仅含碳水化合物生长需求非常简单，在仅含碳水化合物 和少量氮源及无机盐的培养基上即可生长和少量氮源及无机盐的培养基上即可生长 主要寄生于大肠内，约占肠道菌主要寄生于大肠内，约占肠道菌1%1%，正常栖居条件下不致病，正常栖居条件下不致病大肠杆菌大肠杆菌水分水分 70% 70%蛋白蛋白质质 15% 15%碳水化合物碳水化合物 3% 3%RNARNA 6% 6%DNADNA 1% 1%矿物离子矿物离子 1% 1%其他成分其他成分 4% 4%EscherichEscherich在在18851885年发现年发现E.coliE.coli，广泛存在于人和温血动物肠

4、道中，广泛存在于人和温血动物肠道中，44.544.5发酵乳糖产酸产气。最初认为是非致病菌。发酵乳糖产酸产气。最初认为是非致病菌。2020世纪中叶，认识世纪中叶，认识到一些特殊血清型到一些特殊血清型E.coliE.coli对人和动物致病，引起严重腹泻和败血症。对人和动物致病，引起严重腹泻和败血症。根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌分为根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌分为6 6类：类：肠致病性大肠杆菌（肠致病性大肠杆菌（EPECEPEC）肠产毒性大肠杆菌（肠产毒性大肠杆菌（ETECETEC）肠侵袭性大肠杆菌（肠侵袭性大肠杆菌（EIECEIEC）肠出血性大肠杆菌（肠出血性大肠杆菌（EHECEHEC

5、）肠黏附性大肠杆菌（肠黏附性大肠杆菌（EAECEAEC）弥散粘附性大肠杆菌（弥散粘附性大肠杆菌（DAECDAEC）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌在分子生物学中的应用大肠杆菌在分子生物学中的应用 生物工程用菌株：生物工程用菌株：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为株系一般称为“工程菌工程菌”。大肠杆菌是应用最广泛最成功的首选高效表达大肠杆菌是应用最广泛最成功的首选高效表达体系；美国体系；美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物。批准为安全的基因工程受体生物。 背景清楚：背景清楚：全基因组测序，共有全基因组测序，共有4405

6、4405个个ORFORF。遗传背景清楚，并经过一系列。遗传背景清楚，并经过一系列突变筛选，使外源突变筛选，使外源DNADNA在胞内不易发生重组或修饰，更适于基因操作。在胞内不易发生重组或修饰，更适于基因操作。 生物安全：生物安全：生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，在自然条件下无法生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，在自然条件下无法生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也可避免对自然界造成危害。实验室流出，也可避免对自然界造成危害。 菌株基因优化：菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都

7、被优化过，使之带有不同基因型生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如（例如半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 操作简便，表达量高：操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%80%。 大肠杆菌在分子生物学实验中的应用大肠杆菌在分子生物学实验中的应用缺点：缺点： 基因结构差异：基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因大多数真核基因含有内含子，细

8、菌中没有除去内含子机制，外源基因编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5 5非编码区非编码区 原核：原核：CDNA CDNA 真核：真核：DNADNA 转录信号不同：转录信号不同：真核基因转录的真核基因转录的mRNAmRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的分子不具有结合细菌核糖体所必须的SDSD序列序列 细菌细菌RNARNA聚合酶不能识别真核生物启动子聚合酶不能识别真核生物启动子 SDSD序列（序列（Shine-Dalgarno sequenceShine-Dalgarno sequence）：）：细菌细菌mRNAmRNA起始密码子起始密码子AUG

9、AUG上游上游1010个碱基处，个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA316SrRNA3端识别，结合原核生物核糖体，端识别，结合原核生物核糖体，帮助从起始帮助从起始AUGAUG处开始翻译。处开始翻译。大肠杆菌在分子生物学实验中的应用大肠杆菌在分子生物学实验中的应用 mRNAmRNA的分子结构差异：的分子结构差异：绝大多数真核绝大多数真核mRNAmRNA分子的分子的3 3 末端有末端有poly(A)poly(A)尾巴，在尾巴，在5 5 末端有一个帽结构。真核末端有一个帽结构。真核mRNAmRNA不能结合到细菌核糖上。不能结合到细菌核糖上。 缺

10、乏对真核生物蛋白质的缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工修饰加工系统：表达的蛋白质不能进行糖系统：表达的蛋白质不能进行糖基化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而基化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的蛋白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能复性功能）。）。 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，表达的蛋白大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，表达的蛋白经常是不溶的，表达蛋白量超过菌体总蛋白经常是不溶的，表达蛋白量超过菌体总蛋白10%10%时，容易形成时，容易形成包涵体包

11、涵体。 细胞周质中有种类繁多的内毒素很难除去，细菌的蛋白酶可以细胞周质中有种类繁多的内毒素很难除去，细菌的蛋白酶可以识别识别降解降解真核生物的蛋白质产物。真核生物的蛋白质产物。 加拿大人加拿大人Frederick BantingFrederick Banting和和Charles BestCharles Best于于19211921年首先发现胰岛素年首先发现胰岛素，19221922年开始用于临床，年开始用于临床，19231923年或诺贝尔奖。年或诺贝尔奖。19651965年年9 9月月1717日，中国科学家日，中国科学家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。第一个在实验室中

12、人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。 人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随着细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰着细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为岛素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌基因工程菌。 应用实例应用实例胰岛素由胰岛素由A A、B B两个肽链组成。两个肽链组成。A A链有链有1111种种2121个氨基酸，个氨基酸，B B链有链有1515种种3030个氨基酸，

13、个氨基酸，共共5151个氨基酸组成。个氨基酸组成。其中其中A7-B7A7-B7、A20-B19A20-B19四个半胱氨酸四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使中的巯基形成两个二硫键，使A A、B B链连接起来。链连接起来。A A链中链中A6A6与与A11A11之间也存在二硫键。之间也存在二硫键。 大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的培养与保存 LBLB培养基培养基是大肠杆菌最常用的培养基。其它培养基都是在此基础上是大肠杆菌最常用的培养基。其它培养基都是在此基础上有所加减。有所加减。LBLB一般被解释为一般被解释为Luria-BertaniLuria-Bertani培养基，其发明人培养基，其发明人Gi

14、useppe Giuseppe BertaniBertani认为这个名字来源于英语的认为这个名字来源于英语的lysogeny brothlysogeny broth，即溶菌肉汤。，即溶菌肉汤。 酵母提取物：碳源，能源，磷酸盐酵母提取物：碳源，能源，磷酸盐 蛋白胨：氮源蛋白胨：氮源 氯化钠：无机盐氯化钠：无机盐 液体液体LBLB培养基：培养基：每升含每升含胰蛋白胨胰蛋白胨1010克，克，酵母提取物酵母提取物5 5克，克，氯化钠氯化钠1010克，高压克，高压灭菌灭菌1515磅磅3030分钟。分钟。 固体固体LBLB培养基：培养基：基本同上，加基本同上，加琼脂琼脂1515克克/ /升。高压灭菌后，冷

15、却至升。高压灭菌后，冷却至5050左右左右，可根据需要加入适当的抗菌素或其它试剂，混匀后倒入平皿中。，可根据需要加入适当的抗菌素或其它试剂，混匀后倒入平皿中。 半固体半固体LBLB培养基：培养基：基本同上，基本同上，琼脂浓度为琼脂浓度为6 6克克/ /升升。高压后室温保存备用。使。高压后室温保存备用。使用前在水浴或微波炉溶化。用前在水浴或微波炉溶化。常用培养基常用培养基 准备：准备：取取2-52-5毫升液体毫升液体LBLB培养基，到无菌培养管中；培养基，到无菌培养管中； 挑菌：挑菌：用接种环从培养板上挑取单个菌落，接种到用接种环从培养板上挑取单个菌落，接种到培养基中。要先蘸取少许液体在管壁将菌

16、落研磨培养基中。要先蘸取少许液体在管壁将菌落研磨开，再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中；开，再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中； 培养：培养：盖上盖子，保证通气。盖上盖子，保证通气。3737摇床摇床 60rpm 60rpm，培，培养过夜养过夜; ; 转接转接: :1:1001:100转种到培养瓶中，通常转种到培养瓶中，通常250ml250ml培养瓶中加培养瓶中加培养液不超过培养液不超过100ml100ml。3737摇床（摇床（250rpm250rpm）培养，）培养，直至细菌生长到所需密度。直至细菌生长到所需密度。大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的液体培养大肠杆菌的液体培养 将一

17、定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。作出的曲线称为生长曲线。 该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为般分为延缓期、对数期、稳定期、衰亡期延缓期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期，各时期的长四个时期，各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。大肠杆菌生长

18、曲线大肠杆菌生长曲线 用接种环蘸取少许细菌培养液，或从固体培养平板的菌落上蘸取少用接种环蘸取少许细菌培养液，或从固体培养平板的菌落上蘸取少许细菌，从平板的一侧开始划线；许细菌，从平板的一侧开始划线； 消毒接种环，从刚划过的部位带过并在旁边继续划线；消毒接种环，从刚划过的部位带过并在旁边继续划线； 如上重复如上重复3 34 4次，直至划满平板。这样可以确保分离出单个菌落。次，直至划满平板。这样可以确保分离出单个菌落。在固体培养基上培养在固体培养基上培养大肠杆菌的培养与保存大肠杆菌的培养与保存 在小玻璃瓶或试管中加入三分之二体积的在小玻璃瓶或试管中加入三分之二体积的LBLB半固体培养基；半固体培养

19、基； 用接种针从固体培养板上挑取单个菌落，反复刺入琼脂中；用接种针从固体培养板上挑取单个菌落，反复刺入琼脂中； 置置3737培养培养8-128-12小时，直至可看到细菌生长呈雾状；小时，直至可看到细菌生长呈雾状； 拧紧盖子，置拧紧盖子，置15-2215-22暗处保存。一般可保存数年；暗处保存。一般可保存数年； 复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂，划线到复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂，划线到LBLB平板上。平板上。菌株的保存与复苏菌株的保存与复苏穿刺保存穿刺保存 取新鲜饱和的或生长到对数生长中期的细菌培养液，加入灭菌的甘取新鲜饱和的或生长到对数生长中期的细菌培养液，加入灭菌的甘油至终浓度油至终浓度1

20、5%15%（或（或7% DMSO7% DMSO），混合均匀。），混合均匀。 分装到冻存管中，保存在分装到冻存管中，保存在-70-70。如条件所限，亦可保存在。如条件所限，亦可保存在-20-20，但保存时间较短。但保存时间较短。 复苏时，用接种环从上面刮取少许菌液，注意要避免反复冻融。然复苏时，用接种环从上面刮取少许菌液，注意要避免反复冻融。然后划线到后划线到LBLB平板上。平板上。菌株的保存与复苏菌株的保存与复苏冷冻保存冷冻保存 质粒（质粒（plasmidplasmid）是染色体以外能）是染色体以外能 自主复制的遗传因子自主复制的遗传因子 不具有胞外期不具有胞外期 对寄主细胞来说是非必需的对寄

21、主细胞来说是非必需的质粒概述质粒概述符合这三条标准的染色体外符合这三条标准的染色体外DNADNA或或RNARNA分分子都可以称为质粒。子都可以称为质粒。狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的环状环状DNADNA分子。分子。质粒的命名：一个小写字母质粒的命名：一个小写字母p p加加2-32-3个大个大写字母和数字，如写字母和数字，如pBV220pBV220，pET30pET30。 质粒质粒DNADNA的构型：的构型： SCSC型型 共价闭合环形共价闭合环形DNADNA（cccDNAcccDNA） OCOC型型 开环开环DNADNA（ocDNAocDNA） L L 型

22、型 线性线性DNADNA（L DNAL DNA）质粒概述质粒概述LSCOC 常见质粒种类：常见质粒种类： 细菌质粒细菌质粒 真核生物真核生物DNADNA质粒质粒 真核生物真核生物RNARNA质粒质粒质粒概述质粒概述质粒概述质粒概述细菌质粒细菌质粒携带有数个到数十个甚至上百个基因。携带有数个到数十个甚至上百个基因。功能：功能：一些基因可产生毒素、一些基因可产生毒素、抗药性抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。、固氮、产生酶类、降解功能等。分类：分类：重组：重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生存在范围：存在范围：如如E.coliE.coli、Shigella

23、Shigella、S.aureusS.aureus、Streptococcus lactisStreptococcus lactis等等细菌质粒性质：细菌质粒性质： 1 1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），（游离态），也可以通过也可以通过交换掺入染色体上，以交换掺入染色体上，以附加体（附加体（episomeepisome）的形式存在；的形式存在；细菌质粒性质：细菌质粒性质： 2 2、质粒是一种、质粒是一种复制子（复制子（repliconreplicon），根据自我复制能力的不同，可把，根据自我复制能力的不同，可把 质粒复制的控制形式分为

24、严紧型和松弛型两种；质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种；严紧型质粒严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体的复制受细胞核控制，与染色体DNADNA复制相伴随，一般一个寄复制相伴随，一般一个寄主细胞内只有少数几个（主细胞内只有少数几个（1-51-5）个拷贝；）个拷贝；松弛型质粒松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体的复制不受细胞核控制，在染色体DNADNA复制停止的情况下仍可复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-20010-200个或更多。如果用一定的药个或更多。如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。物处

25、理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。pBR322pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。严紧型严紧型松弛型松弛型细菌质粒性质：细菌质粒性质：3、可以通过可以通过转化转化（直接吸收摄入）（直接吸收摄入）、转导、转导（噬菌体载体）（噬菌体载体）或接合或接合作用作用( (通通过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换) )由一个细胞转移到另一个细胞，由一个细胞转移到另一个细胞，使两个细胞都带有质粒；质粒转移时，可以单独转移，也可以携带着染色使两个细胞都带有质粒；质粒转移时，可以单独转移

26、，也可以携带着染色体（片段）一起转移，所以可成为基因工程载体。体（片段）一起转移，所以可成为基因工程载体。细菌质粒性质：细菌质粒性质：4 4、质粒的不亲合性质粒的不亲合性定义：定义：在没有选择压力的情况下，在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不两种亲源关系密切的不同质粒，不能在同一寄主细胞系中稳定共存。能在同一寄主细胞系中稳定共存。分子基础分子基础: :主要是由于复制功能之主要是由于复制功能之间相互干扰造成。有相似的复制子间相互干扰造成。有相似的复制子结构，受到同一拷贝数控制系统的结构，受到同一拷贝数控制系统的干扰，使两种质粒最终拷贝数不同干扰，使两种质粒最终拷贝数不同，拷贝数

27、多的质粒在以后的分裂中，拷贝数多的质粒在以后的分裂中更占优势。更占优势。ColE1ColE1、pMB1;pMB1;pSC101pSC101、F F、RP4RP4；p15A,p15A,衍生质粒衍生质粒细菌质粒性质：细菌质粒性质： 5 5、质粒对于细菌的生长不是必须的、质粒对于细菌的生长不是必须的代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（1 1）F F因子，又称致育因子或性因子，因子，又称致育因子或性因子，626210106 6DaltonDalton，94.5kb94.5kb，环状双链，环状双链DNADNA，编码，编码9494个中等大个中等大小多肽，其中小多肽，其中1/31/3基因（基因（tratra区）

28、与接合作用有关。区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。F F质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成：质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成：（1 1）转移区（）转移区（2 2）复制区（）复制区（3 3）重组区，）重组区，通过和宿主染色体上的通过和宿主染色体上的ISIS同源重组或通过同源重组或通过转座，转座，F F因子可以整合到宿主不同位点上。因子可以整合到宿主不同位点上。由于宿主染色体上由于宿主染色体上ISIS方向不同，所以整合方向不同，所以整合的方向也随之不同

29、。的方向也随之不同。F因子（因子（fertility factor）根据大肠杆菌细胞内有无根据大肠杆菌细胞内有无F F质粒及其在细胞内存质粒及其在细胞内存在状态可将细胞分为四种类型：在状态可将细胞分为四种类型： F F+ + 菌株：菌株：F F因子独立存在，细胞表面有性菌毛，为带有因子独立存在，细胞表面有性菌毛，为带有F F质粒的雄性细胞质粒的雄性细胞 F F- - 菌株：菌株：无无F F因子，无性菌毛，但可以通过接合作用接收因子，无性菌毛，但可以通过接合作用接收F F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌株（F F+ +）。）。 HfrHfr菌株菌株( (高频重组菌株高频重组菌株) )：F F

30、因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，细胞表面有性菌毛上，细胞表面有性菌毛 FF菌株：菌株：F F质粒从质粒从HfrHfr菌染色体上脱落时，会出现一定概菌染色体上脱落时，会出现一定概率的错误，使率的错误，使F F质粒带上宿主染色体，这种特殊质粒带上宿主染色体，这种特殊的的F F质粒称为质粒称为FF质粒。质粒。 代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（1 1）代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（2 2）：）：R R因子（因子（resistanceresistance），抗药因子），抗药因子，带，带R R因子的细菌有大肠杆菌、沙因子的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌等门氏菌、志贺氏菌、绿

31、脓杆菌等G G- -菌，菌，60-90%60-90%的的G G- -菌耐药性由菌耐药性由R R因子因子转移。转移。 R R因子是细胞质粒，使寄主菌对链因子是细胞质粒，使寄主菌对链霉素、氯霉素、四环素等抗菌素或霉素、氯霉素、四环素等抗菌素或磺胺剂产生抗药性的基因群。和磺胺剂产生抗药性的基因群。和F F因子一样，通过接合进行转移，获因子一样，通过接合进行转移，获得该因子的细菌获得对多种药剂的得该因子的细菌获得对多种药剂的抗性，给治疗带来很大麻烦。抗性，给治疗带来很大麻烦。环状环状dsDNAdsDNA，包括，包括抗性转移因子抗性转移因子和和抗性决定因子抗性决定因子，R R因子在细胞内的因子在细胞内的

32、copycopy数从数从1-21-2个到几十个，分为严个到几十个，分为严紧型和松弛型，经氯霉素处理，松紧型和松弛型，经氯霉素处理，松弛型质粒可达弛型质粒可达2000-30002000-3000个个/ /细胞。细胞。R因子（因子（resistence factor）代表性细菌质粒（代表性细菌质粒（3 3）：）：ColCol因子，产大肠杆菌素因子因子，产大肠杆菌素因子，编码合，编码合成大肠杆菌素成大肠杆菌素, , 通过抑制复制、转录通过抑制复制、转录、转译或能量代谢而专一性地杀死不、转译或能量代谢而专一性地杀死不含含ColCol因子的其他肠道细菌。因子的其他肠道细菌。ColCol因子可分为两类：因

33、子可分为两类： ColE1ColE1：无接合作用，松弛型多：无接合作用，松弛型多copycopy；用于重组用于重组DNADNA研究和体外复制系统。研究和体外复制系统。ColIbColIb：与：与F F因子相似，通过接合作用因子相似，通过接合作用转移，严紧型控制，只有转移，严紧型控制，只有1-21-2个个copycopy。 Col 因子（因子（colicinogenic factor）真核生物真核生物DNA质粒质粒环状环状DNADNA质粒：质粒：酵母质粒，植物线粒体中的环状酵母质粒，植物线粒体中的环状DNADNA质粒，人质粒，人和动物的核和动物的核DNADNA质粒等，都是不知其功能的隐蔽质粒。质

34、粒等，都是不知其功能的隐蔽质粒。线状线状DNADNA质粒：质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNADNA质粒，植物线质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状粒体中与雄性不育有关的线状DNADNA质粒。质粒。真核生物真核生物RNA质粒质粒有壳体的有壳体的dsRNAdsRNA质粒：质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNAds

35、RNA质粒。与质粒。与RNARNA病毒的主要区别是它们不具有感染性病毒的主要区别是它们不具有感染性无壳体的无壳体的dsRNAdsRNA质粒：质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNAdsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNAdsRNA质粒。质粒。 把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞）把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就，需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（叫做载体（vectorvector）。）。 基因工程所用的

36、基因工程所用的vectorvector实际上是实际上是DNADNA分子，携带目的基因分子，携带目的基因片段进入受体细胞的片段进入受体细胞的DNADNA。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。分子生物学实验中常用质粒载体分子生物学实验中常用质粒载体多克隆位点多克隆位点是含有多个内切酶识别位点是含有多个内切酶识别位点的一段的一段DNADNA序列，便于外源序列，便于外源DNADNA片段的插片段的插入，而且不会影响质粒本身的稳定。入，而且不会影响质粒本身的稳定。复

37、制子复制子是含有是含有DNA复制起始位点的一段复制起始位点的一段DNA序列序列，也包括复制必需的，也包括复制必需的RNA和蛋白质的编码基因。和蛋白质的编码基因。复制子决定质粒复制是严紧型还是松弛型。原核复制子决定质粒复制是严紧型还是松弛型。原核生物生物DNA有一个有一个ori ，真核生物，真核生物DNA有多个有多个ori 。选择标记选择标记通常为抗生素耐药基因，通常为抗生素耐药基因，如如Amp+Amp+，Kan+Kan+抗性基因；或产生易抗性基因；或产生易于辨认的颜色，如半乳糖苷酶、荧于辨认的颜色，如半乳糖苷酶、荧光素酶等基因。光素酶等基因。按功能分成：按功能分成：（1）克隆载体：都有一个松弛

38、的复制子，能带动外源基因，在宿主细）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。片段（基因）的载体。（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（如）表达载体：具有克隆载体的基本元件（如ori，Ampr，Mcs等）等）还具有转录还具有转录/翻译所必需的翻译所必需的DNA顺序的载体。顺序的载体。 在大肠杆菌生产外源蛋白的表达载体在大肠杆菌生产外源蛋白的表达载体 要含有适当的原核启动子，转录终止信号。要含有适当的原核启动子，转录终止信号。 在真核细胞生产外源蛋白的表达载体在真核细胞生产外源蛋白的表达载体

39、 除含有适当的真核启动子，转录终止信号外，除含有适当的真核启动子，转录终止信号外， 还应含有内含子剪切序列和还应含有内含子剪切序列和polyA加尾信号。加尾信号。载体分类载体分类载体分类载体分类按进入受体细胞类型分：按进入受体细胞类型分：（1）原核载体）原核载体（2）真核载体）真核载体 （3）穿梭载体（）穿梭载体（shuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，要含有指在两种宿主生物体内复制的载体分子，要含有不同系统可识别的复制起点，因而可以运载目的基因。不同系统可识别的复制起点，因而可以运载目的基因。质粒载体的选择质粒载体的选择构建重组构建重组DNA的目的：的目的： 克隆

40、扩增：选择合适的克隆载体克隆扩增：选择合适的克隆载体pGEM-T, pBluescript 蛋白表达：原核细胞表达载体如蛋白表达：原核细胞表达载体如pBV220, pET等；等； 真核细胞表达载体真核细胞表达载体pcDNA3, pSV2等。等。 研究基因功能：研究基因功能：overexpression, knock down, knock out 基因治疗：逆转录病毒载体，腺病毒载体基因治疗：逆转录病毒载体，腺病毒载体载体的类型：载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力：理想的克隆质粒本身要尽可能小，这样转化效率较）克隆载体的克隆能力：理想的克隆质粒本身要尽可能小，这样转化效率较 高，同时质粒的容

41、量较大，可以插入较大的高，同时质粒的容量较大，可以插入较大的DNA片段。片段。（2）表达载体受体细胞类型：原核）表达载体受体细胞类型：原核/真核真核/穿梭，穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。哺乳类细胞表达载体。 注意事项：注意事项： 载体载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，目的基因与载体应中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，目的基因与载体应易于连接，不产生阅读框架错位。易于连接，不产生阅读框架错位。质粒载体的选择质粒载体的选择 选用质粒做载体的选用质粒做载体的4点要求：点要求： 选分子量小的质粒，小载体不易损坏，在细菌里拷贝数多；选分子量小的质粒，小载体不易损坏，在细菌

42、里拷贝数多；一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束；一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束；必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。常见质粒常见质粒1 1：pBR322pBR322 优点：优点：1 1、具有较小的分子量；、具有较小的分子量； 分子量为分子量为4363bp4363bp，克隆载体的分，克隆载体的分子量大小不要超过子量大小不要超过10kb10kb。2 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。转化子的选择记号。 有有242

43、4种种内切酶单一酶切识别位点内切酶单一酶切识别位点 其中其中7 7种种内切酶的识别位点在四环内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，素抗性基因内部，2 2种种识别位点在识别位点在于这个基因的启动区内，所以于这个基因的启动区内，所以9 9个个限制酶切位点插入外源片断可以限制酶切位点插入外源片断可以导致导致tettetr r基因的失活；基因的失活； 另外有另外有3 3种种限制酶在氨苄青霉素抗限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。性基因有单一的识别位点。3 3、具有较高的拷贝数，而且经过氯具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累霉素扩增之后每个细胞中可积累1000-3000100

44、0-3000个拷贝（氯霉素抑制宿个拷贝（氯霉素抑制宿主菌蛋白质合成主菌蛋白质合成, ,阻止细胞染色体阻止细胞染色体复制复制, ,而质粒本身复制不受影响而质粒本身复制不受影响, ,增加质粒的拷贝数）。增加质粒的拷贝数）。“P P”表示是一种质粒表示是一种质粒“BRBR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar F.Bilivar 和和 R.L.RodriguezR.L.Rodriguez”“322322”表示实验编号表示实验编号Example:Example:a.a.在在pBR322pBR322质粒的质粒的BamHBamH或或SalSal位点插入外

45、源位点插入外源DNADNA片断，切断了片断，切断了tettetr r基因编码序列的连续性，使之失去活性，基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出产生出AmpAmpr rTetTets s表表型的重组型的重组pBR322pBR322质粒，转化入质粒，转化入AmpAmps sTetTets s的大肠杆菌。的大肠杆菌。 涂布在含青霉素的选择培养基上，可生长涂布在含青霉素的选择培养基上，可生长 涂布于含四环素的选择培养基上，不能生长。涂布于含四环素的选择培养基上，不能生长。常见质粒常见质粒2 2：pGEM-TpGEM-T蓝白斑筛选原理：蓝白斑筛选原理：LacZLacZ基因编码基因编码 - -半乳糖苷

46、酶，催化乳糖水半乳糖苷酶，催化乳糖水解解载体载体带有带有LacZLacZ基因的调控序列和基因的调控序列和N N端端146146个个氨基酸的编码信息，编码氨基酸的编码信息，编码 - -互补肽互补肽宿主宿主编码的编码的 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端端当这种载体转入可编码当这种载体转入可编码 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基部分序列的宿主细胞中时，在异丙基- - -D-D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）诱导下，）诱导下，宿主可同宿主可同时合成这两种肽段，时合成这两种肽段，虽然各自都没有酶活虽然各自都没有酶活性，但它们可融为一体形成具有酶活性的性

47、，但它们可融为一体形成具有酶活性的蛋白质，称这种现象为蛋白质，称这种现象为 - -互补。互补。由由-互补产生互补产生 - -半乳糖苷酶可使半乳糖苷酶可使底物底物X-X-GalGal产生蓝色菌落，因而易于识别。产生蓝色菌落，因而易于识别。当外源当外源DNADNA插入到质粒的插入到质粒的MCSMCS后，导致无后，导致无-互补能力的互补能力的N N端片段，端片段，3737温箱倒置培温箱倒置培养养12-16hr12-16hr后，细菌形成白色菌落。后，细菌形成白色菌落。 -互补互补 互互补补的的检检测测PUC18/19PUC18/19由由pBR322pBR322和和M13M13噬菌体改造噬菌体改造常用表

48、达质粒：常用表达质粒： 质粒质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 1 1、氯化铯密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法 2 2、碱变性法、碱变性法 3 3、微量碱变性法、微量碱变性法 1.1.氯化铯密度梯度离心法原理氯化铯密度梯度离心法原理 质粒质粒DNADNA占总占总DNADNA的的1%1%2%2%； 在细胞裂解及在细胞裂解及DNADNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒性片断，而质粒DNADNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； 染色剂溴化乙锭（染色剂溴化乙锭（EBEB，吖啶类染料）能掺

49、入到，吖啶类染料）能掺入到DNADNA链的碱基中，使链的碱基中，使DNADNA体积增大，浮力密度变小。体积增大，浮力密度变小。EBEB容易插入线状的容易插入线状的DNADNA，而与环状质，而与环状质粒粒DNADNA的结合量小于线状的结合量小于线状DNADNA，使浮力密度出现悬殊的差别；而且形，使浮力密度出现悬殊的差别；而且形成的成的EB-DNAEB-DNA复合物中，复合物中，EBEB含量越高，密度会越低。含量越高，密度会越低。 离心流程离心流程 离心收集菌体，加入溶菌酶或离心收集菌体，加入溶菌酶或SDSSDS，促，促进大肠杆菌细胞裂解，离心收集含质进大肠杆菌细胞裂解，离心收集含质粒粒DNADN

50、A的上清。的上清。 将将EBEB的的CsClCsCl溶液加到清亮的大肠杆菌溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，裂解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNADNA链碱基中。链碱基中。 EBEB达到饱和时，达到饱和时，CsClCsCl密度梯度离心。密度梯度离心。2.2.碱变性法原理：碱变性法原理：原理：原理：cccDNAcccDNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片断之间，拓扑学上存在差异片断之间，拓扑学上存在差异 在在pH12.0pH12.012.512.5范围内：范围内： 线性的线性的DNADNA双螺旋双螺旋结构解开而被变性；结构解开而被变性；共价闭环质粒共价闭环质粒DNADNA的氢键会被断的氢键

51、会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 恢复恢复pHpH值中性时：值中性时： 共价闭合环状的质粒共价闭合环状的质粒DNADNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，恢复原来构型，保持可溶性状态。准确，恢复原来构型，保持可溶性状态。 线性染色体线性染色体DNADNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不迅速准确，它的两条互补链彼此已完全分开，复性就不迅速准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构。们相互缠绕形成不溶性网状结构。 通过离心，去除线性染色体通过离心，去除线性染色体DNADN

52、A与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNARNA，蛋白质，蛋白质-SDS-SDS复复合物等，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒合物等，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNADNA。挑取单个菌落接种到挑取单个菌落接种到5ml5ml含适当抗菌素的含适当抗菌素的LBLB培养基中，培养基中， 37 37摇床培养过夜。摇床培养过夜。取取1.5ml1.5ml菌液加入菌液加入EppendorfEppendorf管中，管中，5000rpm5000rpm离心离心1min1min，弃上清，弃上清，沉淀沉淀悬浮悬浮于于150l150l溶液溶液（500mmol/L500mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L T

53、ris-HCl25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA，pH pH 8.08.0）冰浴）冰浴5 5分钟；分钟；此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。 加入新配置的加入新配置的200l200l溶液溶液（0.2mol/L NaOH0.2mol/L NaOH，1%SDS1%SDS），混匀，冰浴），混匀，冰浴1010分钟。分钟。这一步操这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNADNA

54、片断会慢慢断片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNADNA也会断裂。也会断裂。加入加入 150l 150l 溶液溶液（ 3mol/L3mol/L乙酸钾乙酸钾，pH4.8pH4.8），冰浴），冰浴5 5分钟；分钟；碱处理的时间要短，而且碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNADNA污染。污染。 12000rpm12000rpm离心离心3 3分钟，转移上清至新的离心管；分钟，转移上清至新的离心管；加入等体积酚加入等体积酚/ /氯仿抽提一次；转移上层水相至新的离心管；

55、氯仿抽提一次；转移上层水相至新的离心管；等体积氯仿抽提一次。等体积氯仿抽提一次。取上清，加入取上清，加入2 2倍体积无水乙醇，混匀，倍体积无水乙醇，混匀，-20-20沉淀沉淀3030分钟；分钟；12000rpm12000rpm离心离心5 5分钟。分钟。70%70%乙醇洗涤沉淀一次；乙醇洗涤沉淀一次；干燥后加入干燥后加入50l50l含含RNARNA酶（酶（20ug/ml20ug/ml）的）的TETE（10mmol/L Tris-HCL10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA1mmol/L EDTA，pH pH 8.08.0），），3737水浴水浴3030分钟。分钟。-20-2

56、0保存备用。保存备用。质粒的小量提取质粒的小量提取碱裂解法碱裂解法 自自QiagenQiagen公司推出快速小量提取质粒公司推出快速小量提取质粒DNADNA试剂盒以来，很多公司都开试剂盒以来，很多公司都开发出类似产品，其原理及实验步骤大同小异。具体步骤如下发出类似产品，其原理及实验步骤大同小异。具体步骤如下( (天为时代天为时代) )：挑取单菌落接种于挑取单菌落接种于5ml5ml含适当抗菌素的含适当抗菌素的LBLB培养基中，培养基中，3737振荡培养过夜；振荡培养过夜；取取1.5ml1.5ml菌液加入菌液加入EppendorfEppendorf管中，管中，13000rpm13000rpm离心离

57、心1min1min，弃上清，加入，弃上清，加入250ul 250ul S1 Buffer,S1 Buffer,最大速度旋涡震荡；最大速度旋涡震荡；加入加入250ul 250ul S2 BufferS2 Buffer，轻轻颠倒混匀轻轻颠倒混匀4-64-6次；次；加入加入350ul 350ul S3 BufferS3 Buffer，立即迅速颠倒混匀，可见白色絮状沉淀；立即迅速颠倒混匀，可见白色絮状沉淀；将上清加入纯化柱中，将上清加入纯化柱中，5000rpm5000rpm离心离心10min10min；弃去收集管中液体，加入弃去收集管中液体，加入500ul500ul除蛋白液除蛋白液PD BufferP

58、D Buffer，13000rpm13000rpm离心离心1min1min；弃去收集管中液体；加入弃去收集管中液体；加入700ul PE Buffer700ul PE Buffer，13000rpm13000rpm离心离心1min1min；弃去收集管中液体；加入弃去收集管中液体；加入500ul PE Buffer500ul PE Buffer，13000rpm13000rpm离心离心1min1min；弃去收集管中液体；弃去收集管中液体；13000rpm13000rpm离心离心3min3min，以彻底去除乙醇；，以彻底去除乙醇；将柱子放到一只干净的将柱子放到一只干净的1.5ml Eppendor

59、f1.5ml Eppendorf管中，加入管中，加入50l ddH2O50l ddH2O；静止放置静止放置2min, 13000rpm 2min, 13000rpm 离心离心1min,1min,收集离心液，收集离心液，-20-20保存。保存。 质粒的小量提取质粒的小量提取碱裂解法（试剂盒）碱裂解法（试剂盒）挑取单菌落接种挑取单菌落接种5 5毫升含适当抗菌素的毫升含适当抗菌素的LBLB培养基中，培养基中，3737震荡培养过夜。震荡培养过夜。将培养物转接将培养物转接200ml200ml含同样抗菌素的含同样抗菌素的LBLB培养基中，培养基中，3737剧烈振荡培养剧烈振荡培养12-1612-16小时，

60、细菌密度小时，细菌密度(OD600nm)(OD600nm)达到达到1.01.0；5000rpm5000rpm离心离心1515分钟，弃上清；分钟，弃上清；重悬细菌于重悬细菌于100ml100ml冰预冷冰预冷STE STE （0.1mol/L NaCl0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA1mmol/L EDTA，pH 8.0pH 8.0）。）。5000rpm5000rpm离心离心1515分钟，弃上清；分钟，弃上清；加加10ml10ml溶液溶液1 1（50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L