肌苷对帕金森病小鼠模型的神经保护作用(1)

1、肌苷对帕金森病小鼠模型的神经保护作用(1)    【关键词】  小鼠Inosine is neuroprective against MPTPinduced  Parkinsons  disease  in C57BL mice【Abstract】 AIM: To study the neuroprotective effects of inosine on  1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine（MPTP）induced Parkinsons disease（P

2、D） in C57BL mice. METHODS:  The PD models were formed with intraperitoneal injections of MPTP. Inosine was administered intraperitoneally to mice 30 min prior to MPTP. The effects of inosine and MPTP on the behavioral exhibition, the number of dopamine (DA) neurons in the substantia nigra and t

3、he density of tyrosine hydroxylaseimmunoreactive (THir) nerve fibers in the striatum, and the level of DA in the striatum were studied by behavioral test, immunohistochemical analysis and fluorospectrophotometry. RESULTS:  The scores of locomotion, Rotarod and swim test decreased by about 45 an

4、d 43 and 22, respectively. The number of DA neurons in the substantia nigra declined by about 58, the density of THir nerve fibers also decreased, and the level of DA in the striatum declined by about 88. Inosine, given prior to MPTP, attenuated the effects of MPTP. The scores of locomotion, Rotarod

5、 and swim test declined only by about 5 and 11 and 12, respectively, the number of DA neurons in the substantia nigra declined by only about 43 and the level of DA in the striatum declined only by about 71. CONCLUSION:  Inosine is neuroprective against MPTPinduced lesions in C57BL mice.【Keyword

6、s】 inosine；1Methyl4pheny1,2,3,6tetrahydropyridine；Parkinson disease；nearaprotective agents；mice【摘要】目的： 观察肌苷对MPTP致帕金森病（PD）小鼠模型的神经保护作用.方法： 用MPTP建立C57BL小鼠PD模型，在MPTP前给予肌苷，通过行为学检测（自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验）、免疫组织化学和荧光分光光度法，观察肌苷对PD小鼠模型的行为学表现、黑质多巴胺（DA）神经元和纹状体酪氨酸羟化酶免疫反应阳性（THir）神经纤维以及纹状体DA水平的影响.结果： 给予MPTP后，小鼠行为学计

7、数降低，自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验分别降低约45、43和22，黑质DA神经元数目减少约58，纹状体THir神经纤维密度减低，纹状体DA水平明显降低约88，提前给予肌苷后降低程度减轻，自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验降低程度分别约为5、11和12，黑质DA神经元数目减少约43，纹状体DA水平降低约71，两组相比有显著性差异（P001）.结论： 肌苷对MPTP所致的C57BL小鼠的神经损伤具有保护作用.【关键词】 肌苷；1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶；帕金森病；神经保护药；小鼠0引言帕金森病（Parkinsons disease,PD）是一种临床常见的神经系统退变性疾

8、病，是中老年人常见的致残疾患之一.目前所知，其主要是由于黑质多巴胺（Dopamine,DA）能神经元坏死、凋亡，细胞数目减少，使黑质纹状体通路DA释放减少，出现多巴胺乙酰胆碱失衡，患者出现静止性震颤、肌张力增高、运动减少等一系列症状，严重影响患者的生活质量.研究显示PD的发病与遗传和环境等多种因素相关，1甲基4苯基1、2、3、6四氢吡啶（1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine,MPTP）可以导致人类及灵长类、小鼠等多种动物产生PD样症状，为PD研究提供了新的途径.肌苷（inosine,INO）是腺嘌呤核苷和核苷酸代谢的中间产物之一，临床上长期作为能量营养

9、剂用于多种疾病如肝脏和心血管疾病的辅助治疗.近期研究发现，肌苷在神经系统的损伤与修复中也具有重要的营养和保护作用.本研究利用常用的MPTP致C57BL小鼠PD模型，探讨肌苷在PD中的神经保护作用.1材料和方法11动物和分组8 wk龄雄性C57BL小鼠（第四军医大学实验动物中心提供），体质量2527 g，安静环境饲养，自由取食饮水，人工昼夜节律（1212 h）.将动物随机分为3组： 生理盐水组（Saline组）；MPTP组；肌苷+MPTP组（INO+ MPTP组），每组10只.第13日INO+MPTP组给予肌苷60 mg/kg ip 1次/d，Saline组、MPTP组给予等量生理盐水ip 1次

10、/d，第410日INO+MPTP组给予肌苷60 mg/kg ip，30 min后MPTP 30 mg/kg ip 1次/d，MPTP组给予等量生理盐水ip 30 min后MPTP 30 mg/kg ip 1次/d，Saline组给予等量生理盐水ip 1次/d.12试剂和仪器MPTP，INO和DA标准品为Sigma公司产品，小鼠抗酪氨酸羟化酶（TH）单克隆抗体，生物素化兔抗小鼠二抗，ABC试剂盒为Calbiochem公司产品，其余试剂为国产分析纯.用001 mol/L盐酸将DA配制成100 mg/L，保存于02，使用前用001 mol/L盐酸稀释配制成标准应用液2 mg/L.酸化正丁醇： 100

11、 mL正丁醇中加入0085 mL浓盐酸；1/15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 72）： KH2PO4  035 g和Na2HPO412H2O 145 g溶于975 mL去离子水中，用10 mol/L NaOH或H3PO4调至pH 72，最后定容到100 mL；01 mol/L碘试剂： KI 1 g溶于重蒸馏水后加入I2 025 g，再加重蒸馏水至20 mL，贮于棕色瓶中，避光保存；碱性亚硫酸钠： 025 g亚硫酸钠（Na2SO3）溶于5 mol/L NaOH 9 mL中，再加水1 mL混匀，临用前配制；01 mol/L EDTA溶液（pH 70）： EDTA2Na.2H2O 037

12、1 g溶于95 mL 乙酸钠（1 mol/L）中，用10 mol/L NaOH调pH 70，最后用乙酸钠（1 mol/L）溶液加到10 mL，贮存于冰箱备用.UGO BASILE 7750型Rotarod仪，岛津RF5000荧光分光光度仪.13行为学检测在停药后第3日，进行下述行为学检测.131自主活动计数参照Kawai H的测试方法，自制30 cm×30 cm×15 cm的有机玻璃盒，底部刻出6 cm×6 cm的格子，在安静、光线较暗的环境中检测.小鼠适应环境10 min后，计数5 min内小鼠移动的格子数，连续测5次取平均值.132Rotarod检测Rotar

13、od实验需要动物在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验.滚轴直径6 cm，转速20 r/min，连续测20次取平均值.133游泳实验参照Donnan GA的测试方法，将受试小鼠放入一个20  cm×30 cm×20 cm规格的有机玻璃水箱中，水深10 cm，水温为2225.评分标准如下： 在1 min内能连续不断游泳者记30分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记25分；漂浮时间占整个受试时间 50以上者记20分；偶尔游泳者记15分；偶尔用后肢游动并漂浮在水箱一边者记10分.检测5次取平均值.14黑质及纹状体免疫组织化学检测行为学检测后，每组取5只小

14、鼠行黑质及纹状体免疫组织化学检测.5 g/L戊巴比妥钠1 mL腹腔麻醉后，开胸经主动脉先以9 g/L生理盐水15 mL冲洗血液，再用含40 g/L多聚甲醛的01 mol/L的磷酸缓冲液（PBS，pH 72）100 mL先快后慢灌注固定1 h灌毕立即取脑，在含300 g/L蔗糖的PBS内过夜（4 ）至组织沉底.参考小鼠脑图谱，在恒冷箱（22）行中脑黑质和纹状体冠状切片，片厚30 m，收集于001 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS, pH 72）内.免疫组织化学染色步骤如下： 3 mL/L过氧化氢甲醇溶液（300 mL过氧化氢1 mL+甲醇80 mL+ PBS 19 mL）30  min，

15、3 g/LTriton X100的PBS 30 min，浸入小鼠抗TH单克隆抗体（13000）孵育48 h（4），浸入生物素化兔抗小鼠二抗（1500）孵育2 h（室温），浸入ABC复合物（1500）孵育2 h（室温），蒸馏水快速冲洗后硫酸镍胺加强DAB蓝色反应法显色2030 min，当阳性产物呈深蓝色而背底清晰时蒸馏水冲洗3次终止显色.以上步骤每步后均需001 mol/L PBS清洗3次，每次10 min.其中一抗用含10 mL/L小牛血清和3 g/L的Triton X100的PBS稀释，二抗和ABC复合物用PBS稀释.贴片，脱水，透明，中性树胶封片.每只小鼠黑质取头端、中部、尾端切片3张，取

16、大脑脚中点上方区域，在200×高倍镜下计数TH免疫反应阳性（THir）神经元个数，取平均数.15纹状体DA水平检测在行为学检测后，每组取5只行纹状体DA水平荧光分光光度法检测.将小鼠迅速断头、取脑，放入预冷的生理盐水中，去除脑膜和血液，滤纸吸干水分，在冰皿上剥离纹状体，称质量后置于含有少量冰冷的酸化正丁醇的匀浆器中，在冰水浴中制成匀浆，转移至具塞刻度离心管内，并用酸化正丁醇补充至3 mL，按以下步骤测DA浓度： 匀浆液振荡1 min，离心（2500 r/min）5 min，上清液15 mL + 1/15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 72）15 mL，振荡1 min，离心5 min，

17、水相05 mL + EDTA溶液04 mL混合，加碘试剂02 mL混合、静置，准确反应2 min，加碱性亚硫酸钠05 mL混合、静置，准确反应2 min，加6 mol/L乙酸06 mL，沸水浴20 min，冷却后检测荧光强度（波长： 激发光320 nm，发射光370 nm）.每批实验均需空白管和标准管.空白管： 取001 mol/L盐酸02 mL，用酸化正丁醇补充至3 mL，其余操作同样品管.标准管： 取标准应用液02 mL，用酸化正丁醇补充至3  mL，其余操作同样品管.统计学处理： 实验结果采用x±s表示，SPSS100统计软件行单因素方差分析和SNKq组间两两比较，P005为有统计学意义.2结果21小鼠给予MPTP后的一般表现小鼠在给予MPTP后35 min，出现震颤、运动减少、弓背、后肢张开、步态不稳、竖尾、竖毛等改变，个别出现癫痫样发作，约3060 min后上述症状逐渐减轻，24 h后基本