霉酚酸对树突状细胞延长移植肾存活效应的影响

1、霉酚酸对树突状细胞延长移植肾存活效应的影响         08-08-05 09:46:00     编辑：studa20          作者：李杰，张银甫，黄赤兵，范明齐，王平贤，冯嘉瑜，肖亚摘要  目的  探讨霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)对树突状细胞（dendritic cells,DC）延长移植肾存活效应的影响。方法  以

2、BN、Lewis大鼠为肾移植供、受体；在供体DC培养过程中加入两种浓度MPA，以CTLA-4Ig基因转染DC使之成为表达CTLA-4Ig的致耐受DC；观察DC形态变化并检测受体脾细胞对上述DC的刺激反应。将未处理的致耐受DC以及0.05 mol/L MPA处理DC于肾移植前72 h分别注入受体(组1、组2)，注入供体DC的受体为组3，未注入DC的受体为对照(组4)，观察受体血肌酐变化和移植肾存活时间。结果  MPA组DC形态老化延缓，脾细胞对两种浓度MPA处理的DC刺激反应均显著低于对未经MPA处理致耐受DC的刺激反应；与对照相比，组1、组2移植肾存活时间显著延长（P<0.01

3、），其中组2延长更为明显（76.1±14.6）天vs（8.9±0.8）天，P<0.001，组3存活时间显著缩短（5.3±0.6天,P<0.05）。术后45天后组2血肌酐水平明显低于组1。结论  MPA预处理可降低致耐受DC的抗原提呈能力，提高其延长移植肾存活的效能。关键词  霉酚酸；树突状细胞；肾移植    Influence of mycophenolic acid on survival prolongation of renal allografts with tolerogenic dendri

4、tic cells    Abstract  Objective  To study the influence of mycophenolic acid (MPA) on survival prolongation of renal allografts with tolerogenic dendritic cells(DC)in rats.Methods  The influence of MPA on CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs was observed in vitro morpho

5、logically and functionally. The influence of MPA on the survival time and function of the renal allografts was observed in a BNLewis kidney transplantation model with recipients treated by CTLA-4Ig-gene-transferred donor DCs.Results  The maturation and aging of DC were delayed and the stimulati

6、ng ability of DC to recipient splenic cells was impaired significantly with the adding of MPA. Survival time of renal allografts in CTLA-4Ig-gene-transferred DC group was prolonged significantly (compared with control,57.1±13.4 d vs 8.9±0.8 d,P<0.01) and further prolonged with the addin

7、g of MPA (76.1±14.6 d vs 8.9±0.8 d，P<0.001).The allografts functioned well even after forty-five days postoperatively in recipient treated with MPA preconditioned DC.Conclusion  MPA preconditioning impairs the ability of   antigen presentation of CTLA-4Ig-gene-transferred

8、 donor DCs and enhances its efficacy of  survival prolongation of renal allografts in rats.    Key words  mycophenolic acid;dendritic cells;kidney transplantation    树突状细胞（dendritic cells,DC）是介导器官移植排斥反应的重要成分，通过其表面的B7分子与抗原特异性T细胞表面的CD28分子结合所提供的共刺激信号对T细胞的激活起重要作用1

9、。前期研究中，本中心采用B7分子阻断剂CTLA-4Ig基因转染供体DC，获得了表达CTLA-4Ig的致耐受DC，延长了移植肾存活时间，但未能实现长期存活。我们观察到CTLA-4Ig基因转染过程中DC迅速老化现象2，研究表明成熟DC表达更多的共刺激分子，可能阻碍CTLA-4Ig充分发挥作用3。资料显示，霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)具有抑制DC成熟的作用4。本研究观察了MPA预处理对致耐受DC形态和体外功能的影响，以及其对致耐受DC延长移植肾存活效应的影响，旨在探讨提高致耐受DC效能的方法。    1  材料与方法 

10、0;  1.1  实验材料  肾移植供体为近交系Brown-Norway(BN)大鼠（本校西南医院烧伤研究所提供），体重250300 g；受体为近交系Lewis大鼠（本校西南医院烧伤研究所提供），体重250300 g，雌雄不拘。重组大鼠GM-CSF、IL-4均为美国R&D产品；FITC标记的小鼠抗大鼠DC单抗OX62，PE标记的小鼠抗人CTLA-4单抗均为美国Pharmingen产品。MPA购自Roche Bioscience，溶于甲醇，4 放置过夜，过滤除菌后备用。美国Bio-Rad 450酶标仪，XTS-6A手术显微镜（江苏镇江中天光学仪器厂）。CTL

11、A-4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA-4Ig由笔者构建5，滴度为5×109 pfu/ml。    1.2  方法    1.2.1  DC培养  根据文献方法6分离供体大鼠骨髓细胞，一组加入含20%胎牛血清RPMI 1640培养基的24孔板中以GM-CSF和IL-4刺激培养，另外3组按上述方法培养的同时分别加入终浓度为0.05 mol/L和0.1 mol/L的MPA。培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，以出现树枝状突起的细胞作为DC的形态学特征，培养后6天以流式细胞术根

12、据DC表面标志OX62进行鉴定，收集阳性率达85%以上的培养皿中DC，用含20%胎牛血清RPMI 1640重悬，调整细胞密度为1×106/ml，备用。    1.2.2  CTLA-4Ig基因转染DC  按感染复数（MOI）5001向每毫升DC中加入AdvCTLA-4Ig，分置于24孔板中37 孵育48 h后用0.01 M PBS反复洗涤、离心3次，收集DC，流式细胞术检测DC表面CTLA-4的阳性率，收集阳性率达95%以上的培养皿中DC，以含20%胎牛血清RPMI 1640重悬，制成1×106/ml细胞悬液。 &

13、#160;  1.2.3  受体脾细胞对DC的刺激反应检测  以DC为刺激细胞，根据DC性质分为：未经其他处理的DC（Control DC）,CTLA-4Ig修饰的致耐受DC(CTLA-4Ig DC),以及0.05 mol/L和0.1 mol/L两种浓度MPA处理的致耐受DC（MPA DC1、MPA DC2），各种DC同时培养，以CTLA-4Ig修饰DC完毕为刺激起点（培养后第8天）。以受体脾细胞为反应细胞，按文献方法7，用1%异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉受体，切取Lewis受体脾脏，分离脾细胞，用含20%胎牛血清的RPMI-1640重悬脾细胞，调整细胞密度为1

14、15;106/ml。在96孔板中，将脾细胞和DC各100 l加入同一孔中，每一反应组设3个复孔，分别测定受体脾细胞对供体DC、CTLA-4Ig修饰的致耐受DC以及两种浓度MPA预处理的致耐受DC的刺激反应。在37 于5%CO2条件下孵育细胞，每天轻轻摇动96孔板，使细胞充分接触、反应，孵育72 h，MTT法检测反应结果：每孔吸出培养液50 l，加MTT 20 l，37 ，继续孵育5 h，吸出培养液100 l，加入无水乙醇100 l，置37 10 min，用酶标仪测OD值（波长595 nm）。    1.2.4  DC延长移植肾存活的效能  按注入受体DC的不同分为4组：注入未经MPA处理的致耐受DC为组1（n=8），注入经0.05 mol/L MPA处理的致耐受DC为组2（n=8），注入未经任何处理的供体DC为组3（n=8），未注入DC的受体为对照（组4）(n=6)。术前72 h,受体Lewis大鼠经1%异戊巴比妥钠腹腔