倍美力对去卵巢痴呆模型大鼠行为学及不同脑区胆碱乙酰转移酶的干预作用

1、    倍美力对去卵巢痴呆模型大鼠行为学及不同脑区胆碱乙酰转移酶的干预作用作者：安莲华 柏玉萍 李贞兰 张昱 赵珩 作者单位：吉林大学第一医院老年病科，吉林 长春 130021【摘要】 目的 观察去卵巢痴呆大鼠行为学及额叶皮质、基底前脑、海马CA1区胆碱乙酰转移酶(ChAT)的变化及倍美力对其影响，探讨倍美力的脑保护机制。方法 采用穹窿海马伞切除术及双侧卵巢切除制备痴呆及雌激素缺乏复合模型鼠，采用Morris水迷宫观察其行为学变化，利用RTPCR法观察大鼠额叶皮质、基底前脑、海马CA1区ChAT mRNA的变化。结果 倍美力干预组大鼠学习、记忆能力增强，

2、额叶皮质、基底前脑、海马CA1区ChAT mRNA表达增加(均P<0.01)。结论 倍美力可通过增加额叶皮质、基底前脑、海马CA1区ChAT mRNA表达，改善模型鼠学习及记忆能力。【关键词】 倍美力 老年性痴呆 胆碱乙酰转移酶Effect of Premarin on praxiology and choline acetyltransferase in different cerebral regions of ovariectomized rats with dementiaAN LianHua, BAI YuPing, LI ZhenLan, et al.Department o

3、f Geriatrics, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China【Abstract】 Objective To observe the changes of praxiology and choline acetyltransferase (ChAT) in cerebral cortex, basal forebrain and hippocampi CA1 of rats after ovariectomized and transected hippocampal fimbriafor

4、nix and protective effect of premarin on brain. Methods The model of AD and ovariectomized (OVX) rats was established by transecting hippocampal fimbriafornix and OVX. Morris Water maze was used to test the ability of learning and memory function in each group. The expression of ChAT mRNA was measur

5、ed by RTPCR separately in different cerebral regions of rats. Results Premarin group had the enhanced ability of learning and memory function, the increased expressions of ChAT mRNA in different regions.Conclusions Premarin could increase the expression of ChAT mRNA in different cerebral regions of

6、rats and improve the ability of learning and memory function.【Key words】 Premarin;Alzheimer's disease(AD);Choline acetyltransferase流行病学调查表明，绝经后妇女阿尔茨海默病(AD)的发病率较同年龄组的男性高出1.53倍1，故推测雌激素的缺乏可能是导致AD发病的因素之一。神经生物化学研究显示，AD患者基底前脑胆碱能神经元约有90%丧失，海马和皮层锥体细胞的突触及突触烟碱受体、突触前M型受体亦减少。AD患者乙酰胆碱(ACh)合成减少，胆碱乙酰转移酶(ChAT)活

7、性下降，且与痴呆严重程度密切相关。本研究利用穹隆海马伞切断及去除双侧卵巢(OVX)较成功地模拟AD胆碱能神经元缺失及雌激素缺乏，建立雌激素缺乏及痴呆复合动物模型2，观察倍美力对该模型大鼠行为学及额叶皮质、基底前脑、海马CA1区ChAT的影响，为倍美力治疗AD提供理论依据。1 材料与方法1.1 动物分组与模型制备健康雌性Wister大鼠30只，鼠龄4个月，体重250300 g，由吉林大学基础医学部实验动物中心提供。随机分成对照组模型组倍美力组，每组各10只。模型组倍美力组：参照大鼠脑立体定位图谱取前囟后2.2 mm，中线左右各旁开1.0 mm处，牙钻钻开颅骨，切开骨膜，用双刃刀片(宽3.0 mm

8、，长30.0 mm)在上述部位的脑表面行冠状切口，然后降刀4.5 mm，上下提抽刀20次，确保双侧海马伞外侧缘完全切断，制备AD模型鼠。1 w后将上述10只鼠麻醉后切除双侧卵巢制备雌激素缺乏复合AD模型鼠;对照组：仅做颅骨钻孔，不切断海马伞，仅切开腹腔，切除少量卵巢周围脂肪。所有实验动物术后常规喂养。卵巢切除术后2 w，倍美力组大鼠灌胃(按每天倍美力0.065 mg/kg，溶于1.5 ml生理盐水中)，每日1次;模型组和对照组给与1.5 ml生理盐水灌胃作对照，共8 w。其后对所有实验动物做如下处理：Morris水迷宫测试4 d;第5天将大鼠断头处死，在冰上迅速剥离出额叶皮质基底前脑海马，将分

9、离出的组织分别称重后放入Epp管中，置入液氮中快速冷冻后放入-80冰箱中保存备PCR用。1.2 学习、记忆功能测定采用Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)进行测试，历时4 d。将大鼠面向池壁，分别从4个入水点放入池中，记录大鼠寻找到平台所需时间即为逃避潜伏期时间。定位航行实验结束后撤掉平台，将大鼠任选一入水点放入池中，测其2 min内跨越平台所在位置的次数，记录平均次数。1.3 RTPCR反应按标准Trizol法分别提取额叶皮质、基底前脑、海马CA1区脑组织细胞总RNA，采用TaKaRa的二步法试剂盒说明书操作逆转录为cDNA后进行PCR。ChA T引物：上游：5CGTGGGCATG

10、CACATACTGTC3，下游：5CCCGTAAACCAGAAAGTAGGA3，扩增片段长度403 bp,反应体系40 l，ChAT变性94 30 s,退火55 30 s,延伸72 10 min,共30个循环。PCR产物以1.2%琼脂糖电泳检测，长波紫外灯下观测照像，电泳结果以图像分析系统进行电泳条带光密度分析，计算产物ChAT与actin产物光密度积分的比值，作为ChAT mRNA的表达水平。1.4 统计学处理实验数据以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件对数据进行处理，两组间比较采用t检验。2 结 果2.1 Morris水迷宫实验从表1中可见模型组大鼠逃避潜伏期时间明显延长;

11、跨越平台次数显著减少，较对照组和倍美力组有明显差异(P<0.01)，而对照组和倍美力组之间无明显差异。表1 各组大鼠水迷宫学习、记忆成绩比较(略)2.2 ChAT mRNA表达水平模型组大鼠大脑皮质、基底前脑、海马CA1区ChAT mRNA表达水平明显降低，与对照组有显著差异(P<0.01);倍美力组不同脑区ChAT mRNA表达水平明显提高，与模型组有显著差异(P<0.01)，与对照组差异无统计学意义(见表2、图1)。表2 各组大鼠不同脑区ChAT mRNA表达水平(略)3 讨 论AD是与年龄相关的一种中枢神经系统慢性、进行性变性疾病，以认知障碍、老年斑(SP)、神经原纤维

12、缠结(NFT)颗粒空泡变性为主要特征3。近年来，国内外学者为探讨AD的发病机制和开发有效的药物，相继探讨了一些模拟AD的动物模型及治疗策略，但导致AD的关键机制尚不十分清楚，而建立与治疗药物存在因果关系的AD模型尤为重要。脑内胆碱能神经系统的损害是造成AD的重要原因之一4，胆碱能神经元分泌的神经递质乙酰胆碱(ACh)是与认知功能密切相关的中枢神经递质，ACh水平下降可导致动物的认知障碍和学习、记忆能力减退5。而Ach的产生释放与传递是通过脑内中枢胆碱能神经系统实现的，该系统的胆碱能神经元胞体主要位于内侧隔核(medial septum，MS)Broca斜角带及Meynert基底核等，其投射纤维

13、到大脑新皮质海马的广泛区域6，这一投射系统与认知功能，学习、记忆能力密切相关，其任何一个环节被阻断或损坏都可导致动物的认知障碍和学习记忆能力减退7，8。依据损坏方式的不同，可分为化学毁损、物理毁损、外科毁损等类型，其中双侧穹窿海马伞切断(hippocampal fimbriafornix，FF)因其方法简单经济有效，较广泛地应用在药物治疗AD的研究中。Blusztajn等9研究证实：单侧穹窿海马伞切断的动物存活12 w后，损伤同侧MS胆碱能神经元较对侧减少50%60%，斜角带垂直支约减少40%。水迷宫测试该模型鼠的获取能力和记忆能力明显减低，表明该模型是一种较为理想的胆碱能神经系统损害模型。采

14、用雌激素替代治疗(ERT)可以降低或延缓AD的发生10，11,提示认知水平的下降与雌激素水平降低有关，且雌激素可以改善认知水平。乙酰胆碱(Ach)是与认知功能密切相关的重要神经递质之一12，脑脊液中Ach水平与痴呆程度呈负相关13,Ach代谢降低与动物认知障碍有关。Ach由ChAT催化合成，由AchE催化分解，通过Ach受体发挥其生物学效应。ChAT主要分布在突触前神经末梢内，基底前脑的一些区域如MS和斜角带垂直支、Meynert基底核的胆碱能系统能够向大脑和海马投射纤维，与学习、记忆有重要关系，故切断FF后，可引起海马胆碱能纤维缺失，动物则表现出认知功能减退，学习、记忆能力下降。ChAT是胆

15、碱能神经的标志酶，故常作为研究胆碱能神经的间接生物指标14。动物研究证实ERT可以逆转痴呆模型鼠摄取胆碱量的减少，以及神经细胞中AchE数量的下降，阻止神经生长因子和脑源性神经生长因子的mRNA量的降低，提高大鼠大学习、记忆能力。雌激素在AD发病机制可能在于对胆碱能的调节15，其含量下降将导致胆固醇和磷脂转运障碍，造成Ach合成不足，同时雌激素可促进基底前脑ChAT活性，通过上调胆碱能系统而减缓AD发展16。本实验研究结果显示，切断双侧FF及OVX后，大鼠额叶皮质、基底前脑、海马CA1区ChAT mRNA表达降低，学习、记忆能力下降，而补充倍美力后促进额叶、基底前脑、海马CA1区ChAT mR

16、NA表达,从而改善了大鼠的学习、记忆能力，这一结果进一步证实了基底前脑胆碱能神经元投射到海马的纤维通路及中枢胆碱能系统在AD病理机制中的重要地位，亦证实倍美力具有脑保护作用。【参考文献】1 Halpern DF.Sex diferentes in cognitive abilitiesM.3rd ed.Hillsdale,NJ:Law rence Erlbaum Associates,2000:177.2 Singh M,Meyer EM,Millard WY,et al.Ovarian steroid deprivqtion results in a reversible learning

17、impairment and compromised cholinergic function in female SD ratsJ.Brain Res,1994;644:30512.3 王德生，张守信.老年痴呆M.北京：人民卫生出版社，2001：609.4 Kasa P,Pakoncay Z,Gluya K.The cholinergic system in Alzheimers diseaseJ.Prog Neurobiol,1997;52:51136.5 吴 洁.Alzheimer病动物模型进展J.国外医学老年医学分册，1998;19(1)：115.6 李月奎.Alzheimer病动物模

18、型进展J.中国神经免疫学和神经病学杂志， 1996;3(2)：11923.7 Kruqel U，Biql V，Eschrich K,et al.Deafferentation of the septohippocampal pathway in rats as a model of the metabolic events in Alzheimers diseaseJ.Int J Dev Neurosci,2001;19(3)：26377.8 张见影，王 哲.痴呆大鼠模型行为学、脑内胆碱乙酰转移酶及突触素的改变J.中国老年学杂志，2007;24(7)：65859.9 Blusztaji JK,Berse B.The cholinergic neuronal phenotype in Alzheimers diseaseJ.Metab Brain Dis,2000;15(1)：4564.10 Santiago P,Isabel C,Carman M.The central nervous system and HRTJ.Int J Fertil,2000;45(1)：1321.11 Gibbs RS.Impairment of basal forebrain cholinergic neurons associated with aging and longt