海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究

1、海藻提取物Fucoidan抗肿瘤作用的实验研究 【摘要】【关键词】 海藻提取物褐海藻多糖硫酸酯；抗肿瘤Abstract：ObjectiveTo observe the antitumor action of Fucoidan extracted from brown alga Undaria pinnatifida. MethodsThe mode of implanted S180 tumor was established in mice.The inhibitory effect on tumor was observed in mice after Fucoidan was given

2、 orally.The inhibitory effect in A549,HeLa and L1210cells by Fucoidan with the method of MTT was investigated in vitro. The immune function of Fucoidan to normal mice was detected through the experiment on the clearance rate of charcoal particles and delayed type hypersensitive reaction (DTH) induce

3、d by DNFB.ResultsFucoidan showed significant inhibition on the growth of S180 tumor in a dose-dependent manner（P0.01）,but no significant anti-proliferative effects on A549,HeLa and L1210cells. The clearance rate of charcoal particles ,spleen index and ear edema induced by DTH were improved in high-d

4、ose and middle-dose groups（P0.05; P0.01）. ConclusionFucoidan has antitumor action, and the mechanism maybe related to strengthening the immune function.Key words：Fucoidan extracted from Brown Alga ; Antitumor Fucoidan是一种从日本褐藻Undaria pinnatifida中提取的天然多糖类成分，含有4-单邻磺酸-L-岩藻吡喃糖（4-mono-O-sulfo-L-fucopyrano

5、se）。现有研究证明，从多种褐藻中提取的Fucoidan具有多种生物效应，如抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等，已在日本作为功能食品、化妆品等广泛使用1。其抗肿瘤作用尤引起人们的关注。本实验以体内、体外方法，观察Fucoidan对小鼠S180移植性实体瘤、体外培养肿瘤细胞的作用，并了解其对动物免疫功能的影响，以对其抗肿瘤机理进行探讨，为其临床应用提供基础。1 材料1 药品与试剂Fucoidan由武汉和利有限公司提供，为黄褐色粉末，在水溶液中溶解度好。环磷酰胺：山西普德药业有限公司生产。型胶原酶、噻唑蓝（MTT）、放线菌素D、脂多糖（LPS）：购自Sigma公司；RPMI-1640培养基、新生牛血清（NB

6、S）：GIBCO公司生产。2动物及分组昆明种小鼠（湖北省实验动物中心提供），1822 g，雌雄各半。体内抗肿瘤活性的检测实验将小鼠随机分为模型组，Fucoidan小、中、大剂量组及阳性对照组共5组，每组20只；对小鼠免疫功能的影响将小鼠随机分为对照组，Fucoidan小、中、大剂量组共4组，每组10只。Fucoidan小、中、大剂量组分别按1，2 ，3 mg/10 g灌胃给药，对照及模型组和阳性对照组同法给予等量生理盐水和0.3 mg/10 g环磷酰胺，1次/d。3 瘤株A549细胞（人肺癌上皮细胞系）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）、L1210细胞（小鼠淋巴细胞性白血病细胞）：由武汉大学典

7、藏中心提供；荷瘤S180腹水型小鼠：由华中科技大学同济医学院提供。2 方法2.1 体内抗肿瘤活性的检测2模型组和Fucoidan各组按剂量要求预防性灌胃给药7 d。第7天给药后1 h，由荷瘤S180腹水型小鼠体内无菌抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至2.51010/L，混匀后，每鼠右腋皮下注射肿瘤细胞悬液0.2 ml。各组如前给药，连续2周，最后1次给药24 h，动物处死，并剖取各组动物皮下肿瘤，称重。与模型组比较，计算抑瘤率。2.2 体外抗肿瘤活性的检测2采用MTT法。10RPMI 1640生长培养基培养细胞，收集对数期细胞，用2RPMI 1640维持培养基调节细胞浓度，

8、除空白调零孔外， 每孔均匀接种约2104个细胞180 l到96孔板中。空白调零孔仅加入10RPMI 1640 180 l。37、饱和蒸气、5CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，37、饱和蒸气、5CO2培养箱培养过夜使其充分贴壁，然后除空白调零孔及正常对照孔外，每孔分别加入终浓度为510-1， 110-1， 510-2 ， 110-2，510-3，110-3，510-4，110-4mg/ml的Fucoidan20 l，每个浓度各设4个复孔，正常对照孔仅加入PBS 20 l。因Fucoidan有颜色，每个浓度组均设一不加细胞，只加20 l 相应浓度培养液的对照孔。Fucoidan继续培养48 h后，

9、 弃去孔内液体，每孔加入5 mg/ml MTT 20 l, 37、饱和蒸气、5CO2培养箱放置4 h。每孔加入DMSO 20 l,37、饱和蒸气、5CO2培养箱放置30 min后，平板离心机2 000 g10 min离心后，低速振荡15 min, 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的光密度值（OD570）。给药各组所测OD570需减去对照孔OD570。 2.3 对正常小鼠免疫功能的影响 碳粒廓清法3：各组按分组灌胃给药7 d, 1次/d。最后一次给药后1 h，每只小鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁0.1 ml/kg，注毕即刻计时。在注射墨汁后3 min和13 min，分别以预

10、先用肝素处理过的玻璃毛细管刺入小鼠眼内眦取血0.025 ml，将所取血液加入含0.1Na2CO3 2 ml的试管中，摇动试管使均匀混合，在分光光度计上测定600 nm波长处每个样品的光密度值（OD600）, 0.1Na2CO3液作空白对照。称重肝脾 末次取血后，立即颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脾，去除脂肪和结缔组织，滤纸拭干后分别称重记录。并计算清除速度K值、吞噬指数和脾、胸腺脏器指数： 清除速度K值K=LgOD1-LgOD2t2-t1 吞噬指数（每克组织重量的吞噬活性）：=体重肝重-脾重3K 脾、胸腺脏器指数器官重量/体重10 2，4-二硝基氟苯（DNFB）诱导迟发性变态反应（DTH）2：各组按

11、分组灌胃给药7 d，1次/d。第7日给药后，每鼠腹部剪毛（3 cm3 cm），均匀涂抹1% DNFB 50 l致敏，继续用药后第5天再用1% DNFB10 l攻击右耳，24 h后处死动物，用打孔器取下直径8 mm耳片，称重，以左右耳重量之差（肿胀度）来表示DTH程度。2.4 统计学处理数据均以s表示，两组间均数比较采用t检验。3 结果3.1 Fucoidan对S180实体瘤的抑制作用肉眼观察，模型组小鼠瘤块不断增大，边界不清，不易剥离，而Fucoidan小、中、大各剂量组瘤块与周围组织界限较清楚。表1所示，Fucoidan能明显抑制小鼠S180实体瘤的生长，且呈现剂量相关性，其抑瘤率达到环磷酰

12、胺阳性对照的70.4%78.2，提示具有有效的抗肿瘤生长作用。表1 海藻提取物对小鼠S180实体瘤重量的影响（略）3.2 Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的影响结果见表2。Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞的A570均无显着影响。提示其并无直接杀伤肿瘤细胞的能力。表2 Fucoidan对体外培养A549细胞、HeLa细胞和L1210细胞OD570的影响（略）3.3 Fucoidan对正常小鼠免疫功能的影响4 讨论 大量药理及临床研究表明，海藻中的提取物具有有效的抗肿瘤作用4，特别是多糖成分，能提高机体的免疫功能，用于癌症的辅

13、助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点5。本实验结果显示，海藻提取物Fucoidan能抑制小鼠移植性S180实体瘤的生长，具有确切的体内抗肿瘤作用。而就其机制而言，活性多糖一般是作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能，尤其是非特异性免疫功能，而间接抑制或杀死肿瘤细胞的6。碳粒廓清实验是反映非特异性免疫功能的经典实验，能表现单核巨噬细胞系统的吞噬能力，活化的单核巨噬细胞对肿瘤细胞可产生直接的杀伤和抑制作用，在机体对抗肿瘤的环节中起重要作用。而DNFB诱导迟发性变态反应（DTH）是机体细胞免疫功能的另一敏感指标，反映T淋巴细胞功能。Fucoidan能显着提高碳粒廓清实验中的廓

14、清指数K、吞噬指数、脾脏器指数和DNFB诱导迟发性变态反应（DTH）。但Fucoidan对体外培养肿瘤细胞的生长并未显示确切的直接抑制作用，这种对细胞无毒的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药。提示Fucoidan可能是通过增强免疫功能而发挥抗肿瘤作用。【参考文献】 1Takeshi Teruya, Teruko Konishi, Shuntoku Uechi, et al. Anti-proliferative activity of oversulfated fucoidan from commercially cultured Cladosiphon okamuranus TOKIDA in U937 cellsJ. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 40(3): 221.2徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学，第3版