第15章_核酸的研究方法课件

1、一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定1 1、DNADNA的分离提纯的分离提纯 研究发现，真核生物研究发现，真核生物DNADNA与蛋白质的复合物与蛋白质的复合物 (DNP(DNP）溶）溶于水和浓盐溶液，但不溶于于水和浓盐溶液，但不溶于0.14mol/L0.14mol/L的盐溶液，用的盐溶液，用苯酚苯酚或氯仿或氯仿使蛋白质变性，使蛋白质变性，DNADNA溶于上清液。溶于上清液。 在十二烷基硫酸钠（在十二烷基硫酸钠（SDSSDS）存在下用蛋白酶消化细胞，）存在下用蛋白酶消化细胞，再用再用苯酚和氯仿苯酚和氯仿除去蛋白质除去蛋白质，用，用RnaseRnase除去除去RNARNA，

2、操作在操作在低温低温下进行，防止过下进行，防止过酸、过碱酸、过碱或或机械振荡机械振荡，可得到高质可得到高质量的量的DNA.DNA.2 2、RNARNA的分离纯化的分离纯化1 1）注意事项）注意事项 由于由于RNARNA比比DNADNA更不稳定，而且更不稳定，而且RnaseRnase又无处不在，因此分又无处不在，因此分离离RNARNA更为困难，制备更为困难，制备RNARNA通常需要注意一下通常需要注意一下3 3点：点：（1）所有用于制备）所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高温灭菌，不能用高温灭菌的用具要用高温灭菌，不能用高温灭菌的用

3、具要用0.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC,其其能使蛋白质乙基化而破坏能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性活性）处理，再煮沸以除净）处理，再煮沸以除净DEPC。（2）在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使）在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使 RNase 失活。失活。（3）在）在RNA的反应体系内加入的反应体系内加入RNase的抑制剂的抑制剂。（2 2）另一种方法为胍盐）另一种方法为胍盐/ /氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心（蛋白质密（蛋白质密度小于度小于1.331.33，在最上层，在最上层， DNADNA密度约为密度约为1.711.71，位于中间，位于中间， RNARNA密度

4、大于密度大于1.891.89，沉在底部），沉在底部），用此法可制备大量高纯度用此法可制备大量高纯度的天然的天然RNARNA。2）常用分离方法）常用分离方法 （1 1）一种方法为）一种方法为胍盐胍盐/ /酚酚/ /氯仿法氯仿法。异硫氰酸胍是极强的。异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂，它几乎使所遇到的蛋白质都变性，然后用蛋白质变性剂，它几乎使所遇到的蛋白质都变性，然后用苯酚和氯仿除净蛋白质。此法可用于小量制备苯酚和氯仿除净蛋白质。此法可用于小量制备RNARNA。二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（一）（一）DNADNA酶法测序酶法测序四、核酸的核苷酸序列测定四、核

5、酸的核苷酸序列测定英国生物化学家英国生物化学家Frederide SangerFrederide Sanger英国生物化学家桑格由英国生物化学家桑格由于发现胰岛素分子结构于发现胰岛素分子结构和确定核酸的碱基排列和确定核酸的碱基排列顺序及结构而分获顺序及结构而分获19581958和和19801980年的诺贝尔化学年的诺贝尔化学奖奖我我SangerSanger不不过是个学习过是个学习成绩平平，成绩平平，从事的研究从事的研究工作普通，工作普通，退休后默默退休后默默无闻的人无闻的人 1 、加减法、加减法 SangerSanger于于19751975年设计的年设计的DNADNA快速测序法称为快速测序法称

6、为“加减法加减法”，其原理为：，其原理为：n1 1）以）以DNADNA单链为模板，单链为模板，4 4种脱氧核苷三磷酸（种脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）和）和DNADNA聚合酶，使聚合酶，使合成反应合成反应尽可能是随机的尽可能是随机的，合成产物中，合成产物中各种长度的片段都存在各种长度的片段都存在。n2 2）从反应体系中除去）从反应体系中除去 4 4 种种dNTP,dNTP,并将反应物分成并将反应物分成 8 8 组，组，4 4 组用于加组用于加法系统，法系统，4 4组用于减法系统，其中：组用于减法系统，其中：n 加法系统每组分别只加加法系统每组分别只加A A、G G、C C、T T一种一种d

7、NTPdNTP，DNADNA聚合酶的聚合酶的3 3 55外切酶活外切酶活性将除该核苷酸外所有性将除该核苷酸外所有33末端核苷酸都水解掉，于是末端核苷酸都水解掉，于是33末端末端都变成了该核苷酸。都变成了该核苷酸。n 减法系统中，每组加减法系统中，每组加3 3种种dNTPdNTP（分别减去（分别减去A A、G G、C C、T T一种一种dNTPdNTP），）， DNADNA聚合酶能够把片度继续合成下去，直到遇上所缺的核苷酸才停止。聚合酶能够把片度继续合成下去，直到遇上所缺的核苷酸才停止。这就得到了都在所缺核苷酸这就得到了都在所缺核苷酸前前一个核苷酸结尾的片段。一个核苷酸结尾的片段。n3 3）然后

8、将各组样品进行含变性剂（）然后将各组样品进行含变性剂（8mol8mol尿素）的聚丙烯酰胺凝胶电泳，尿素）的聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影的图谱上可以推测出从放射自显影的图谱上可以推测出DNADNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。DNA合成合成(放射自显影）放射自显影）片段之间相片段之间相差差1-3个核个核苷酸？苷酸？2、末端终止法、末端终止法 19771977年年SangerSanger对对DNADNA的酶法测序技术又进行了重要改的酶法测序技术又进行了重要改进，提出了进，提出了“终止法终止法”。其反应体系也包含单链模板、引。其反应体系也包含单链模板、引物、物、4 4种种dNTPdNTP和和DNA

9、DNA聚合酶。共四组，每组按一定比例加入聚合酶。共四组，每组按一定比例加入一种一种22，33双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸，它能随机掺入合成的，它能随机掺入合成的DNADNA链，一旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的链，一旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显影末端核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出图谱上直接读出DNADNA序列。序列。3、DNA自动测序自动测序1） 原理：原理：Sanger 末端终止法末端终止法2）研究进展）研究进展（1）放射性同位素标记自显影显示法：）放射性同位素标记自显影显示法： 依据上述原

10、理依据上述原理, 分别设计四个反应分别设计四个反应,每一反应中存在相同的单链每一反应中存在相同的单链 DNA 模模板、引物、板、引物、4 4 种种dNTP 和和1 1种种ddNTP。在每组反应中。在每组反应中, 通过控制通过控制dNTP 和和ddNTP 的比例的比例, 就可得到不同长度的、终止点相同的四组就可得到不同长度的、终止点相同的四组DNA新链；新链； 用用放射性同位素分别标记这放射性同位素分别标记这4 4组组DNA新链新链,然后将这然后将这4 4组组DNA 新链分别在新链分别在4 4个通道上进行个通道上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳； 将凝胶层暴露在将凝胶层暴露在X射线下射线

11、下, 用放射性自显影显示电泳谱带用放射性自显影显示电泳谱带, 就可精确地就可精确地按核酸片段的大小将它们分开。按核酸片段的大小将它们分开。 综合四个反应平行电泳的谱带分布综合四个反应平行电泳的谱带分布, 便可读出整个便可读出整个DNA的序列的序列。这种方。这种方法一次可读出法一次可读出300400 对对核苷酸序列。核苷酸序列。（2）荧光染料标记的实时光学监测荧光染料标记的实时光学监测 DNA 测序测序 19861986年，年，Smith Smith 等人首创了一种荧光染料标记的实时光学监测等人首创了一种荧光染料标记的实时光学监测DNADNA测测序方法。序方法。 1 1）选取四种不同的荧光染料来

12、代替放射性同位素选取四种不同的荧光染料来代替放射性同位素分别标记终止于分别标记终止于A A、C C、G G、T T 的四组降解后的的四组降解后的 DNA DNA 片段。这些荧光染料的荧光和散射背景片段。这些荧光染料的荧光和散射背景较弱较弱, , 提高了信噪比提高了信噪比; ; 它们的它们的激发线较接近而发射线均位于可见光范围激发线较接近而发射线均位于可见光范围, , 且不同染料的发射光谱相互分开且不同染料的发射光谱相互分开, , 如如易于监测。易于监测。 2 2）将处理后的）将处理后的四组四组DNA DNA 片段置于同一通道上进行电泳。片段置于同一通道上进行电泳。用氩离子激用氩离子激光器的光器

13、的488.0 488.0 或或514.5nm 514.5nm 线来激发染料线来激发染料, , 用光电倍增管收集染料的发射用光电倍增管收集染料的发射光谱光谱, , 将所得信息直接送计算机处理将所得信息直接送计算机处理, , 就可得到就可得到DNA DNA 序列信息了。序列信息了。荧光染料标记荧光染料标记DNA 自动自动测序测序自动化测序结果自动化测序结果（3）荧光染料标记的实时光学监测荧光染料标记的实时光学监测DNA 测序改进测序改进 荧光标记使荧光标记使 DNA DNA 测序技术在近测序技术在近年来有了长足的发展年来有了长足的发展, , 包括荧光染包括荧光染料（红外染料标记）、电泳系统料（红外

14、染料标记）、电泳系统（高压毛细管电泳）、激光激发和（高压毛细管电泳）、激光激发和光学探测系统的改进，使光学探测系统的改进，使DNA DNA 测序测序仪的实用性大大提高，大规模测序仪的实用性大大提高，大规模测序一个碱基的成本从一个碱基的成本从19861986年的年的0. 5 0. 5 美元降到目前的约美元降到目前的约 7 7 美分，甚至美分，甚至更低。更低。ABI 全自动自动DNA 测序测序仪二）二）DNA化学法测序化学法测序 化学法测序由化学法测序由 Maxam Maxam 和和 Gilbert Gilbert 于于19771977年发明。其基年发明。其基本原理是：本原理是：先用限制性内切酶把

15、先用限制性内切酶把DNADNA切成切成1010200bp 200bp 的测序材料；的测序材料；用碱性磷酸化酶处理该片段，用碱性磷酸化酶处理该片段，消除消除 55末端上的磷酸末端上的磷酸；在在 5OH5OH端标记端标记 3232P P，用多核苷酸磷酸激酶催化；，用多核苷酸磷酸激酶催化；标记片段变性为单链；标记片段变性为单链；用用特异的化学试剂特异的化学试剂作用于不同的碱基进行作用于不同的碱基进行修饰修饰，然后用，然后用哌啶哌啶切除碱切除碱基，基，DNADNA链断裂成片段，用四组不同的链断裂成片段，用四组不同的特异反应特异反应可以使末端标记的可以使末端标记的DNADNA分子切成不同长度的片段，分子

16、切成不同长度的片段， 产生一组长度不等的产生一组长度不等的DNADNA片段；片段；经电泳和放射性自显影后，从经电泳和放射性自显影后，从4 4个反应系统统一阅读，待测个反应系统统一阅读，待测DNADNA的全的全部核苷酸序列就可直接读出。部核苷酸序列就可直接读出。 碱基碱基特异修饰方法特异修饰方法GpH8.0,pH8.0,用硫酸二甲酯对用硫酸二甲酯对 N7N7进行甲基化进行甲基化, ,使使 C8-C9C8-C9键键对碱基裂解有特殊敏感性对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的哌啶甲酸可使嘌呤环的N N原子化原子化, ,从而导致脱从而导致脱嘌呤嘌呤, ,并因此消弱腺嘌

17、呤和鸟嘌呤的糖苷键并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环肼可打开嘧啶环, ,后者重新环化成五元环后易除去后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/L NaCl1.5mol/L NaCl存在时存在时, ,可用肼除去胞嘧啶可用肼除去胞嘧啶4 组特异性反应组特异性反应示例示例三）三） DNADNA最新测序技术最新测序技术n1 1、质谱法、质谱法(mass spectrometry)(mass spectrometry)n新型的电离技术如电喷雾离子化和基质新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法分析大辅助激光吸收技术使利用质谱法分析大片段片段DNA DNA 成为可

18、能。成为可能。美日瑞三国科学家分享美日瑞三国科学家分享20022002年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 瑞典皇家科学院把年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰瑞典皇家科学院把年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰芬恩、芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特维特里希，以表彰他们发明了对维特里希，以表彰他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法，其中芬恩和田中的贡献在于开发出生物大分子进行识别和结构分析的方法，其中芬恩和田中的贡献在于开发出了对生物大分子进行质谱分析的了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法软解吸附作用电离法”，维特里希的贡献，维特里希的贡献是开

19、发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人是开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有“革命性的革命性的”意意义。义。 质谱分析是全世界各个化学实验室都在使用的一种非常重要的分析手段。质谱分析是全世界各个化学实验室都在使用的一种非常重要的分析手段。以前，它只是用于小分子的分析研究。现在，由于以前，它只是用于小分子的分析研究。现在，由于芬恩和田中芬恩和田中的发明，的发明，质谱质谱分析也可以用于生物大分子的分析研究分析也可以用于生物大分子的分析研究。利用芬恩年所

20、公布的研究。利用芬恩年所公布的研究成果，研究人员可以获得电荷蛋白质液滴，并最终获得自由盘旋的蛋白质离成果，研究人员可以获得电荷蛋白质液滴，并最终获得自由盘旋的蛋白质离子，通过使它们运动可以确定其质量，测出飞过指定距离所用的时间。同时，子，通过使它们运动可以确定其质量，测出飞过指定距离所用的时间。同时，田中还发明了另一种可以造成蛋白质自由盘旋的技术田中还发明了另一种可以造成蛋白质自由盘旋的技术软激光解吸附作用软激光解吸附作用技术。研究人员可以用这种技术把取样击成许多小块，迫使分子释放出来。技术。研究人员可以用这种技术把取样击成许多小块，迫使分子释放出来。 约翰约翰芬恩芬恩 田中耕一田中耕一 芬恩

21、芬恩1917年生于纽约，年生于纽约，1940年获美国耶鲁大学化学博士学年获美国耶鲁大学化学博士学位，现为美国弗吉尼亚联邦大学教授。田中位，现为美国弗吉尼亚联邦大学教授。田中1959生于日本富山生于日本富山市，毕业于日本东京大学，现是日本京都市岛津制作所研究与开市，毕业于日本东京大学，现是日本京都市岛津制作所研究与开发发工程师工程师。DNA sequence analysis by MALDI mass Spectrometry Finn Kirpekar，et al, 25542559, Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. ABSTRACT:C

22、onventional DNA sequencing is based on gel electrophoretic separation of the sequencing products. Gel casting and electrophoresis are the time limiting steps, and the gel separation is occasionally imperfect due to aberrant mobility of certain fragments, leading to erroneous sequence determination.

23、Furthermore, illegitimately terminated products frequently cannot be distinguished from correctly terminated ones, a phenomenon that also obscures data interpretation. In the present work the use of MALDI mass spectrometry for sequencing of DNA amplified from clinical samples is implemented. The una

24、mbiguous and fast identification of deletions and substitutions in DNA amplified from heterozygous carriers realistically suggest MALDI mass spectrometry as a future alternative to conventional sequencing procedures for high throughout screening for mutations. Unique features of the method are demon

25、strated by sequencing a DNA fragment that could not be sequenced conventionally because of gel electrophoretic band compression and the presence of multiple non-specific termination products. Taking advantage of the accurate mass information provided by MALDI mass spectrometry, the sequence was dedu

26、ced, and the nature of the non-specific termination could be determined. The method described here increases the fidelity in DNA sequencing, is fast, compatible with standard DNA sequencing procedures, and amenable to automation.2 2、DNADNA芯片测序芯片测序 基本原理基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, , 每个点

27、播每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置. .待检测的待检测的DNADNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴, ,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号发出信号, ,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装比组装, ,拼接成完全的拼接成完全的DNADNA顺序顺序. .1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 样品 TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图

28、形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理利用基因芯片进行杂交测序的原理3、单分子测序法、单分子测序法(single-molecule seguencing)n单分子测序法是美国单分子测序法是美国Los AlamesLos Alames国家实验室国家实验室(LANL )(LANL )发展的一种通过检测标记在发展的一种通过检

29、测标记在单个分子上的荧光单个分子上的荧光进行进行DNADNA快速测序的方法。模板快速测序的方法。模板DNADNA分子首先通过酶法修分子首先通过酶法修饰或合成饰或合成，使不同的荧光素标记不同的碱基使不同的荧光素标记不同的碱基，然后，然后，用两个激光束用两个激光束( (或称激光镊子或称激光镊子lasertweezer)lasertweezer)夹住标夹住标记的记的DNADNA分子，将其置于液流系统，从被固定的核苷分子，将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸，酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸， 通过通过单分子荧光探测器单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信号顺序确定酸，再根据检测到的信号顺序确定DNADNA顺序顺序。4. n脱氧三磷酸核苷酸连接到脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3-DNA 3-末端时会释放末端时会释放1 1个个焦磷酸焦磷酸(PPi) ,(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化焦磷酸在磷酸