基因工程1.2基因工程的操作程序

1、基因组文库基因组文库部分基因文库如：部分基因文库如： 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。文库。 受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。种生物的基因组文库。 受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如物的部分基因文库，如cDNA文库。文库。基因文库的构建

2、模式图基因文库的构建模式图通过对通过对受体菌受体菌的培养而的培养而储存基因储存基因DUCK179制作提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）片段）mRNA反转录酶反转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物cDNA文库文库返回根据目的基因的有关信息，如：根据目的基因的有关信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的已知

3、核苷酸序列；基因的功能；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA；基因的表达产物蛋白质；基因的表达产物蛋白质； PCR是多聚酶链式反应（是多聚酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用它是利用DNA 双链复制的原理，双链复制的原理，将基将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外又叫做体外DNA扩增技术。扩增技术。已知基因的核苷酸序列、已知基因的核苷酸序列、4种脱氧核

4、苷酸、一对种脱氧核苷酸、一对引物、引物、Taq酶酶 （及缓冲溶液）（及缓冲溶液） 过程过程： 变性变性（90 95）退火：退火：引物与单链互补结合（引物与单链互补结合（55 60） DNA聚合酶作用下聚合酶作用下延伸延伸（70 75） 条件条件：DNA模板、引物、热稳定模板、引物、热稳定DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、。聚合酶、四种脱氧核苷酸、。方式方式: :多聚多聚酶链式反应酶链式反应高温变性高温变性（9095）低温退火低温退火（5560）中温延伸中温延伸（7075）p 双链双链DNADNA是在高温条件下解链为单链是在高温条件下解链为单链DNADNA的，因此整个过程不需要解旋的，因此整个过程不

5、需要解旋酶。酶。多次多次重复重复DNA合成仪合成仪推推测测推推测测合合成成（二）基因表达载体的构建（二）基因表达载体的构建 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。同时，使目的基因能够表达和发挥作用。1. 1. 目的基因目的基因2. 2. 启动子启动子 RNARNA聚合酶识别和结合的一聚合酶识别和结合的一段特殊结构的段特殊结构的DNADNA片段，位于基因的首片段，位于基因的首端，端，RNARNA聚合酶与之结合才能驱动基因聚合酶与之结合才能驱动基因转录出转录出mRNAmRNA，进而获得需要的蛋白质

6、。，进而获得需要的蛋白质。3. 3. 终止子终止子 一段特殊结构的一段特殊结构的DNADNA片片段，位于基因的尾端，作用是使转段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。录在所需要的地方停止。4. 4. 标记基因标记基因 鉴别受体细胞中是否鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。的细胞筛选出来。将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞

7、混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子 目的基因是否真正插入受体细胞的目的基因是否真正插入受体细胞的DNADNA中，是否中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。测、鉴定才能得知。 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。进行。1. 1. 检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 提取受体生提取受体生物全部物全部DNA适当限制适当限制酶切割酶切割DNA片段片段用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片

8、段杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）分子杂交技术分子杂交技术2. 2. 检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA mRNA 提取受体生提取受体生物的物的mRNA用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已转录出了（表明目的基因已转录出了mRNA） 检测检测DNA利用的是利用的是DNA与与DNA杂交，检测杂交，检测mRNA利用利用的是的是DNA与与mRNA杂交。杂交。3. 3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术提取受体生提取受体生物的

9、蛋白质物的蛋白质与相应抗体杂交与相应抗体杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（表明目的基因已形成蛋白质产品）例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。并得到表达。，1.放射性同位素或荧光标记2、利用杂交原理可以检测病毒，检测目的基因是否导入受体DNA中，检测是否转录，可以判断两种生物是否具有亲缘关系，还可以检测某些疾病归纳: 基因工程的基本操作程序1.1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCR技术技术u 人工合成人工合成2.2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3. 将目的基因导入受体细胞将目的