PIC人工授精GTC标准操作指南精液的处理

1、PAGE PAGE 14 精液的处理chapter 7精液的处理精液处理的目的，就是以一种高效、低成本的方法来最大数量地获取高质量精液头份数。精液处理所需的设备和仪器虽然具体的人工授精实验室在功能，规模和复杂程度等方面都是不尽相同的，但不管是建立农场中或是独立于农场外的人工授精实验室，都必须根据高标准的生物安全和卫生标准来进行装备和运作。在大多数情况下，尽可能使用一次性的用品（如：用来进行精液采集和稀释的用品，输精管等），这将会消除由于使用没有完全清洗干净的用品而造成的潜在问题的存在。如果不使用一次性的用品，那就必须建立一个有效的程序来清洁和消毒这些用品和设备。人工授精实验室所需的基本设备显微

2、镜：尽管可供选择使用的显微镜有多种，但必须应包括100倍，400倍1000倍物镜（油镜），双筒目镜，恒温载物台（可保证精液样本处在一个基本恒温的状态中）。盖玻片，载玻片和毛细吸管。电子称：精液的体积是通过称其重量来间接测量的，这是当前测量精液体积最常用的方法。温度计：两根30cm（12英寸）的温度计。若干广口容器：体积从1L到5L的玻璃或塑料广口容器，用来配制稀释液和稀释精液。1 / 14精液包装设备：可手工、全自动或半自动化操作的精液分装仪器和设备。精液的处理chapter 7光密度仪：用来检测样本中精子的数量（精液密度或浓度），由此可以更加精确的进行精液稀释，并稀释出尽可能多的精液头份数。

3、但是光密度仪十分昂贵，且必须在使用前进行校准，因此其通常仅用于大规模以及商业化精液生产中。水浴锅：用来控制稀释液的温度。精液分装袋或输精瓶及瓶盖。精液贮存设备：短期贮存和运送精液所用的泡沫箱、恒温箱或者培养器。消毒设备：用来消毒输精管和其它用具的设备。如消毒托盘、电热电动导管消毒器、高压消毒锅。输精管：橡胶输精管或一次性输精管。净水制造系统：制造蒸馏水或反渗透水的设备仪器，确保使用高质量的水是非常重要的，质量不好的水可降低贮精的活力。烘干设备：用来干燥和贮存所有采集和检测精液用的设备。其他可选择使用的仪器设备硬水软化器：这种设备适用于水质较硬的地区。尽管软化后的水并不能用于稀释精液，但是可以用

4、来清洗人工授精器械。加热板：预热载玻片、盖玻片和相关设备。伊红苯胺黑染色剂 （或其它染色剂）：进行精子染色以检查其形态。磁力搅拌器（加热）：用于较复杂稀释液的配制。 精液质量的评估2/14全面的精液评估包括确定精子细胞的数量和评估其活力（精液样本中直线前行的精子所占总精子数的百分比）。精液的质量评估应在采精后立即进行。有些评估项目在精液稀释前进行，而有些评估项目要在精液稀释后进行。精液的处理chapter 7 原精检测项目 稀释后的检测项目 气味、体积 稀释后活力 数量、最初活力、 贮存后活力 最初形态 混合精液的活力 稀释前作好以下记录气味 洁净的精液稍有腥味，被包皮积液及尿液污染的精液则有

5、非常明显的腥臭味。体积 通常一头公猪的射精量可达150250ml，但这个范围可扩大到50500ml。它通常是通过称重而不是直接称量其体积 来测量的(1g=1ml)。对精液气味和体积检查完毕后，就需要用显微镜，血细胞计数板或光密度仪来评估精子的数量、活力和形态了。如果没有显微镜、血细胞计数板或者光密度仪来检查精液，就只好用眼睛对其进行评估了。假如仅靠视觉来评估精液的质量和浓度，那么人工授精的优势就不会充分发挥出来。数量 测定精子数量最常用的仪器是：血细胞计数板、光密度仪3/14血细胞计数板，这是一个可用于测定精液中精子数量的特殊载 玻片。精液的处理chapter 7光密度仪，是用来检测精液样本透

6、光度的仪器。精子或其它细胞可以阻碍光线的穿过，浓度大的精液会吸收更多的光，浓度低的精液就会有更多的光透过。光密度仪的缺陷，是其在使用前必须校准后才能检测精子浓度。另外，上皮细胞和其它体细胞及大分子的蛋白质也会阻碍光在精液中的通过，从而影响测定结果。如果在精液中存在着大量的非精子细胞，那么光密度仪显示的读数就会偏大。基于以上原因，用血细胞计数器测定精子数量是比较准确的。但与血细胞计数板相比，光密度仪具有操作简单、测定迅速的优点。因此，在日常生产中一般使用光密度仪。此外，使用光密度仪时，每3-4个月，就需用血细胞计数器来校正它的读数，以确保其读数的准确性。也可以使用Spermacue 来测定精子数

7、量，其需用的样本很小，使用方法和光密度仪一样。它带有一个过滤器，这样可以在每次使用时重新教正。利用精液的体积和密度可以计算出精子的总数，也就可以得出每一包装头份所需的原精量，然后计算出稀释液的需要量。活力用来评定精子的可使用能力，通常是用样本中直线前行的精子的百分数来表示的。这是一项主观性的检测，需要经过不断的训练和练习以后才能达到准确可信。精子活力受许多不同的环境因素影响，包括温度，贮存时间和使用的稀释液种类。在这些因素中最重要的是温度。猪的精细胞在32-38之间，活力可达到最佳。为了避免造成对精细胞的温度打击，使精液的活力降低。应在精液活力评估之前，把载玻片放在培养器内，或者放在热的装置上

8、预热，然后再在其上滴上精液进行活力评估。4/14把载玻片预热到大约35，然后用一次性吸管在其上滴一滴原精，再放一块盖玻片，制成一个精细胞薄层玻片，这样在显微镜下就可看到一幅比较清晰的精液画面了。如果要检查贮精，先要把其预热到室温，再滴一滴 待检精液，然后放在32-38的加热板上，预热数分钟后，放到显微镜下检查。或者也可在镜检之前，把贮精容器或者待检样本水浴加热几分钟，以达到理想的温度。精液的处理chapter 71. 原精活力用显微镜将原精样本放大到100倍和400倍来评估原精活力。观察的时候要选取载玻片上的几个不同点，以使样本具有代表性。原精的活力评分通常用0-5分来表示。这是因为，精确的评

9、估出原精中活动精子所占的比例是不可能的，因此原精活力不用百分数表示。如果原精活力不高，在0分-1分之间，那就再制作一个样本，但必须保证载玻片盖玻片以及吸管的温度为35。如果结果仍然不好，就抛弃这份精液。活力评分分值 活力评估没有运动的精子或没有精子没有作直线前进运动的精子，包括只有头部或只有尾部振动的精子以及原地打转的精子。运动缓慢，轨迹不明显。运动缓慢，轨迹的总趋势为直线前进运动。 较快直线前进运动。快速直线前进运动，尾部呈鞭状摆动。 2. 稀释后精液的活力取一滴稀释后的精液，放在显微镜下，可观察到样本中的单个精子，稀释精液的活力可以用样本中，向前直线运动精子的百分比表示。如果活力低于60%

10、就抛弃原精。贮存时间和稀释液种类都会影响精液活力。通常在低温下贮存后的精液，预热时，精子只作缓慢的摆动，这是正常的。如果贮精活力的第一次检查结果不好，在10-15分钟后再检查一次。5/14有些种类的稀释液含有的成分，即使是在理想温度下也会抑制精子的运动和代谢。在这种情况下，可以用涂有咖啡因的载玻片刺激其活力。使用这种载玻片，就必须在几分钟内对精液进行评估，否则如果时间过长，他们会由于咖啡因的作用而过度的活动，最终导致活力的迅速降低。精液的处理chapter 7公猪的繁殖力可以用使用了该公猪精液的母猪的产胎率和活仔数来直接衡量。如果一头公猪已是一百多窝猪的父本，就用它的繁殖力作为其个体记录。一般

11、来说，精液活力非常低的公猪，其受胎率要低于精液活力正常的公猪。但当精液的活力处于正常范围内时(60-100%)，精液活力和繁殖力之间就没有什么关系了。也就是说，使用活力为90%或60%精液所配母猪的产胎率都可以达到80%。形态评估精子液可利用能力的另一种方法就是评估其形态，这是非常费时间的，它要求经过培训，练习，并且需要有耐心。要评价精子的形态，就要用染色的方法来判定其样本中活精子及正常形态精子的百分数。一种常用的染色方法是伊红苯胺黑染色法，它可以区分死活精子，活精子是不着色，白色的，而死精子则被染成了红色。其他还有多种简单的染色法。如何检查染色后的精子。用1000倍油镜放大检查100个精子(

12、在样本上选三个位置，每个位置检查大约33个精子)。既要检查精子的整体形态，又要检查其局部形态。形态正常的精子所占的比例表明了精液的质量水平。既使一个精子的形态有多种异常，但只记录一个就够了。当精子样本中的精子异常率超过20%时，就弃掉这份精液。对于所有公猪来说，当怀疑其精液中有超过20%的异常精子时，那么就对其后每一次所采的精液作形态检查，直到连续两次检查结果的异常精子数都低于20%为止，再开始重新其精液。有时也可通过增加精液的浓度来弥补精液中异常精子比例高的不足。然而，并不是所有的精子的异常现象都能通过增加精液的浓度来弥补。记录所有采集精液的精子形态，根据此记录来评估在一段时间中精液质量的变

13、化。没有必要每次都检查精子的形态，但是对每个公猪第一次射精都要做形态检查记录。此后可一个月检查一次。6/14精液的处理chapter 7稀释精液精液稀释有两个原因：增大体积以提高其利用率；为精子提供一个有利于保存的环境。稀释剂中包含有缓冲成分(柠檬酸钠)和营养成分(葡萄糖或果糖)。缓冲剂可以防止因pH值变化而造成的精液的死亡；当精子用完了精液中的营养，营养剂 可以提供其营养。稀释液中还含有抗生素，可阻止精液在贮存过程中产生细菌。细菌繁殖产生的毒素将损害精子，所以限制细菌的生长是非常重要的。定期将样本去兽医实验室进行细菌检查，根据其中存在的细菌种类，确定需要添加的抗生素。在一些商品稀释剂中已含有

14、抗生素。尽管加入抗生素对于抑制精液中的细菌生长是非常有效的，但是它们也不能因此掩盖实验室存在的卫生隐患。它们是免疫机制中的最后防线，只有在稀释液中加入各种适合的抗生素，才能降低或消除原精处理过程中的细菌污染，以确保贮精有个适合的生存环境。如果添加了抗生素就不在注意精液处理过程中的卫生问题是非常错误的。稀释剂的添加不是来消除精液处理过程中存在的卫生问题。此外，经常使用抗生素，将会产生细菌的抗药性。经稀释后的精液的寿命相对比较短暂，精子将逐渐消耗掉稀释剂中的营养物质并且产生废物。因此，精液贮存时间越长，其受胎率也越低。稀释剂的选择稀释剂主要有两种类型。7/14长效稀释剂：这种稀释液可以使精子的寿命

15、延长到5-7天，在贮存时间较长或要进行长距离运输时，必须用此稀释液。 这种长效稀释剂的成分很复杂，准备这些原料很困难。精液的处理chapter 7短效稀释剂：它可以保证精子存活3天。这种稀释液被广泛用于人工授精，这种稀释剂很便宜，且容易配制。许多人工授精实验室采用在周末使用长效稀释液，而其他时间使用短效稀释液的方法。稀释剂质量控制的项目有：渗透压，pH值及该批次的稀释剂配制的稀释液对精子活力的影响。稀释液生产商只允许使用分析纯级的配料，并且配置过程要求极为严格。每个稀释液的包装袋上都印有生产批号及有效日期，以便使用时进行存量控制。许多商品化的稀释剂是包装在防水、避光和密封的容器中的，并有非常清

16、楚的贮存说明。尽管详细的说明各不相同，但是总的说来，他们都建议稀释剂应该贮存在凉爽、黑暗和干燥的地方，最好不要超过2-8。当稀释剂到货时，记录其批次号是很重要的，要确保先使用早到达的。每次安排3个月用量的定货。与送货商制订一个协议，以确保稀释剂的供应。一旦你打开了稀释剂的包装，就要将其贮存在4的冰箱中以确保其质量，这是成功的人工授精操作需要的一个重要环节。只有经过深思熟虑和绝对必要的情况下才可以考虑更换稀释液，并接受新的生产商建议的使用方法。一些人工授精机构选择自己配制稀释剂。这就需要其具有很高的质量控制水平、时间和设备上的大量投入。配制精液稀释剂不是一件容易的事。如自己配制每日用的稀释剂，就

17、需要留有每批次的样本，用来检查其渗透压，pH值和其对精液的影响。如果你选择自己配制稀释剂， 要注意一定要使用分析纯级的原料。我们不赞同小规模农场或没有时间和这方面经验的农场来自己配制稀释剂。实际上，很多商业性人工授精站都是使用价格合理，质量有保证的商品稀释剂。8/14精液的处理chapter 7准备稀释液精液稀释剂中的各种成分有着精细的平衡，所以在稀释液准备时要十分仔细小心。用电子称准确称取需要量的稀释剂。要遵照生产商说明的使用量来做。注意不正确的稀释液浓度将会杀死精子。在称取好所需量的稀释剂粉剂后，把其加入到一定量的蒸馏水中。预热蒸馏水到30-35 ，这可使稀释剂溶解的更快。但是要注意，一些

18、种类的稀释剂中含有的成分，要求其只能溶解在冷的蒸馏水中。准备每日用量的新鲜稀释液，不要在其配制好，超过24小时以后再使用。使用新鲜的稀释剂可确保其含有适当浓度的抗生素，稀释液过时将会导致抗生素浓度的降低。有研究表明，室温下贮存72小时的稀释液，其抗生素浓度将会降低25%。尽管我们要尽量使用新鲜的稀释液，要在其配制好后24小时内使用，但也要注意，稀释液中的缓冲成分需要时间来平衡、稳定。因此，稀释液最好在配制好60分钟以后使用。稀释精液使稀释液和精液温度相同是很重要的。在稀释精液前，测量精液和稀释液温度（精液温度大约为35），如果两者温度相差不超过1，就可将适量的稀释液加入到精液中，并将两者轻柔混

19、匀。每包装头份应至少含有20亿个有效精子，至多含有45亿个有效精子，输精体积至少为70ml。一旦精液被稀释好，就可进行分装了。分装好后，贴好写有采精日期、公猪耳号的标签。然后发送或将其贮存在15-20的精液贮存箱中。9/14精液的处理chapter 7精液的贮存和运输稀释精液的贮存最好的精液贮存方法，是将其贮存在温度设置在15-20的温控箱中。有些稀释后的精液在贮存期间会沉淀、聚集，所以应该每日摇匀精液两次。稀释的精液在贮存2-3日后，有效精子数将会减少，因此在使用前需要检查精液的活力，以确保使用的精液活力大于60%。在略低的温度下（15-20）可延长精子的存活期。这是因为降低温度可使精子的代

20、谢水平降低，较低的代谢水平将会消耗较少的营养物质，产生较少的废物，从而延长精子的寿命；但低于15的温度将会损害精子。猪的精子比其他动物的精子对于低温更为敏感，而高于20 的温度将不会降低精子的代谢水平，因此，密切注意并控制精液贮存期间的温度变化对于维持精液的活力是很重要的。关于购买精液对于一些单位，购买商品精液可能比自己采精、处理精液更为有利。购买商品精液前需要制订一个精液运送时间表，使得其与母猪发情时间一致，这一点是很重要的。贮存精液的受精力在采精后的最初48-72小时是稳定的，而与所使用的稀释剂种类无关；但是在72小时后，精液的受精能力开始降低，但是这种衰减率会因稀释剂种类的不同而有所不同

21、，使用长期稀释液会延长精液的受精能力。因此精液运送时间表要确保其在输精前已保存时间不超过3天。10/14要想能够正确的确定精液运送时间，就应该知道：母猪群断奶后发情活动的模式；精液存活期；精液生产单位的精液采集时间表和发送时间表。一旦你知道收到的精液的平均日龄和母猪群返情的平均模式，你就可以确定输精的时间了。例如，精液在星期一的早晨采集包装，在星期一中午到达农场，然后母猪群将在星期一下午，星期二，星期三或星期四早晨接受已保存少于72小时的精液。如果大部分母猪不可能在星期四早晨发情，可以通过提早断奶来控制母猪的发情时间。精液的处理chapter 7精液的运输当精液需要从其采集包装的地方运送到受精

22、的农场时，一定要确保在整个运输过程中，其质量得到保证。在任何情况下，精液都应该保存在15-20，当精液的温度超过20后，精液的存活期将缩短。当精液的温度显著的低于15时，其将受到冷打击而死亡。精液在运输前，一定要使其在实验室中逐渐达到温度的最佳范围（15-20），从精液处理分装完毕到精液的温度降到这一温度范围内，这个过程需要2-3小时。然后精液应该包装保存在一个能够在整个运输过程中维持其温度的容器中。容器的选择要考虑运输过程中的温度变化和运输的时间。目前，大多数精液是通过泡沫箱来运输的，其壁越厚，绝热效果越好。有些人工授精站有几种厚度的泡沫箱，可以用来在不同环境温度下进行不同要求的包装。当需要

23、时还可以填充一些碎泡沫物质。如需要，在内外层包装箱间还填装保温袋或制冷袋。当精液可能暴露于极端温度环境下时，就应该使用带有恒温控制系统的精液贮存箱，其电源可由运输车辆的电池提供。注意尽量减少运输时间，减少运输交接环节。最好使用专用车辆运送精液到其最终目的地。如果精液是通过航空运输的，那么要确保精液是保存在飞机的旅客舱，或至少保存在有温度控制的部分。向运输公司解释清楚精液包装的性质和其贮存的详细要求是很重要的，以确保精液以适当的方式运输。同时应在包装上贴上相应的说明。11/14精液的处理chapter 7控制精液处理过程中的卫生实验室的卫生制度是为了防止精液在处理过程的各个环节中受到污染；避免实

24、验室中各种潜在污染源的存在。不应该在精液处理实验室进行细菌生物学研究分析，应将要检测样本送到当地的专业实验室进行细菌生物学的分析、检测。确保实验室工作人员在实验室工作时穿着干净的外套和鞋子。一般不允许其他猪舍的人员没有换衣服而直接进入实验室，如要进入，他们最好要在全身淋浴后或至少洗手后再进入实验室。实验室工作人员也应在进入生产区前进行全身淋浴，并要注意在工作期间经常洗手。除了必要的参观者外，限制其他人员进入实验室。实验室的设计要易于清洁。需要有可擦洗的墙壁、地板、屋顶和工作台面。建立一个日常实验室清洁程序。使用合适的清洁剂。注意有些清洁剂具有芳香剂，可伤害精子。70%的酒精是实验室理想的清洁剂

25、。实验室尽可能使用一次性设备和用具，特别是那些与精子和稀释液直接接触的用具。操作过程中使用一次性塑料袋是很好的方法，但是要确保其对精子没有伤害。根据生产商的说明来贮存所有实验室易耗品，注意失效期。避免使用任何长期开口容器盛放的物品。如果购买的稀释剂是桶装的，那么采取预先称取每日所需剂量的稀释剂，用小塑料袋分装后密封保存的办法。对于实验室用水以及配制稀释液用纯净水的水源，要特别注意。研究表明，水质在稀释液配制好后就开始降低。不要一次准备和购买大批量的用水。如果是购买的水，则要小心保存，避免阳光直射。12/14确保实验室操作用水是经过“去微生物”处理的。精液的处理chapter 7注意厂商关于纯净水生产系统的消毒说明。特别是贮水罐和出水口的消毒。使用小容量的贮水容器。定期进行精液样本中的微生物计数。不同规模的人工授精站，需要进行的样本检测频率也不同，通常进行月度或季度的检测就可以了。如是新鲜的稀释精液样本，则需进行培养后再检测。进行稀释精液中存在细菌的抗生素敏感性实验，来确定该稀释剂中最适合添加的抗生素。对于接触精液和稀释液的重