白背三七多糖的提取纯化及含量测定

1、白背三七多糖的提取纯化及含量测定姜曼花邱细敏刘胜姿彭胜黎强【摘要】目确实定白背三七多糖的最正确提取方案，对其多糖进展别离纯化和含量测定。方法建立正交实验，对其提取方案进展优化；通过Sevage法脱蛋白、乙醇沉淀以及DEAE52柱层析进展别离纯化；蒽酮-硫酸法测定其总多糖含量。结果温度90，固料比1:9，提取时间2h；提取次数2次，所得多糖的含量最高。蒽酮-硫酸法测得粗多糖含量为1.49%；DEAE52柱层析别离纯化分别得到组分、组分、组分。结论水提白背三七多糖工艺简便，投资少，有利实现工业化大消费。【关键词】白背三七多糖蒽酮-硫酸法Abstrat：bjetiveTfixanptialextra

2、tiveethdandtakeseparatin，purifiatinandntentdeterinatinfplysaharideinGynuradivariata(L.)D.ethdsrthgnalexperientasintrduedtstudytheptiuextratinpressfGynuradivariata(L.)D.plysaharide(GDPS.TheplysaharideaspurifiedusingsevagedeprtEinandDEAE-52lunhratgraphy.Takententdeterinatiniththeethdfanthranne-sulphur

3、iaid.ResultsTheptialextratingnditinsere:extratingteperature90，theratifslidandliquid1:9；extratingtie2handextratingtie;thententperentagefrudeplysaharideas1.49%.GDPS、erebtainedthrughDEAE-52lunhratgraphy.nlusinItssiple,stlesstextratplysaharideithater-bilingethd.Keyrds：Gynuradivariata(L.)D.;Plysaharide;E

4、xtratinandpurifiatin;ntentdeterinatin白背三七Gynuradivariata(L.)D.为菊科三七草属植物，又名白(百)子菜，分布于台湾至华南、西南一带，喜生于潮湿的阴地上1，根、茎、叶均可入药，其根及根茎味甘，性凉，有清热、凉血、散淤消肿之成效，用于咳嗽痰喘、肺痈、崩漏、烫伤、跌打损伤、刀伤出血等症；而茎叶味咸，微辛，性凉，有消热，舒筋及止血，祛淤的作用，用于镇咳、风湿性关节痛、骨折、创伤出血、痈肿疮疥等症。在民间那么作为一种保健野菜，由于其能促进人体新陈代谢，增强体力，滋补强身，延年益寿而备受青睐。湖南岳阳地区众多糖尿病患者长期食用，有效控制了血糖升高，

5、因不知植物名而被患者称为“救命草。网上那么称其为“神奇的植物，也有称其为“明日叶或“明日草等。药理学研究说明，多糖(plysaharide)是构成生命的四大根本物质之一，多糖在增强免疫力2、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面发挥着生物活性作用。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。关于白背三七栽培技术文献报道较多3，化学活性成分仅见该植物吡咯啶生物碱4、黄酮类成分5，6及脂肪酸成分分析7，8的报道，尚未见其多糖的研究报道。本文报道白背三七多糖的提取纯化及含量测定。1器材1.1仪器UV-2501P紫外分光光度计，DEAE-52层析柱1.2药材与试剂无水乙醇、浓硫酸、蒽

6、酮、氯仿、正丁醇均为分析纯、葡萄糖标准品国药集团化学试剂、白背三七药材岳阳市场上购置。2方法2.1白背三七多糖的提取2.1.1提取温度确实定取已枯燥的药材15g，按药材：石油醚1:3进展脱脂，脱脂后的药材按1：7的比例，以水为溶剂，分别在不同的温度下提取2次，提取2h/次。2.1.2提取时间确实定取已枯燥的药材15g，按药材：石油醚1:3进展脱脂，脱脂后的药材按1：7的比例，以水为溶剂，90下，不同持续提取时间下提取2次。2.1.3料液比确实定取已枯燥的药材15g，按药材：石油醚1:3进展脱脂，脱脂后的药材90下，按不同的料液比提取2次，提取2h/次。2.1.4提取次数确实定取已枯燥的药材15

7、g，按药材：石油醚1:3进展脱脂，脱脂后的药材90下，提取2h/次，提取不同次数。2.1.5正交实验通过单因素实验确定最正确因素程度，为了消除各因素间的互相影响，根据这些确定的因素，确定正交因素的各个程度。根据各实验因素程度即提取时间、提取温度、固液比、提取次数4因素3个程度按表1进展正交设计提龋见表1。表1因素与程度略2.2脱蛋白本实验采用sevage法脱蛋白，粗多糖加适量水溶解，参加1/5体积的sevage试剂氯仿正丁醇=41，强烈振摇30in。静置分层，除去交界处变性蛋白，重复处理3次。在200400n处扫描未见蛋白质吸收峰。2.3粗多糖的别离纯化2.3.1粗多糖初步别离纯化搜集提取液，

8、于离心机3000r/in-1离心10in，取上清液。参加3倍量95%的乙醇，冰箱冷藏24h，次日于离心机3000r/in-1离心20in，取沉淀，用丙酮，乙醚各洗涤3次，冷冻枯燥，得灰白色粉末状的粗多糖。2.4粗多糖含量测定92.4.1蒽酮试剂的配制10称取1g蒽酮溶解于500l80%的硫酸中，置入棕色瓶中，暗处静置，临用临配。2.4.2波长选择称取105枯燥恒重的葡萄糖适量，加水溶解使成240.0g/L作对照品溶液。取对照品溶液0，0.5l置具塞试管内，分别加水1.0，0.5l，参加新颖配制的蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液)8.0l沸水浴加热10in，迅速置冰水浴冷却10in后，以首

9、管为空白，在500700n处扫描，确定最大吸收波长为626n。2.4.3标准曲线的绘制称取枯燥恒重的葡萄糖适量，加水溶解使成240.0g/L，精细量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8l置具塞试管内，加水至1.0l，分别编号为0，1，2，3，4，5，6再分别参加新颖配制的蒽酮试剂(0.2%蒽酮的80%硫酸溶液)8.0l沸水浴加热10in，迅速置冰水浴冷却10in后，以首管为空白，在626n处测定吸收度，以浓度对吸收度作工作曲线。2.4.4稳定性实验以标准系列4号管(即0.4l标样管)作稳定性考察，在626n处于0，30，60，90，120in测其吸光度。2.4.5加样回收实验精细称取多

10、糖含量的样品4份，加水稀释至100l，取0.1l，参加240g/L葡萄糖对照品溶液0.1l，加水溶解并定容至100l，取溶液适量，按“2.4.3项下方法操作，626n处测定吸收值，代入工作曲线方程，将所得结果换算成质量，计算出回收率。2.4.6总多糖含量测定精细称取多糖0.2022g，溶解配成100l溶液，取0.1l同“2.4.3项下方法处理，在626n波长处测定吸光度，代入曲线回归方程得总多糖的浓度。3结果3.1正交实验结果见表2。通过正交实验可知：提取最正确条件为A2B31D2，即提取温度90，固料比19，提取时间2h；提取次数2次时，提取效果最好。因素影响顺序分别为提取温度固液比提取次数

11、提取时间。表2正交实验结果略3.2多糖含量测定3.2.1标准曲线的绘制标准曲线有关数据见表3。表3标准曲线绘制略以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程A=0.0051+0.004r=0.9998，结果表3说明在24192g范围内葡萄糖含量与吸光度呈良好的线性关系.。白背三七样品吸光度为0.15703，将其代入回归方程得到=30.0(g/l)。多糖的含量()=DV1001.493.2.2稳定性实验结果由表4可知，吸光度测定在120in内相对标准误差为0.6%，说明多糖采用蒽酮-硫酸显色在120in内稳定。表4稳定性实验结果略表5加样回收实验结果略3.2.3加样回收实验结果由表5可知，本法回收

12、率为96.58%100.50%，平均回收率为98.90%，相对标准偏向RSD为2.0%。结果说明该方法的准确度较高。3.3多糖别离纯化结果将白背三七粗多糖以不同浓度Kl为洗脱溶剂过DEAE-52层析柱，洗脱曲线见图1。有3个洗脱峰。将此3个洗脱峰组分分别命名为组分、组分、组分。4讨论4.1提取条件实验采用单因素确定正交因素程度，建立正交实验方法，对白背三七多糖的提取条件进展了优化。由单因素实验和正交分析结果可知该多糖提取中，温度是主要影响因素，其次是固液比；提取时间和提取次数影响不显著。因此在提取时应注意控制提取温度和固液比，该工艺条件简单，稳定可行，多糖提取率高，稳定性好，可作为总多糖的提取工艺条件，为有效开发利用白背三七提供了方法学基矗图1DEAE-52洗脱曲线略4.2纯化工艺采用DEAE52柱层析纯化，分别用蒸馏水以及0.05，0.1，0.3，0.5的Kl进展了别离纯化，根据洗脱曲线，主要得到3个洗脱峰，由此可初步判断白背三七中至少含有三种多糖成分，其中以0.05Kl洗脱峰面积最大，推测此为该药材中含量最高的多糖局部。