lab-sop pcr xm006高危型人乳头瘤病毒核酸检测操作荧光探针法

1、高危型人瘤核酸检测标准操作规程（PCR荧光探针法）1.目的：规范高危型人瘤核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。2.应用范围：PCR。3.职责：3.1文件编写：技术员。3.2文件审核：主管。3.3文件：。3.4执行：PCR所有。4. 参考文献：4.1中山大学高危型人瘤（HR-HPV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书4.2中山大学DA7600核酸序列检测系统用户手册5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。5.2 实验原理：用两对特异性引物和两条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性

2、、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测常见高危型人瘤（16,18、31、33、45、52、56、58型）DNA。5.3 性能参数：5.3.1 检测下限： 5.0102拷贝/ml。5.3.2 线性范围：5.01025.0106拷贝/ml。5.4 标本：由合作按照以下要求进行。5.4.1 标本类型：泌尿生殖道物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。5.4.2 标本：5.4.2.1 泌尿生殖道物棉拭子：5.4.2.1.1物：用细小棉拭子约24厘米，捻动拭子物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（物前2小时禁小便）。5.4.2.1.2 女性生殖道物：用无菌生理盐水棉

3、球洗去宫颈外物，再用宫颈刷或无菌棉拭子宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子，宫颈物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌试管中，密封送检。5.4.2.1.3 女性物：用无菌生理盐水棉球洗净口，再用无菌棉拭子约2厘米，捻动拭子物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。5.4.2.2生殖道刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞，置入无菌试管中，密封送检。5.4.2.3组织活检标本（包括宫颈组织、组织、疣状组织等）：取可疑组织适量置于无菌试管中，密封送检。5.4.3标本保存：标本后保存于28。5.4.4运送条件：标本运送采用冰壶。5.4.5标本拒收标准： 污染5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA 7600荧光定量

4、PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4、-20）、移动/固定紫外灯。5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌：中山大学高危型人瘤（HR-HPV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒。5.5.2.2 试剂批准文号：国药准字 S20040035。5.5.2.3 试剂组成：DNA提取液 （500ul/管）2管，HR-HPV PCR反应液（400ul/管）2管，Taq酶（60ul/管）1管，HR-HPV强阳性质控品（200ul/管）1管，HR-HPV临界阳性质控品（200ul/管）1管，HR-HPV阳性定量参考品（1.0103拷贝/毫升），

5、（10ul/管）1管红色，HR-HPV阳性定量参考品（1.0104拷贝/毫升），（10ul/管）1管黄色，HR-HPV阳性定量参考品（1.0105拷贝/毫升），（10ul/管）1管蓝色，HR-HPV阳性定量参考品（1.0106拷贝/毫升），（10ul/管）1管绿色。5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20；有效期6个月。5.6 操作过程：5.6.1 标本与质控品的处理：5.6.1.1 打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100。5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、DNA浓缩液、质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。5.6.

6、2 DNA提取：5.6.2.1 质控品处理:分别取出HPV、临界阳性、强阳性质控品，8,000rpm离心数秒，各加入50ul DNA提取液充分混匀，100恒温处理101min。12,000rpm离心5min，备用。5.6.2.2 泌尿生殖道物棉拭子：5.6.2.2.1 向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子，5.6.2.2.2吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，12,000rpm离心5min，5.6.2.2.3去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100恒温处理101min。5.6.2.2.412,000rpm离心5min，备用。5.6.2.3 生殖道刮片：

7、5.6.2.3.1向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，5.6.2.3.2吸取全部液体转至1.5mlEP管中，12,000rpm离心5min，5.6.2.3.3其余步骤同泌尿生殖道物棉拭子处理的3、4步骤。5.6.2.4 组织活检标本：5.6.2.4.1 用适量灭菌生理盐水送检组织沾带的血液，5.6.2.4.2 取约50毫克组织置于干净器皿中，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min，备用。5.6.2.4.3 去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液，充分混匀，100恒温处理101min。5.6.2.4.4 12,000r

8、pm离心5min,4保存备用（如需长期保存请放置-20）5.6.3 排版：在DA7600荧光定量扩增仪的上机面板表里设置面板。5.6.4 加样： 从-20冰箱取出HR-HPV PCR反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接加入处理好的样本DNA和质控品、阳性质控品各5L，2,500rpm 离心1 min。5.6.5 DA7600的设置及结果分析：参见7600荧光定量PCR仪操作、校准及保养规程及扩增检测及结果分析规程。5.6.6实验数据。5.6.7 取出结束后扩增仪内扩增产物需用手套包好、后，丢入医疗废物桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。5.6.8 关闭扩增仪电源和计算机电源。

9、5.7 干扰和交叉反应：5.7.1 样本存在溶血可导致检测结果升高，需另取新的样品重新检测。5.7.2 某些药物可干扰检测，使检测结果降低，如，因此需避免用药期间采样检测。5.8 临床意义：直接反映内HR-HPV是否存在及活跃程度，可作HR-HPV的辅助诊断及其疗效监测的标准。5.9 安全防护措施：5.9.1 试剂处理：5.9.1.1 使用或更换试剂时，务必戴手套；不要用身体直接接触试剂，以免损伤皮肤。5.9.1.2 如果皮肤接触了试剂，立即用大量清水冲洗并。5.9.1.3 如果眼睛接触了试剂，立即用喷淋器冲洗，并紧急就医。5.9.2 仪器使用：5.9.2.1 仪器运转中不要触摸加样机构、试剂

10、分注机构、搅拌机构、反应容器机构等可动部分。5.9.2.2 仪器通电时不能打开仪器上面、背面、侧面的盖板，不能触摸光源灯的玻璃面。5.10.3 生物安全防护：参见生物安全防护手册。5.10 注意事项：5.10.1PCR荧光定量检测法比较容易受污染，所以实验过程中应避免反复开盖，所用耗材均需高压灭菌。5.10.2试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。5.10.3试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。6.相关表格:6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001PCR实验、交表6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001PCR迟发登记表6.3LA