分子生物实验课件：ACE基因的扩增及多态性分析

1、8/31/2022ACE基因的扩增及多态性分析实验目的： 掌握血管紧张素转换酶基因（ACE基因）提取方法、聚合酶链式反应的原理和操作方法,多态性分析。8/31/2022实验原理： 煮沸法提取瘦素受体基因:利用煮沸法裂解口腔脱落粘膜使得细胞破碎，DNA片段释放，基因组DNA溶解于上清中，可取做PCR反应模板。 血管紧张素转换酶基因（ACE基因）多态性分析8/31/20228/31/2022PCR原理: 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR

2、技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。8/31/2022模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后,使之成为单链，以便它与引物结合；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至25-65左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。模板

3、DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸图6-1 PCR原理示意图PCR产物生成曲线扩增产物循环次数指数扩增期扩增平台期8/31/2022ACE：上游 5-CTGGAGACCACTC2 CCATCCTTTCT-3, 下游 5-GATGTGGCCATCACATTGGTCAGAT-38/31/2022ACE血管紧张素转换酶(ACE)基因是一种与高血压、肾脏疾病、耐氧能力等有关的一个基因。ACE基因的基因型鉴定，存在I/D (插入/缺失)多态性,从而导致出现3种基因型：插入型纯合子片段,即仅有490 bp区带者为型;缺失型纯合子片段,即仅有190 bp区带者为DD型；杂合子片段为

4、既有190 bp区带又有490 bp区带者为ID型。因此,电泳结果中可见到DD、ID及型共3种基因型。主要功能有以下两个： 催化血管紧张素I转化为血管紧张素II； 使缓激肽失活。 血管紧张素转化酶因为这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。此外，ACE也能催化血管紧张素（1-9）转化为血管紧张素（1-7）。8/31/2022一、基因组DNA提取：吸取200lddH2O至EP管中，用棉签刮拭口腔粘膜3-4次，将其放入ddH2O中反复挤压搅动，使细胞脱落；12000rpm 3min，弃上清；加入100l TE溶液，悬浮细胞； 56 30 min; 100煮10min; 12000rpm 3min，取上清作为PCR反应的模板; 4保存或冻存剩余DNA。实验步骤：8/31/2022二、PCR扩增：30ulPCR体系：10缓冲液: 2.0uldNTP: 1.0ul引物： 各1.0ul模板： 10ulEx taq: 1U加ddH2O至30ulPCR扩增条件：94 3min94 40s58 40s72 40s72 10min35个循环 注意事项1、 重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。