神经干细胞研究进展

1、神经干细胞研究进展第1页 汇报内容提要国内外研究现实状况骨髓源神经干细胞横向分化骨髓源神经干细胞致瘤性研究骨髓源神经干细胞活体示踪第2页一、国内外研究现实状况第3页神经干细胞概念 神经干细胞是指起源于神经组织及神经组织发源地、终生保持自我更新能力，并能分化为各种神经组织细胞一类细胞称为神经干细胞。第4页神经干细胞研究概述 1989，Tamir等由造血干细胞引申出神经干细胞概念 Reynolds BA（1992 Science）正式提出神经干细胞概念 90年代以后，国内外兴起了神经干细胞研究热潮第5页神经干细胞起源 胚胎源性神经干细胞 （早期胚胎 胚胎神经组织） 成体源性神经干细胞 神经组织 非

2、神经组织（骨髓、脂肪、皮肤等）第6页神经干细胞种子细胞起源妊娠3个月1.胚胎终止妊娠，取胎脑分离获取神经干细胞孵化培养移植存在问题伦理免疫排斥细胞数量少第7页2.克隆卵细胞卵细胞吸除核+精细胞DNA电或化学刺激形成胚胎妊娠3个月终止妊娠取胎脑获取干细胞移植存在问题存在问题伦理问题基因缺失 或突变第8页3.本身成体干细胞骨髓（室管膜、脂肪）诱导分化传代增殖神经干细胞移 植 优 点骨髓起源丰富、获 取轻易不存在伦理问题不存在免疫排斥问题 困 难 定向诱导分化难度大第9页4.髓鞘移植获取胚胎嗅鞘细胞培养传代增殖髓鞘细胞 移 植存在问题仅适用脱髓鞘疾病伦理问题免疫排斥细胞数量少第10页二、骨髓源神经干

3、细胞横向分化第11页雌性SD大鼠 阴道脱落细胞涂片 排卵期合笼三种试验材料 0.5天胚鼠（精子+）10.5-14.5日胚鼠（作对照）大鼠、猫、家犬骨髓雄性大鼠 骨髓穿刺 恒河猴 / 成人骨髓（1）（2）（3）第12页主要移植过程动物神经干细胞BrdU或GPF标识）动物/人神经干细胞离心，细胞悬浮于 0.85% 生理盐水中经立体定向或静脉或脑室注射，移植到模型动物或病员体内观察动物切片人PET等第13页aba 原代培养24h。 Nestin 阳性细胞克隆形成（箭头） b 传代培养48h。细胞再次形成克隆（箭头）第14页aba 形成神经干细胞克隆球b 有神经元/神经胶质细胞样长突起细胞分化第15页

4、图1. 在苏木素预染背景下由神经球传代培养后Nestin阳性细胞（）。而已分化细胞则呈Nestin阳性（）(400X) 图2. 在有血清条件下传代培养3周NSE阳性细胞 (400X) 图3. 在有血清条件下传代培养3周GFAP阳性细胞 (400X) 图4. 在无血清传代培养中Nestin阳性神经球(400X)第16页NESTIN免疫磁珠法分离大鼠神经干细胞（箭头）第17页丫啶橙荧光染色判定大鼠神经干细胞及分化细胞活力情况（a,b）.NESTIN免疫磁珠标识大鼠神经干细胞（c）。abc第18页NSCs提纯后流式细胞仪检测结果。a 同型对照；b 阳性Result of flow cytometry

5、 at post-purification . a Immunomagnetic beads-free; b With immunomagnetic beads第19页 大鼠NSCs提纯后检测神经干细胞BF-1(脑因子) 、部分分化早期细胞 GABA（氨基丁酸）和TH（酪氨酸羟化酶）总RNA表示 7 6 5 M 4 3 2 1880 bp 600 bp 460 bp 350 bp100 bpTHGABABF-1第20页 大鼠NSCs提纯后RT-PCR法判定神经干细胞不一样蛋白表示。 1:BF-1 ；2:TH ；3:GABA ； M：分子量标识； Control:PBS对照 7 6 5 M 4

6、3 2 1M 1 2 Control100 bp350 bp460 bp520bp600 bp880 bp3第21页abcd大鼠骨髓基质细胞。0h（a）；13h（b）；39.5h（c）. 培养70h（d），将细胞球分离成单细胞再种植于滋养细胞层（空箭头），有经典神经元样长突起细胞形成（黑箭头）。 第22页 大鼠骨髓基质细胞。 a 细胞增殖情况 (48h, 100) b 细胞分化情况（17d, 200） c 分化细胞形态（24d, 400）abc第23页猫骨髓基质细胞。9天（a，400）；18天（b， 400 ）; 1周（c ， 400 ）；4周(d ， 100 )源于骨髓神经干细胞发育成大圆细

7、胞，并可见处处于分裂中及分化后细胞。 abcd第24页 家犬骨髓源性神经干细胞分化而来经典神经元样细胞。（ 400 ） 第25页家犬骨髓源性神经干细胞。扩增72h，克隆形成（ 200）第26页恒河猴捕捉、麻醉、骨髓获取。第27页恒河猴骨髓源性NSCs。 a 纯化后MSCs光镜下 形态（1d, 200 ）b 增殖后形成岛屿状细胞团（7d, 200）c 分化后细胞光镜下形态（24d，100） abc第28页abcd恒河猴骨髓源性神经干细胞分化为经典神经元样细胞第29页恒河猴骨髓源性NSCs。 a Nestin染色 （10天，DAB显色，200） b 分化后表示NSE抗原阳性细胞 （ 20天， DA

8、B显色，200） c 分化后表示GFAP抗原阳性细胞 （ 18天，DAB 显色，200） abc第30页 a 手术切口 b MPTP迟缓注入颈内动脉 a b 第31页 模型制作后w, PET（放射显影剂为1- 18F 氟代- 2-脱氧葡萄糖, 2-18FFDG）检验结果.上图为轴位，下列图为冠状位，每图左侧为模型侧，右侧为对照侧，可见模型侧基底节区放射性浓聚显著少于对照侧 第32页模型动物代谢改变（PET检验）PET检验模型动物代谢改变（a,b 冠状切；c,d 水平切）第33页a 造模后10w, 对模型动物进行灌注 bcd：恒河猴大脑 e：恒河猴脑干abcde第34页 再固定后冰冻切片第35页

9、 双侧黑质中线两侧DAB染色对比. 左图为正常侧，右图为模型侧（造模后10w, 40)第36页对照侧 模型侧中脑切片DAB染色显示双侧红核（造模后10w, 40）第37页a 恒河猴中脑切片对照侧黑质TH染色, 改良SABC法 （造模后10w, 200,）b 恒河猴PD模型侧TH染色，改良SABC法 （造模后10w, 200）a b 第38页 T7 P CMV CMV BGH PA ITR Ampr polyA CoiE1 SV40 ITR SV40AP Neomycin SP6 EcoR I EcoR I CMV ITR polyA Ampr ITRConstruction of pWAV2-

10、TH pcDNA3 -THpWAV2Kpn IEcoR ISma ISal IBgl IIHind IIIKpn IBamH IBstX ITH EcoR IEcoR VBstX INot IXho IXba IApa If1oripWAV2 -THKpn ITH EcoR ISma ISal IBgl II AmprTH基因载体构建第39页BHK-thBHK-thBHKBHKAnti-TH（No TH-gene）Anti-TH (With TH-gene)Control（No TH-gene）Control(With TH-gene) 转TH基因免疫细胞化学检测（为NSC转基因移植治疗奠定基

11、础）第40页体外Brdu标识阳性恒河猴骨髓源性神经干细胞(10d, 200)第41页源于人骨髓基质细胞神经干细胞，移植前以rAAV-GFP 标识细胞状态a b c d e f 第42页第43页假伤组1424h脑片(未见BrdU+细胞, 400) 模型常规治疗组1424h 脑片(偶见BrdU+细胞, 400)关于移植后NSC 出现时间初步探索（家犬）第44页干细胞经脑室治疗组：伤后第1424h伤区BrdU+细胞， 400干细胞经血管内治疗组：伤后第1424h中脑伤区BrdU+细胞, 400 家犬骨髓源性神经干细胞经BrdU+标识后移植至损伤脑内（400 ） 关于NSC移植路径初步探索（家犬） 第

12、45页人骨髓源性神经干细胞。陈某，男，38岁. 神经干细胞克隆球形成，并有长突起细胞分化。a: 0h b: 7d c:10d d:12dabcd第46页人骨髓源性神经干细胞增殖分裂情况（）第47页人骨髓源性神经干细胞增殖分裂情况（）第48页abcd人骨髓源性神经干细胞。李某，男，45岁.由源于骨髓基质细胞神经干细胞球分化出神经元样长突起细胞。 14d （a、b），17d（c、d）.第49页ab人骨髓源性神经干细胞。何某，女性，22岁. 源于骨髓基质细胞神经干细胞克隆球及其分化神经元样长突起细胞。原代培养12d（a ） ， 18d（b ）。 第50页人骨髓源性神经干细胞。张某，女，42岁d. 骨

13、髓基质细胞 原代培养 8 天（a,b），细胞发育更大、更圆，颗粒显著。培养 10天d (c,d)，含有长突起神经元样细胞分化形成，突起间有连接。abcd第51页abc人骨髓源性神经干细胞。朱某，男，27岁。分化前干细胞阶段（a, 12天）及分化后形成经典神经元样长突起细胞(b，20-30天 )。第52页ab源于人骨髓神经干细胞长突起细胞免疫细胞化学方法判定。 a NSE阳性. 双极神经元.b GFAP-阳性，神经胶质细胞。.第53页氨基酸标准品混合液4.183: 天冬氨酸；7.947: 谷氨酸；11.661:甘氨酸 RA因子培养10天纯骨髓源性神经干细胞 天冬氨酸第54页氨基酸标准品混合液4.

14、183: 天冬氨酸；7.947: 谷氨酸；11.661:甘氨酸 Lif因子培养10天纯骨髓源性神经干细胞 谷氨酸第55页纯培养基空白对照肝脏细胞阴性对照第56页 源于人骨髓基质细胞神经干细胞，移植前状态。abcd20%30%40%10%第57页骨髓源性神经干细胞移植手术中。(神经干细胞准备)第58页手术显微镜检测下进行神经干细胞移植。第59页伤后个月运动性失语神经干细胞移植术术前术后（6个月）第60页术前术后（4个月）C3-6损伤3个月病员，神经干细胞移植术第61页三、骨髓源神经干细胞致瘤性研究第62页U251细胞豆球蛋白A（ConA）凝集试验（ConA:100g/ml），显示U251肿瘤细胞

15、有显著凝集反应，细胞表面结构发生改变。光镜100骨髓源性NSC豆球蛋白A（ConA）凝集试验（ConA:100g/ml），显示骨髓源性NSC无显著凝集反应。光镜200神经干细胞致瘤性研究第63页体外培养10天骨髓源性NSC染色体带核型分析，显示为正常核型（46，XY），未见染色体数目异常和畸变。表明经体外培养骨髓源性NSC保持了正常遗传学特征。 第64页U251细胞在软琼脂中培养18天，可见显著细胞克隆形成，表明其不含有停泊依赖性，展现恶性细胞表现。光镜200体外培养骨髓源性NSCs在软琼脂中培养18天，未见细胞克隆形成，表明其含有停泊依赖性，为正常细胞特征。光镜400 第65页U251细胞接

16、种裸鼠两个月，于接种部位可见显著肿瘤组织形成骨髓源性NSCs接种裸鼠四个月后，接种部位未见有异常组织形成，表明体外培养骨髓源性NSCs不含有体内成瘤性。 第66页四、骨髓源神经干细胞活体示踪第67页图1 光镜下显示菲立磁（Feridex）标识后大鼠骨髓源性神经干细胞（培养1周）经典Prussian Blue染色（可见细胞浆内许多细小蓝色铁颗粒）图2 光镜下显示Feridex标识后大鼠骨髓源性神经干细胞分化为神经元样细胞（）后Prussian Blue染色（培养1月） 神经干细胞标识示踪第68页激光共聚焦显微镜图片显示Feridex标识大鼠骨髓源性神经干细胞（培养1周）图A Feridex单重标识骨髓源性神经干细胞（Dragon Green显示）图B Nestin阳性骨髓源性神经干细胞（Tex