ERP-9131总大肠杆菌(多管发酵技术)

1、方法 91 31总大肠杆菌(多管发酵技术)适用范围l本方法用于测定地下水和地表水中存在的大肠杆菌类细菌。|按本方法分析的大肠杆菌类细菌，其定义为：全部能于35在 48h 之内使乳糖发酵，并产生气体的需氧的和兼性厌氧的、革兰氏染色阴性的、不形成孢子的杆状细菌。方法摘要多管发酵技术是一种分三步进展的试验方法。结果经统计处理以最可能数(MPN)表示。下面摘要介绍这三个步骤：假定试验、确信试验和完成试验(为了使分析结果准确，需要进展五管试验)。假定试验：用累进量的待测水样接种到一系列月桂酰胰蛋白液态培育基初步 发酵试管。将接种后的试管于 350.5培育 242h，检查试管内有无气体生成。连续培育无气体

2、生成的试管。并在 483h 完毕时再行检查。在 483h 内只要有气体生成，不管其量多少均为阳性假定试验。I确信试验：在 24 和 48h 内显示有气体生成的全部初步发酵试管均应进展确信试验。用在假定试验中显示阳性结果的试管中的培育基，接种到含有亮绿乳糖胆汁液态培育基的发酵试管，气体生成后应尽快进展接种。将接种后的试管于 350.5培育 483h。在这段时间内的任何时刻有气体生成即说明为阳性确信试验。完成试验：在确信试验中显示阳性结果的全部水样均应进展完成试验。对分 析过的全部样品的 20进展完成试验，还可作为一种质量把握手段。在一个或数个伊红 亚甲蓝平皿琼脂上用待分析的样品画线。将画线后的平

3、皿于350.5培育 242h。培育以后，将一个或数个典型菌落(即有菌落核心、具有或没有金属光泽)转移到月桂酰胰蛋白液态培育基发酵试管和养分琼脂斜面上。将发酵试管和琼脂斜面放于 350.5培育 24 土 2h； 如无气体产生则连续培育至 483h。对于有气体生成的发酵试管，取其相应的琼脂斜面做革兰氏染色，并用显微镜进展观看。假设在发酵试管内生成气体，并且在琼脂培育基上消灭 革兰氏阴性、不形成孢子的杆状细菌，则可认为完成试验令人满足，同时确认被分析的样品 中存在大肠杆菌类细菌。关于本方法的具体内容，请见“水和废水标准检验法”和“环境监测的微生物学方法”。3.O 干扰细菌在水中的分布是无规律的。因此

4、，为了获得足够的统计准确度，本方法要求进展五管试验。存在余氯或其它卤索可阻碍细菌作用的持续。为防止消灭这种问题，应在无菌样品容器中入硫代硫酸钠。水样中含有高浓度铜、锌或其它重金属可使细菌中毒。只有在疑心水样中存在重金属时才应参加螯合剂，例如乙二胺四醋酸(EDTA)。必需牢记，最可能数表为概率计算结果，因而其周密度必定较差。最可能数表包含 23的正系统误差，通常会导致数值偏高。增加所分析的同一采样点的样品数日，增加所检验的分取样品的数目，都能提高最可能数的周密度。4.O 仪器和设备培育箱。培育箱内全部位置的温度在任何时间都必需保持均匀和稳定，即使用区域内的温差不得大于0.5。为了到达这种恒温准确

5、度，应使用带恒温水套的或无水型培育箱，培育箱配备绝缘良好的恒温把握低温电热装置，电热装置安装在恒温室四壁后面夹层中或底板下面，也可安装在其四周；最好配备机械装置用以循环空气。假设使用干热式培育箱，湿度必需保持在 7580。另外，也可使用保温良好，加热装置分布适当并配备强制空气循环装置的专用培育室，但其温差和相对湿度必需符合要求。使用这种培育室时，每天应记录培育平皿或试管处的温度范围。培育箱配备放开露式金属丝架或板架，其问隔应能保证整个室内温度匀一。平皿架或试管筐与四壁应保持 2.5cm 问距。培育箱内每一个正在使用的架子上，应放置一支准确的温度计，其球部浸入液体(甘油、水或矿物油)；记录每天的

6、温度数(最好是在早晨和下午读数)。另外，在培育箱内位于中间的一个架子上，最好放置一支带最高和最低温度记录的温度计，以便记录 24h 内的温度总范围。培育箱满载时，应定时测定箱内的温度变化。只要有可能， 就应安装一支自记温度计，以便保存一份连续的、永久的温度记录。水银温度计的刻度应为 0.5，每年应比照国家标准局(NBS)检定合格的温度计校准一次。刻度盘温度计应每季度校准一次。水浴中的水应保持足够深，能没过试管内的培育基液面。干热灭菌箱。应使用尺寸足够大的干热灭菌箱，以防内部拥挤。灭菌箱的构造应能保证灭菌温度均匀并足够高(17010)，应配备适用的温度计或温度记录仪表。高压灭菌器。应使用尺寸足够

7、大的高压灭菌器，以防内部拥挤。灭菌器的构造应能保证灭菌室内温度均匀(直至并包括灭菌温度 121)；应配备准确的温度计，其球部应正确地放置在排气管上，以便记录灭菌室内的最低温度(也可使用温度记录仪表)；应配备压力表和恰当地调整好的安全阀，直接与饱和蒸汽动力管线或与适用的特制蒸汽发生器相接(不要使用用胺处理过的锅炉供给的蒸汽，以防腐蚀)；灭菌器应能在 30min 内到达所需温度。 I由于调整和保持灭菌温度的困难和潜在的危急，建议不使用立式高压灭菌器或高压锅。假设由于状况紧急或特别而使用高压锅，则必需配备适用的压力表和温度计，其球部应位于水面上 2.5cm。茵落计数器。使用魁北克(Quebec)式菌

8、落计数器，最好为暗视野型；也可使用其它计数器，但要能供给相等的放大倍数(1.5 倍)和令人满足的可见度。pH 计准确度不低于 0.1pH 单位。天平。使用负载为 150g 时感量不低于 0.1g 的天平。称取少量(少于 2g)时， 使用负载为 10g 时感量为lmg 的分析天平。最好使用单盘快称天平。培育基制备器皿。使用硼硅玻璃或其它抗腐蚀材料如不锈钢器皿。使用的玻璃器皿应清洁，无残渣、干琼脂或其它会污染培育基的外来物质。吸管和刻度量筒。使用尺寸适宜，能够准确、快速移取所需液量的吸管。同一批产品的核准误差不得大于 2.5。使用符合国家标准的刻度量筒。吸管容器。使用端面尺寸 57.5cm 的圆筒

9、形或长约 40cm 的矩形铝盒或不锈钢盒，或用优质硫酸盐纸浆纸(牛皮纸)。不得用铜或铜合金罐或盒盛放吸管。稀释瓶或试管。使用耐热玻璃，最好是硼硅酸盐玻璃瓶或试管，其密封玻璃塞或螺帽应配备在灭菌当中不会产生有毒或抑菌化合物的衬垫。不要用棉塞作塞子。在稀释瓶或管壁上画上擦不掉的记号。可以用尺寸适当的无毒塑料瓶代替玻璃瓶，但要保证这种瓶在灭菌时不会发生问题。培替氏(Petri)培育皿。使用尺寸约为 10015mm 的玻璃或塑料培氏培育皿。培育皿底部应平坦，无气泡，无划痕，以便保证整个皿内培育基的厚度全都。承受滤膜技术时，使用松盖玻璃或塑料平皿(6015mm)或紧盖平皿(5012mm)。灭菌培替氏平皿

10、 并贮存在金属罐(铝或不锈钢罐，不能用铜罐)中，也可在灭菌以前先用纸，最好是优质硫酸盐纸(牛皮纸)包封。发酸管和小管瓶。只能使用 1075mm 的发酵管。测试产生的气体时，发酵管内应倒置放人一支小管瓶，其尺寸应适宜，确保能布满培育基，并至少能局部地浸入发酵管。接种装。使用由 22 号或 24 号镍合金(铬镍、镍铬或与之相当的合金)或铂铱合金制作金属丝接种环，便于火焰灭菌。也可以使用一次性铝制或不锈钢制移菌环。接种环的直径至少应为 3mm。用干热法或蒸汽灭菌。也可以使用一次性硬木制点样器，其直径应为 0.20.3cm，至少比发酵管长 2.5cm，经干热灭茵后贮存在玻璃或其它无毒容器内。试剂 IA

11、STM型水ASTM D1193。应测定水中的杂志。l缓冲水。贮备磷酸盐缓冲液的制备：溶解 34.0g 磷酸二氢钾(KH P0 )于 500ml24型水中,用 1N 氢氧化钠溶液(NaOH)调至 pH7.20.5,再用型水稀释至l L。将1.25ml 贮备磷酸盐缓冲液和5.0ml 氯化镁溶液(38g MgCl L型水或81.1g2MgCl 6H 0LII 型水)参加 1LII 型水。分成数份，使每份的体积在高压灭菌 15min 后为22992.0 或 90.2m1。胨水：制备 10胨在型水中的溶液。稀释肯定体积的胨水溶液，使最终的溶液为 0.1。最终的pH 应为 6.8。将胨水分成数份，使每份的

12、体积在高压灭菌15min 后为 992.0 或 90.2m1。不要让细菌于室温下在任何一种稀释水中悬浮30min 以上，否则有些菌种会死亡，有些菌种会增殖。月桂酰胰蛋白液态培育基。液态培育基的成分为：胰蛋白：20.Og；乳糖：5.Og；磷酸氢二钾(K HP0 )：2.75g；24磷酸二氢钾(KH P0 )：2.75g；氯化钠：5.0g；月桂酰硫酸钠：O.1g；型水 1L。也可买到24包装好的干粉状月桂酰胰蛋白液态培育基。要使月桂酰胰蛋白液态培育基的浓度在参加lOOml 或 lOml 份量的水样到培育基内时。各养分成分的浓度不至降低到低于标准培育基的浓度。按表 5-8 配制这种培育莱。表 5-8

13、 月桂酰胰蛋白液态培育基的配制接种水样ml试管内培育基的量ml培育基+接种的总体积ml所需脱水的月桂酰胰 蛋白液态培育基的浓度g/L110 或稍多11 或稍多35.610102071.210203053.410050150106.810035135137.110020120213.6将液态培育基分装到放置有倒置小管瓶的发酵试管中，培育基的量要足够多，使得灭菌后能至少局部漂浮倒置的小管瓶。于 121灭菌 1215min。灭菌后pH 应 6.80.2。亮绿乳糖胆汁液态培育基。液态培育基的成分为：胨 10.Og；乳糖：l0.Og；牛胆：20.Og；亮绿：0.0133g； 型水：1L。也可买到包装好的

14、干粉状液态培育基。将液态培育基分装到放置有倒置小管瓶的发酵试管中。培育基的量要足够多，使得灭菌后能至少局部漂浮倒置的小管瓶。于121灭菌 1215min。灭菌后pH 应为 7.20.2。草酸铵-结晶紫赫克氏所用的。溶解 2g 结晶紫燃料含量 90%于 20ml95%的乙醇中；溶解 0.8gNH C O H O 于 80ml型水中；将两种溶液混合，使用前放42 2 42置 24h，然后通过滤纸滤入染色剂瓶中。鲁格氏Lugol)溶液。经革兰氏改性。将 1g 结晶碘和 2gKI 置于钵中研磨。每次加几毫升型水，每次加水后彻底研磨，直到完全成为溶液为止。用剩余的水前后总共用 300ml将溶液洗入棕色玻

15、璃瓶内。复染剂。溶解 2.5 克藏红染料于 100ml95%的乙醇与丙酮混合。丙酮酒精。将等体积的 95%乙醇与丙酮混合。革兰染色剂包。可以使用市售革兰染色剂包代替第 5.5、5.6、5.7 和 5.8节中的试剂。样品的采集、保存和处理全部水样都必需依据采样打算其中包括美国环境保护局 1978 年议定的留意事项采集。用适宜的洗涤剂和热水彻底清洗全部玻璃器皿，然后用热水冲洗以除去残留的痕量洗涤剂，最终用型水冲洗。假设使用机械式玻璃器皿洗涤机，其进水管件应为不锈铜或其它无毒材料的。不得使用铜管安排型水。冲洗水系统要承受不锈铜或其它无毒材料。将玻璃器皿不包括盛放在金属容器内的器皿于 170灭菌至少

16、60min； 假设依据自记温度计灭菌室内温度是均匀的，可以于 160灭菌。盛放在金属容器内的玻璃器皿应于 170灭菌至少 2h。按上述方法对非塑料制水瓶灭菌，也可于 121蒸压灭菌 15min。每批取一瓶做无菌性检验。假设预备采集含有余氯和其它卤素的水样，清洁的样品瓶在灭菌前应参加足量的 Na S 0 ，使样品中的浓度约为 100mgL。一个 120ml 的瓶子，要加 0.1ml 102 2 3的 Na S 0 溶液(这样就能中和余氯浓度约为 15mgL 的样品)。塞上瓶塞，加盖，按2 2 3前述方法用干热或湿热灭菌。采集含有高浓度铜或锌的水样，或含有高浓度重金属的废水时，水样瓶内内应先放人能

17、削减金属毒性的螯合剂。当这类样品要转运 4h 以上时。这一点尤其重要。用 372mgL 的乙二胺四醋酸四钠盐(EDTA)作螯合剂，使用前将 EDTA 溶液调至pH6.5。可将 EDTA 分别参加水样瓶内(向 120ml 的瓶口参加 0.3ml 15的溶液)，然后灭菌；也可先与 Na S 0 溶液混合，然后参加瓶中。12 2 3采集水样时，要在瓶内留有足够的空间至少 2.5cm 高，以备检验前振荡混合。留神采集水样，使之能够代表预备检验脉墙要防止的水，还要防止采样时或检验前的一段时间内水样受到污染。水样瓶在采样前始终要密封。瓶塞和罩盖或螺帽要做为一体取下，留神避开弄脏。采水时不要握着瓶塞、盖帽和

18、瓶颈，要保护这些局部不受污染。握住瓶子靠底部的部位，让水灌入。，不要用水冲洗。马上塞好瓶塞或盖好瓶盖，沿瓶颈将罩盖栓紧。步骤假定试验。用适当的累进量(1ml 的倍数或约数)水样接种到一系列发酵试管(“初步”发酵试管)。留意确保培育基和参加的样品混合物中养分成分的浓度符合第 5.3 节提出的要求。用无菌吸管从开头的水样瓶以及其次连续的各稀释瓶依次做转移。假设吸管在完成转移之前受到污染，则应换用另一支无菌吸管。从每一个不同的稀释水样做转移时， 要使用一支不同的无菌吸管。不要在阳光直射下做稀释。从吸管筒中取出无菌吸管时要留神操作；为了避开污染，勿使吸管尖在被拉出来时遇到露在筒外的其它吸管的头，也勿使

19、吸管尖触碰稀释瓶的瓶嘴和瓶颈。吸取水样时，吸管尖插入水样或稀释样液面下不要超过 2.5cm。当放出肯定量的水样时，握住吸管使管尖成45角接触试管颈内侧。接种于月桂酰胰蛋白液态培育基发酵试管的水样，其份量和接种数目因被检验水体的特性而有所不同，不过一般是使用Iml 的十进倍数或约数来稀释水样。参加水样后，振动试管架充分混合。不要让试管翻倒。发酵试管经接种后于 350.5培育。242h 后，轻轻摇荡每支试管.，并做检查，假设没有气体生成并被截留在倒置的小管瓶内，则应连续培育，在第 483h 再行检查。记录每支试管内有无气体生成，气体量则可不管。假设在 483h 之内，在内部的发酵试管或小管瓶内生成

20、了任何量的气体，便可断定为阳性假定试验。试管清楚而里面有空气泡时，不行与真正生成的气体混淆。气体假设是由发酵产生的，液态培育基会变混浊。假设轻轻振荡发酵试管，有小气泡不断消灭在小管瓶外部的整个培育基中，这就表示发酵活泼。在 483h 的培育完毕时仍无气泡生成，则说明试验结果为阴性。观看 48h 的人为限制，自然没有考虑到那些产生气体格外缓慢，一般对环境卫生影响有限而又不常见的大肠杆菌类细菌。确信试验。但凡在 24h 培育期内显示有任何量气体产生的初步发酵度管，均应做确信试验。假设不到 24h 初步发酵度管内就已显示出活泼的发酵，则应准时转移到确信试验的培育基中，不必等到24h 完毕时再转移。假

21、设在48h 培育期完毕时，又有初步发酵试管显示有气体产生，这些试管亦应做确信试验。把显示有气体产生的初步发酵试管轻轻振荡或转动，然后：(a)取一支环径为 3mm 的无菌金属接种环，转移一个全环的培育到含有亮绿乳糖胆汁液态培育基的发酵试管中；或者(b)，将一支无菌木涂棒插入初步培育中至少 2.5cm 深，马上取出，再将其插入盛有亮绿乳糖胆汁液态培育基的发酵试管底部，取出后弃去。将接种后的亮绿乳糖胆汁液态培育基试管于 350.5培育 483h。在这段时间内任何时刻，假设在亮绿乳糖胆汁液态培育基发酵试管的倒置小管瓶内有气体产生，不管气体量多寡，均可断定为阳性确信试验。完成试验.取确信试验呈阳性的试管

22、，做完成试验，以明确证明大肠杆菌类细菌的存在， 并对全部被分析样品的 20供给质量把握数据。每一支产生了气体的亮绿乳糖胆汁液态培育基试管，在消灭气体后要尽快转移画线到一个或数个依红亚甲蓝平皿内。在平皿琼脂上画线时要确保分别长出的一些菌落，至少褶隔 0.5cm。画线时要遵循下述留意事项，以求在确实存在大肠杆菌时能获得高数量成功的分别菌落：(a)使用尖端稍弯曲的接种针；(b)先轻击发酵试管并使之倾斜，以避开接种针上取到任何膜状物或浮渣；(c)针尖要插入试管液体内大约 5.0mm 深；(d) 在平皿上画线时，要用针尖的弯曲局部接触琼脂，避开刮伤或戳破培育基外表。7.3.3 倒置培育皿，于 350.5

23、12 培育 242h。在依红亚甲蓝琼脂培育基上生长出来的菌落，分别有典型的(即有菌落核心， 具有或没有金属光泽)、非典型的(即不透亮，无菌落核心、粘状、培育 24h 后呈粉红色) 和阴性的(全部其它的)。从每个平皿上挑取 1 个或数个典型的、分别完全的大肠杆菌菌落；假设不存在典型菌落，就挑取 2 个或多个被认为最可能含有大肠杆菌类细菌的其它菌落，分别转移到月桂酰胰蛋白液态培育基发酵试管和养分琼脂斜面上。注：在转移茵落时，应尽可能选取分别完全的菌落。并用经过火焰灭菌和空气冷却过的转移针略微触碰菌落外表。这样可以尽量削减转移混合细菌的可能性.。将其次次使用的液态培育基(即月桂酰胰蛋白液态培育基一译

24、注)试管于350.512 培育 242h；假设在这段时问内没有产生气体，则连续培育，在第 483h 再次检查。对于显示有气体产生的液态培育基试管，取其相应的24h 琼脂斜面培育，做革兰氏染色(见第 7.4 节)，在显微镜底下观看。在其次次的月桂酰胰蛋白液态培育基试管中在483h 内产生气体，并且在琼脂培育基上被证明为革兰氏阴性、不形成孢子的杆状细菌，则可以认为完成试验令人满足，并确认了存在着大肠杆菌类细菌。革兰氏染色步骤。在玻璃载片上滴 1 滴型水，从琼脂斜面上取 1 点细菌培育，在水滴上调成淡的乳液。在空气中晾干或者将载玻片穿过火焰使之固定，然后用草酸铵一结晶紫溶液染色 1min。再用自来水

25、冲洗载玻片；继而用鲁哥溶液处理1 min。(有关试剂见第 5.55.8 节)。把染色后的载玻片放在自来水下冲洗，然后将载玻片夹在手指中问，让丙酮酒精顺着载玻片流下，直到不再有染色被洗掉为止。这样脱色处理约1530 s，不要脱色过度。接着用藏红复染15 s，然后用自来水冲洗，用吸水纸吸干，最终在显微镜底下观看。被脱了色的，而且能承受藏红染色的细胞呈粉红色，被规定为具有革兰氏阴性反响。没被脱色、仍保持结晶紫染色的细胞呈深蓝色，被规定为革兰氏阳性。MPN 的计算和记录。依据每一种稀释度确实信试验或完成试验中的阳性试管数目，可以由MPN 表获得样品中大肠杆菌类细菌的计算密度。表 5-9 示出了饮用水检

26、验的MPN 指数和 95的置信限，表 5-10 示出了一般应用时的MPN 指数和 95的置信限。为了确定MPN 指数，需要稀释 3 个。例如(参见表 510)，假设用 5 个 10ml； 5 个 1.0ml 和 5 个 0.1ml 份量的水样作接种物，其中有 4 个 10ml；2 个 Iml 和 0 个 0.Iml 份量的接种水样给出阳性结果，则编码结果为 4-2-0，MPN 指数为 22100m1。表 5-9 使用 5 个 lOml 的份量做检验时.各种阳性 和阴性结果的组合所应有的MPN 指数和 95的置信限每支试管参加 10ml 水样，从 5MPN 指数/100ml95%置信限支试管所得

27、的阳性反响试管数下限上限0168.0无限假设一系列 10 进制稀释不是 1O、1 和 0.1ml，或者假设此系列中承受的样品体积超过 3 个。则应遵循本章参考文献中规定的细菌密度测定步骤。报告水样的MPN 数值时，一律以 100ml 水样为根底。质量把握在环境监测的微生物学方法一书(美国环境保护局，1978，)中的第局部， 对质量把握程序做了具体表达，试验中应随时严格遵守这些程序。处理和贮存样品时应留神从事，尽可能使其保持原来的状态。应认真选择采样点和采样频率，以便能够获得代表该点水质特性和变化性的数据。水样应准时分析。不能准时分析时，水样应于l4冷藏并在 6h 之内予以分析。培育基的质量把握对于微生物学分析的有效性至关重要。下面简洁介绍一些需要考虑的重要因素。订购仅够 1 年使用的培育基，首先使用贮备时问最