临床免疫学检验：免疫细胞功能检测技术

1、1 免疫细胞功能检测技术2免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞。主要分为以下三类：1、淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞2、单个核吞噬细胞：包括血液中单核细胞和各种组织中的巨噬细胞, 树突细胞3、其他细胞：包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板等。3 白细胞红细胞单个核细胞淋巴细胞粒细胞T淋巴细胞及其亚群B淋巴细胞及其亚群单核细胞血小板外周血计数、功能检测计数、功能检测 对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等功能测定可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能。 5一、T细胞功能的检测（掌握）二、B细胞功能的检测（掌握）三、NK细胞功能的检测（熟悉）四、吞

2、噬细胞功能的检测（熟悉、了解）6T细胞功能的检测体外试验T细胞增殖试验T细胞介导的细胞毒试验T细胞分泌功能测定体内试验7T淋巴细胞增殖试验 原理：淋巴细胞DNA合成分化淋巴母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松8体外引起淋巴细胞转化的刺激物分类：1、非抗原性刺激物（促有丝分裂原）刺激物 作用细胞群PHA 人T细胞 ConA 鼠T细胞PWM 人鼠T细胞92、抗原性刺激物 萄球菌毒素 纯化蛋白衍生物（PPD） 肿瘤抗原 同种异型组织抗原 Anti-CD310（一）形态法（二）同位素计数法（3H-TdR掺入法）（三）MTT比色法（四）CFSE染色法11形态法将外周血液或分离的单个核细

3、胞与适量的PHA混合，置37C培养72h,取培养细胞作涂片染色镜检。转化率= 转化的淋巴细胞数 X100% 转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数参考值：60-80%优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。附图12T淋巴细胞转化试验(形态法)13同位素法SI=PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值优点：敏感性高，客观性强，重复性好，可自动操作。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。14MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法优点：简单快速，无放射性污染PHA共同培养淋巴细胞终止

4、培养前数小时MTT混匀后培养加入DMSO后，测定细胞培养物的A570OD值CFSE染色法16T细胞介导的细胞毒试验原理：靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏 CTL靶细胞 17形态学检查法同位素法：51Cr释放法测定靶细胞释放51Cr放射性活性其它方法（自学了解）意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力18计数残留的靶细胞数计算淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制率1920T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。 21体内试验1、特异性抗原皮肤试验：OT试验24-

5、48h出现红肿硬结，d0.5cm,”+”2、PHA皮肤试验: 6-12h局部出现红肿硬结，d15mm,”+”3、接触性超敏反应22B细胞功能检测B细胞增生试验溶血空斑试验酶联免疫斑点试验体内试验23（一）B细胞增殖能力的试验抗IgM细菌脂多糖（lps）SAC的SPAB细胞增殖形态学3HTdR掺入法24经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验 反向溶血空斑试验 B细胞介导红细胞溶血定量分光光度法 B细胞产生抗体能力测定 （二）溶血空斑试验25经典溶血空斑形成试验26B细胞溶血空斑形成试验(被动)致敏SRBC受检细胞+补体27反向空斑形成试验致敏SRBC受检细胞+补体SPA+抗人Ig(桥梁)一个空斑表

6、示一个Ig分泌形成细胞28（三）酶联免疫斑点试验底物显色-测定抗体分泌量计数着色斑点细胞-检测抗体分泌细胞 待检细胞酶标记二抗该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。30(四)体内试验检测外周血中抗体的含量将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。31染色计数离心取上清测LDH或 AKP离心取沉淀测活细胞荧光 测发光强度 测CPM 值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法N

7、K细胞活性测定靶细胞溶解常用靶细胞: K562细胞株 YAC-1细胞株32 吞噬细胞功能检测小吞噬细胞中性粒细胞大吞噬细胞-单核细胞、巨噬细胞吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术33趋化34吞噬35利什曼原虫（绿色）被哺乳动物的巨噬细胞（黄色）吞噬 巨噬细胞吞噬大肠杆菌 36一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测37(一) 细胞运动功能趋化功能检测1.原理：382. 方法学：琼脂糖平板法 滤膜渗透法（Boyden 小室法）39(二)吞噬和杀菌功能测定 1显微镜检查法

8、：402. 溶菌法413NBT还原试验 424、化学发光法5、流式细胞仪检测43二、巨噬细胞功能检测炭粒廓清试验吞噬功能检测溶酶体酶测定细胞毒作用测定巨噬细胞促凝血活性测定比色法流式细胞仪检测44(一)炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。45(二)吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获

9、得鼠巨噬细胞。 46(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定1酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法2非特异性酯酶的测定 常用-萘醋酸法47(四) 细胞毒作用测定 用IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。48(五) 巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37，即时记录血浆凝固时间。49小结 T细胞功能检测B细胞功能检测NK细胞功能淋巴细胞功能吞噬细胞功能T细胞增生试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验B细胞增生试验溶血空斑试验酶联免疫斑点试验体内试验形态学酶释放法放射性核素释放法化学发光法流式细胞仪法免疫细胞功能检测的临床应用反映