药物动力学之体内药物分析 (2)课件

1、药物动力学常见研究方法样本时间(h)0.0830.1670.3330.51.02.03.04.0113.7209.2424.8032.0602.122212.6365.7703.1501.9470.8890.3550.1680.098334.33019.9907.2105.3201.8200.6700.4300.420423.3508.4803.9902.5201.0500.7600.7000.630544.89018.7304.8402.1801.8201.5700.7500.550 x28.80213.3385.6863.3541.5281.0950.5120.424s12.055.562

2、.241.420.470.650.230.20iv双黄连粉针(60mg/kg)后不同时间的黄芩甙血药浓度值(g/ml) 第三层次第二层次第一层次临床用药指南-临床模型选择与应用-药学理论规律-数学体内药物分析的定义狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析。广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价。CDUTCM在1979年的治疗药物监护杂志创刊号中指出：“历史必将证明体液中药物浓度的定量技术是药理学重大进展之一。”viviansectorCDUTCM体内药物分析Biopharmace

3、utical analysis体内药物分析方法的评价体内药物分析的方法设计与建立生物样品测定前的处理方法 体内药物分析样品的种类与储存 体内药物分析的对象与特点 viviansectorCDUTCM1从分析物分体内药物分析的对象母体药物代谢物内源性物质viviansectorCDUTCM体内药物分析的对象3从样品的来源分人体实验动物viviansectorCDUTCM体内药物分析的特点1干扰杂质多2样品浓度低3取样量少4工作量大5时间短viviansectorCDUTCM样品的种类与储存一、生物样品的采集 体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。vivi

4、ansectorCDUTCM血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞抗凝自然全血血液常用血样测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓viviansectorCDUTCM常用抗凝剂肝素枸橼酸草酸盐viviansectorCDUTCM取样次数viviansectorCDUTCM2尿样(urine) 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集,但注意应水解分离（?）浓度尿样体积viviansectorCDUTCMAnswer 尿中药物多数呈缀合状态OOHHOHHHHOHCOOHOH+ ROH、RCOOH、RNH2、RSHOOHHOHHHHOHCOOHO

5、R H+ROH、PHNH2、PHOHviviansectorCDUTCM注意viviansectorCDUTCM3唾液(saliva)唾液中药浓与血浓相关收集方法： 唾液的采样一般是在漱口后15分钟，收集门内自然流出或舌在口波内搅动后流出的混合唾液，然后用2000-3000rpm离心15分钟，小心吸取上清液，然后作进一步分离、净化处理后即可供测定用。viviansectorCDUTCM.其它非均匀样本处死动物后尽快取出心、肝、肾等待测组织，用生理盐水冲洗，除去血迹，滤纸拭干，准确称取一定重量组织块，在冰浴中匀浆，将各组织制成10%组织匀浆。 viviansectorCDUTCM常见采样时的冷却

6、剂viviansectorCDUTCM常见生物样品测定方法viviansectorCDUTCM生物样品测定前的处理方法处理方法选择的一般原则1药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性2浓度范围 灵敏的方法3测定的目的 (定性/定量 母体/代谢)4生物样品的种类5样品处理与分析方法的选择 专一性 灵敏性viviansectorCDUTCM生物样品测定前的处理方法预处理的目的存在形式的多样性 （游离结合代谢物）分离浓缩至富集避免出现浑浊和沉淀避免与试剂起反应减少设备损伤viviansectorCDUTCM生物样品去蛋白处理1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 （甲醇

7、1:2 乙腈1:1.5） (NH)2SO4 NaCl2加入酸性沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点viviansectorCDUTCM各种蛋白沉淀的相对效率viviansectorCDUTCM生物样品去蛋白处理3组织酶消化法加入酶使蛋白质水解(最常用枯草菌溶素）优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化4其他 加热 超滤 viviansectorCDUTCM生物样品缀合物水解1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 373溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入萃取溶剂时

8、发生分解。游离药物易于有机溶剂提取viviansectorCDUTCM生物样品的萃取1液-液萃取（1）优点：与杂质分离 简便 浓集 提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取也可。50%即可接受，以上较好（有了较好的重现性）。viviansectorCDUTCM（3）影响提取率的因素pH 碱性药物在碱性pH 酸性酸性pH，超过pKa1-2个pH值；为了较好的重现性，建议使用缓冲对控制样本pH值。提取溶剂 尽可能采用非极性溶剂（？），要求沸点低，不影响检测，性质稳定，不起化学反应。有时在碳氢化合物中加入醇类增加提取能力和减少容器的表面吸附。

9、viviansectorCDUTCM（）萃取方法溶剂用量一般为有机溶剂：水相1:1或1:2;萃取试管涡旋离心分层吸取上层保留待测层。viviansectorCDUTCM常用溶剂viviansectorCDUTCM乳化问题措施 轻缓振摇 含有分散度大或不溶物应过滤掉 避免在高pH条件下，从水中提取药物 避免使用易发生乳化的溶剂 萃取剂水中加入少量NaCl破乳方法 机械法 加入少量高级脂肪醇 改变表面张力 改善混合溶剂比例，增加分散相分数viviansectorCDUTCM药物的吸附玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷血浆? viviansectorCDUTCM液固萃取固相萃取sol

10、id phase extraction SPE针管式 抽空减压 加压 过滤viviansectorCDUTCM固相萃取步骤固相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相洗脱待测物 改变pH或极性 viviansectorCDUTCM影响固相萃取的因素（1）流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 510mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）装样 过载 突破性试验

11、 已知浓度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载 viviansectorCDUTCM（六）生物样品的组分浓集（七） 衍生化处理 GC衍生化 HPLC衍生化体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法灵敏度专属性光谱法+刚开始应用较多双波长，导数色谱法+HPLC GC免疫法+疫交叉反应，重现性根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的分析方法的设计依据方法的建立原始方法改进创新创立方法1做好文献总结2充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3明确测定目的、要求目的4结合实验室条件 设备

12、条件 预处理方法药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物分析方法的建立1纯品进行测定 确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T）2空白样品测定 确定空白样品是否有干扰3以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4空白样品加入标准液测定 标准曲线建立 回归方程 回收率5实验样品测定 以药物进行测定空白生物介质 + 药物空白生物介质(杂质)给药后的生物样品(有无药物?产物?)考虑内标的选择方法学的可行性验证评价方法学确认（评价、确证、考评） （validation）“生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学

13、研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究建立了检测方法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。” 摘自: 临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）分析方法的评价可行性和可靠性 1准确度 accuracy 测定结果与真实性的差异 用回收率表示 接近100% 相对恒定也称萃取回收率、提取回收率 测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液考虑3个浓度（高、中、低） 分布在标准曲线成上、中、

14、下一般要求绝对回收率在70%一般方法HPLC内标内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值10%绝对回收率方法回收率药物系列浓度+血样标准曲线实验方法：取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值15%，定量限 5);应使用与待测样品相同的生物介质;定量范围要能覆盖全部待测浓度;不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。 5线性范围（Linear range） 标准曲线标准曲线线性范围标准曲线的相关系数试验报告(论文)中应提供:5. 空白生物样品外加被试药物(低,中,高三个浓度; n5

15、)经标准曲线的反算(back-calculated)测定浓度标准曲线线性范围最低和最高浓度样品的色谱图viviansectorCDUTCM成分名称标准曲线（n=7）线性范围（g/ml）相关系数r定量限（ng）检测限（ng）1Y = + 0.13840.061-29.687r=0.999510.42Y = + 0.03120.050-24.450r= 0.99950.80.323Y= + 0.01710.062-30.300r= 0.999710.44Y= - 0.04290.170-33.100r= 0.99982.721.085Y = - 0.03070.074-14.494r=0.9990

16、1.20.48成分名称标准曲线（n=7）相关系数r线性范围（g/ml）芦荟大黄素y = 90092x - 579.810.99990.019-11.875大黄酸y = 89942x + 375.330.99990.016-9.78大黄素y = 79863x - 386.770.99990.020-12.12大黄酚y = 100818x - 224300.99910.021-13.24大黄素甲醚y = 73173x - 5966.60.99940.024-5.797如何测定超出线性范围的样品?Range: 10200ng/ml对大于200ng/ml的样品要进行稀释: 500ng/ml 50ng/

17、ml10X所处理和测定的结果是否符合要求: 50ng/ml的可信限之内 (50 ng/ml )对小于10ng/ml的样品如何处理: 10ng/ml 20ng/mlRange: 10200ng/mlx2所处理和测定的结果是否符合要求: 10ng/ml的可信限之内 (10 ng/ml )6稳定性（stability）（1）长期贮存稳定性-20-70（2）短期室温稳定性室温放置424h（3）冷冻解冻稳定性冷冻解冻冷冻解冻（4）贮备液稳定性 贮备液在室温或冷冻条件下viviansectorCDUTCM体内药物过程分段研究法Biopharmaceutical analysis药物排泄的实验方法药物代谢的

18、实验方法药物分布的实验方法 药物吸收的实验方法 分段研究的对象分段研究的对象viviansectorCDUTCM吸收实验viviansectorCDUTCM消化管吸收实验法透皮吸收实验法鼻腔吸收实验法其它给药途径吸收实验法消化管吸收实验法viviansectorCDUTCM体外实验法in vitro在体实验法in situ体内实验法in vivo体外实验法in vitro部份消化管，应用广泛缺血Ka实际值消化管中水分平衡，引起表观分布容积的改变同系物中脂溶性小的药物可能吸收更快？ viviansectorCDUTCMWiseman循环法viviansectorCDUTCM外翻肠囊法viviansectorCDUTCM在体连续注入法（双向与单向）vivianse