质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用培训课件

质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用1（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用2布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFES3质谱仪的工作原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即m/z=2U/v2

其中z为离子的电荷，U为加速电压，m为离子的质量，v为离子初加速后的运动速度。具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。质谱仪的工作原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按4电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource)。电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法。

质谱技术中的几种离子源基质辅助激光解吸离子化

(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)2.电喷雾离子化(Electrosprayionization，ESI)电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource5SampletargetIonopticsLineardetectorLaserMALDI-TOFMALDI:线性工作原理Mixmatrix&sampleontargetFirelaseratmatrix/sampleIonizesample(solidtogasphase)Accelerate/extractionsSeparateionsinanalyzerRecordspectrumatdetectorTimeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)02040608010010000200003000040000m/z+vemode[M+H]+ionsSampletargetIonopticsLinear6MALDI基质辅助激光解析附原理:

Streptococcuspneumoniae:masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinred~50%ofpeaksunambiguouslyrepresentribosomalproteinsproteinmassesobtainedfromtheSwiss-Prot/TrEMBLsequencedatabaseMALDI基质辅助激光解析附原理:

Streptococc7（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配ComparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabaseproteinmassesobtainedfromtheSwiss-Prot/TrEMBLsequencedatabase一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。About2,500cases/yearinUSA在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值C12H22NO10S3SARAMIS与LIMS系统Differenceincolonyinasamemedia2具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。Culturevender3venders不同细菌代表性指纹图谱不同如：蛋白质/多肽，多糖，多聚物等ShowspeaksspecifictobothspeciesCulturevender3vendersDryGasHeaterIdentification/ComparisonAnalysisExportdatatoMicroIDGenerateMolecularFormula质谱仪的基本结构一、真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.3×1043×105pa，质量分析器中应达1.3×106pa)。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、副反应过多，从而使图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。图5.1质谱仪的构成（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱仪的基本结8微生物鉴定方法感官视觉,嗅觉,味觉免疫单或多克隆抗体分子PCR……生化代谢能力和耐抗生素耗时气质法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖MALDI-TOFMS微生物鉴定方法感官免疫分子生化耗时气质法（GC-MS）MAL919/12/202210微生物鉴定新方法（MALDITOF）比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体分析时间仅12minutes14/12/202210微生物鉴定新方法（MALDITOF10ExportdatatoMicroIDTimeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)MS/MS提供结构信息Identificationwith>99%confidence布鲁克公司独家专利设计：micrOTOFQ：独特的三维信息“Thickness”ofdatabaseisimportant.准确质量动态范围

forensicscreening:positivehitsPresenceandabsenceofpeaks合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰(如在各谱图中出现70%的)种间特异性代表峰值用来区分不同菌种Differenceincolonyinasamemedia2Recordspectrumatdetector高质量准确度测定与液质联用Accelerate/extractions具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。现代微生物分类学:蛋白组学&基因组学

ProteinBacterialCellDNAGenomeProteomeDNAFingerprintMassFingerprintSpeciesDefinition&DeterminationMALDI-TOFMSExportdatatoMicroID现代微生物分类学111212

不同细菌代表性指纹图谱不同

各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！1212

不同细菌代表性指纹图谱不同

各菌种代表性峰型分布121313肠杆菌（Enterobacteriaceae）MS图谱示:

科,属,种特异性峰值部分峰值是多数菌种共有的（如m/z4365:核糖体蛋白L36)峰值有

科,属,种或

亚种-特异性种间特异性代表峰值用来区分不同菌种1313肠杆菌（Enterobacteriaceae）MS13核糖体蛋白不受生长条件影响MassspectraofProteusmirabilisDSM4479atdifferentincubationtimesNomajorqualitativechangesinpeakpatternsdistinguishingfamily,genusandspeciesDecreaseofsignalintensityovertimePresenceandabsenceofpeaksIdentificationwith>99%confidence核糖体蛋白不受生长条件影响MassspectraofP14样品SARAMIS工作流程转移细胞到MALDI靶板导入数据至SARAMISLIMS鉴定/比较分析基质样品SARAMIS工作流程转移细胞到MALDI靶板导入数15微生物鉴定流程生长在固体培养基上的菌落全细胞MALDI-TOF谱图数据库中参考谱图输出可信鉴定结果找到匹配度最可信的谱图微生物鉴定流程生长在固体全细胞MALDI-TOF谱图数据库16对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是20-30%991-AllMSIdentificationwith>99%confidenceRecordspectrumatdetectorOperator12peopleSigmaFit™参数（同位素峰形匹配）genus=>species=>strain质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource)。当设置误差范围<3ppm时：MS/MS提供结构信息SigmaTM=0.高度配合有特殊需求使用者高质量准确度测定与液质联用分子式测定和分子结构鉴定：masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinred一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。UniversityofHelsinki,FinlandGenerateMolecularFormula17鉴定结果界面样品名称鉴定结果置信度MS数据日期只需数秒，全自动添加新采集数据至鉴定结果界面！科属种型数据数量不同颜色代表不同置信水平

深绿:99.9%

浅绿:90-99.9%黄色:85-90%

白色:70-85%低于70%不显示置信值红色:提醒复杂的结果匹配2种或以上菌种，置信度>99%:鉴定混合菌对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是20-30%1717SARAMIS鉴定混合菌种AmassspectrumofamixedsamplecontainingPseudomonasaeruginosaandAchromobacterxylosoxidansShowspeaksspecific

tobothspecies300040005000600070008000900010000110001200013000Mass/Charge7291.64331.87319.65237.04973.76320.26692.27575.06618.34433.77097.78562.09086.06345.86045.05735.69402.710029.95209.06674.27487.87201.05014.67763.48880.73161.14700.96306.03787.23645.04543.14353.03344.55266.48745.86714.75676.09588.68403.99959.910123.29427.912565.810534.69215.88584.69724.211401.7SARAMIS鉴定混合菌种Amassspectrumo18

单核增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes(Lm)

兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是

20-30%该菌经常存在于速食食品中Ex.About2,500cases/yearinUSA食品安全

TokyoMarineUniversity,ProfKimuraandDr.TakahashiEatablewithoutheatedandcockedorcockedfood,ex.,ham,dailyproduct,salad,smokedfoodetc现有检测方法需要2步骤和选择培养基，耗时6天单核增生性李斯特菌Listeriamonocytogen19Yakult(养乐多)乳酸菌生产质量控制品种改良Performance+SARAMISYakult(养乐多)乳酸菌生产质量控制20Classifiedasgenus=>species=>strain“Thickness”ofdatabaseisimportant.From2011Europeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdisease菌种鉴定准确度ClassifiedasFrom2011Europe2119/12/202222SARAMISSpectralARchiveAndMicrobial

IdentificationSystem数据库含有超级谱图（SuperSpectra）和参考谱图（ReferenceSpectra）使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图软件包可实现谱图的存储，分析和比较使用者可以做聚类分析，创建系统树图用于菌株分型14/12/202222SARAMISSpectralAR22SARAMIS菌种特异峰型合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰(如在各谱图中出现70%的)在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定具有菌种特异性的峰值权重则会加重SARAMIS菌种特异峰型合成谱图包含所有在个体谱图中出现23SARAMIS–比较工具300040005000600070008000900010000110001200013000m/z5263777496388176879299706009481767464086754583398962102194469678837715709788831426260ClusteranalysisofselectedreferenceandsamplemassspectraComparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabaseSARAMIS–比较工具300040005000600024电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。Differenceincolonyinasamemedia2转移细胞到MALDI靶板GenerateMolecularFormulaFrom2011EuropeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdiseaseFrom2011EuropeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdiseaseSigmaFit™参数（同位素峰形匹配）Identificationwith>99%confidenceCollectisolatesfromourlabandotherfacilities(10)一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。genus=>species=>strainSigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.C55H93O25,1153.SARAMIS与LIMS系统Showspeaksspecifictobothspecies“Thickness”ofdatabaseisimportant.SigmaFit参数>>0用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配，选择Sigma值最小的分子式，即该化合物的分子式为：在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）atypicalreferenceisolatesareover-representedinSARAMISphylogeneticdistancephylogeneticdistancefrequencyfrequency自然界菌种多样性电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。在SA25SARAMISSuperSpectraDatabase1.Unambiguousidentificationwith80+%confidenceLIMSSARAMISReferenceSpectraDatabase2.Identification<80%confidenceornoidentificationbySSp:ExaminationofsignificantmatchesandreleaseLIMS

SARAMIS与LIMS系统

SARAMIS1.Unambiguousidentifi26CulturefromthestockingricelolCultureinvariousconditionsCollectisolatesfromourlabandotherfacilities(10)MeasureMSspectraandconstructDatabaseApplytouncertainty,whichreducestabilityofidentification Differenceincolonyinasamemedia2 HWproducttolerance3system Operator12people Culturemediamaximum5kinds Culturelength24,48,72h Culturevender3vendersMax3,240spectra深度透视数据库Culturefromthestockingric27MicroIDsystemintrucductionVersion1.0SampleTransferofcellstoMALDItargetExportdatatoMicroIDLIMSIdentification/ComparisonAnalysisMatrixMicroIDsystemintrucductionVe28质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用培训课件29自动鉴定界面比对鉴定界面MicroID自动鉴定界面比对鉴定界面MicroID30MALDITOFMS微生物鉴定优势一种对所有微生物都适用的方法无需预选测试与现代分类学结果一致高度配合有特殊需求使用者可扩展新菌种及其应用非常耐用且重复性高样品准备过程非常简化可进行高通量分析绝佳成本与效益比MALDITOFMS微生物鉴定优势一种对所有微生物都适用3132AXIMAMALDI:线性&反射

不只是微生物鉴定32AXIMAMALDI:线性&反射

不只是微生物鉴32MALDITOF全面解决方案MALDITOF全面解决方案33布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFES34高分辨质谱仪全方位应用

天然产物分析 药物研究 蛋白质组学 代谢组学 ............高分辨质谱仪全方位应用 天然产物分析35micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole电喷雾离子源去溶剂系统飞行管检测器反射镜离子聚焦系统四级杆Q碰撞池micrOTOFQDryGasHeaterOrthogo36micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole电喷雾离子源去溶剂系统飞行管检测器反射镜离子聚焦系统离子漏斗式传输四级杆Q碰撞池micrOTOFQDryGasHeaterOrthogo37布鲁克公司独家专利设计： 离子漏斗式传输系统离子流方向>>>离子传输率大大提高，从而提高灵敏度。增宽传输离子质量范围

离子流方向>>>传统的锥式离子传输布鲁克公司独家专利设计：离子流方向>>>离子传输率大大提高，38micrOTOFQ适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪分子式测定和分子结构鉴定：如：化学合成产品，配位化合物，天然产物，代谢物，残留农药等大分子研究如：蛋白质/多肽，多糖，多聚物等复杂混合物分析micrOTOFQ适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪39精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息MS/MS提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SigmaFit™参数（同位素峰形匹配）精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息40精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息MS/MS提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SigmaFit™参数（同位素峰形匹配）精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息41

C254H383N65O75S6,5735.65

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Intens.

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模拟同位素分布峰形SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配C254H383N65O75S6,5735.650242ExportdatatoMicroID离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即Timeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)Identificationwith>99%confidencegenus=>species=>strain布鲁克公司独家专利设计：布鲁克公司独家专利设计：“Thickness”ofdatabaseisimportant.在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SARAMIS工作流程MassSpectrum2006;20:1161-1167Eatablewithoutheatedandcockedorcockedfood,ex.Fingerprint991-AllMSAmassspectrumofamixedsamplecontaining增宽传输离子质量范围phylogeneticdistanceOrthogonalAcceleratorMicroIDsystemintrucduction

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模拟同位素分布峰形实测同位素分布峰形SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配SigmaFit参数=0SigmaFit参数>>0ExportdatatoMicroID213443437.0425438.0372439.0397440.03690.00.40.81.2437.0427438.0376439.0400440.03590.00.40.81.2437.0396438.0351439.03750.00.40.81.2436.0398Experimental436.0400C12H22NO10S3436.0367C15H18NO10S2024602460246435436437438439440441442m/zsigma=0.0167sigma=0.0231Intensityx104ABC鉴定化合物的有效工具--SigmaFit

两种可能元素组成的确定437.0425438.0372439.0397440.0344RecordspectrumatdetectorExaminationofsignificantmatchesandreleaseMALDITOF全面解决方案MassDistancem/z=2U/v2常规高分辨质谱仪在液质联用时面临的挑战~50%ofpeaksunambiguouslyrepresentribosomalproteins不同颜色代表不同置信水平atypicalreferenceisolatesareover-representedinSARAMIS浅绿:90-99.由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。phylogeneticdistance一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。精确质量(<3ppm)ExportdatatoMicroID布鲁克公司独家专利设计：人参提取液

（稀释倍数1:100;HPLCmicroTOFQ）种间特异性代表峰值用来区分不同菌种GenerateMolecularFormula微生物鉴定新方法（MALDITOF）分子量>500Da未知物的元素组成预测？Recordspectrumatdetector分子量45人参提取液

（稀释倍数1:100;HPLCmicroTOFQ）0510152025Time[min]02464x10Intens.BPC499.997-1299.991-AllMS1153.598181154.600531155.601441156.598420.000.250.500.751.001.251.504x10Intens.115411561158m/z人参提取液

（稀释倍数1:100;HPLCmicroT46当设置误差范围<5ppm时：171个可能的分子式GenerateMolecularFormula当设置误差范围<5ppm时：171个可能的分子式Gene4716个可能的分子式当设置误差范围<3ppm

时：GenerateMolecularFormula16个可能的分子式当设置误差范围<3ppm时：Gene48C55H93O25用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配，选择Sigma值最小的分子式，即该化合物的分子式为：GenerateMolecularFormulaC55H93O25用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配，选49SigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配1153.601141154.604561155.607421156.61021C55H93O25,1153.601153.595271154.598681155.601701156.60459C62H89O20,1153.5905001000150020002500Intens.050010001500200025001153115411551156115711581159m/zC55H93O25C62H89O20SigmaTM=0.0171SigmaTM=0.0540SigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配1153.6011450质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用培训课件51未知多肽测序测定

GluFib:MS/MSofm/z=785.8(+2)333.1898480.2559684.3445813.3868942.42871056.47041171.49911285.5426N+0.0006D+0.0017N-0.0012E-0.0007E-0.0003G-0.0001F-0.0012F-0.0023SA-0.0007V+0.0014G-0.0014+MS,2.8-3.4min#(85-103)024684x10Intens.200400600800100012001400m/zMassDistanceRMS误差:

0.00097Da未知多肽测序测定

GluFib:MS/MSofm/z52——动态范围的实际意义m/z855.xxxTIMED=150ppm高质量准确度测定与液质联用常规高分辨质谱仪在液质联用时面临的挑战——动态范围的实际意义m/z855.xxxTIMED=53LC/MS高质量准确度测定在法医药物监测中的应用Dept.ofForensicMedicineUniversityofHelsinki,FinlandRapidCommun.MassSpectrum2006;20:1161-1167LC/MSRapidCommun.MassSpectr54尿样–法医毒理分析总离子流色谱图TIC尿样–法医毒理分析总离子流色谱图TIC55离子漏斗式传输系统GenerateMolecularFormula红色:提醒复杂的结果ExportdatatoMicroID微生物鉴定新方法（MALDITOF）Yakult(养乐多)991-AllMS精确质量(<3ppm)ofForensicMedicineGenerateMolecularFormulaLineardetector不同颜色代表不同置信水平该菌经常存在于速食食品中布鲁克公司独家专利设计：masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinredReferenceSpectraMALDITOF全面解决方案TokyoMarineUniversity,ProfKimuraandDr.,ham,dailyproduct,salad,smokedfoodetc尿样–法医毒理分析——动态范围的实际意义增宽传输离子质量范围MS/MS提供结构信息MS/MS提供结构信息m/z=2U/v2micrOTOFQ：独特的三维信息Differenceincolonyinasamemedia2黄色:85-90%高分辨质谱仪全方位应用“Thickness”ofdatabaseisimportant.SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配“Thickness”ofdatabaseisimportant.具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。MALDI-TOFMS布鲁克公司独家专利设计：BacterialCell“Thickness”ofdatabaseisimportant.Timeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)C254H383N65O75S6,5735.在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）准确质量动态范围

forensicscreening:positivehitsDINORVENLAFAXINEerror:2.98ppmsigma:0.0165NORVENLAFAXINEerror:0.19ppmsigma:0.0084Signalintensity:8x103Signalintensity:2x106

离子漏斗式传输系统增宽传输离子质量范围准确质量动态范围

fo56质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用57（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用58布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFES59质谱仪的工作原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即m/z=2U/v2

其中z为离子的电荷，U为加速电压，m为离子的质量，v为离子初加速后的运动速度。具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。质谱仪的工作原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按60电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource)。电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法。

质谱技术中的几种离子源基质辅助激光解吸离子化

(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)2.电喷雾离子化(Electrosprayionization，ESI)电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource61SampletargetIonopticsLineardetectorLaserMALDI-TOFMALDI:线性工作原理Mixmatrix&sampleontargetFirelaseratmatrix/sampleIonizesample(solidtogasphase)Accelerate/extractionsSeparateionsinanalyzerRecordspectrumatdetectorTimeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)02040608010010000200003000040000m/z+vemode[M+H]+ionsSampletargetIonopticsLinear62MALDI基质辅助激光解析附原理:

Streptococcuspneumoniae:masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinred~50%ofpeaksunambiguouslyrepresentribosomalproteinsproteinmassesobtainedfromtheSwiss-Prot/TrEMBLsequencedatabaseMALDI基质辅助激光解析附原理:

Streptococc63（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配ComparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabaseproteinmassesobtainedfromtheSwiss-Prot/TrEMBLsequencedatabase一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。About2,500cases/yearinUSA在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值C12H22NO10S3SARAMIS与LIMS系统Differenceincolonyinasamemedia2具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。Culturevender3venders不同细菌代表性指纹图谱不同如：蛋白质/多肽，多糖，多聚物等ShowspeaksspecifictobothspeciesCulturevender3vendersDryGasHeaterIdentification/ComparisonAnalysisExportdatatoMicroIDGenerateMolecularFormula质谱仪的基本结构一、真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.3×1043×105pa，质量分析器中应达1.3×106pa)。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、副反应过多，从而使图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。图5.1质谱仪的构成（优选）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱仪的基本结64微生物鉴定方法感官视觉,嗅觉,味觉免疫单或多克隆抗体分子PCR……生化代谢能力和耐抗生素耗时气质法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖MALDI-TOFMS微生物鉴定方法感官免疫分子生化耗时气质法（GC-MS）MAL6519/12/202266微生物鉴定新方法（MALDITOF）比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体分析时间仅12minutes14/12/202210微生物鉴定新方法（MALDITOF66ExportdatatoMicroIDTimeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)MS/MS提供结构信息Identificationwith>99%confidence布鲁克公司独家专利设计：micrOTOFQ：独特的三维信息“Thickness”ofdatabaseisimportant.准确质量动态范围

forensicscreening:positivehitsPresenceandabsenceofpeaks合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰(如在各谱图中出现70%的)种间特异性代表峰值用来区分不同菌种Differenceincolonyinasamemedia2Recordspectrumatdetector高质量准确度测定与液质联用Accelerate/extractions具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。现代微生物分类学:蛋白组学&基因组学

ProteinBacterialCellDNAGenomeProteomeDNAFingerprintMassFingerprintSpeciesDefinition&DeterminationMALDI-TOFMSExportdatatoMicroID现代微生物分类学676868

不同细菌代表性指纹图谱不同

各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！1212

不同细菌代表性指纹图谱不同

各菌种代表性峰型分布686969肠杆菌（Enterobacteriaceae）MS图谱示:

科,属,种特异性峰值部分峰值是多数菌种共有的（如m/z4365:核糖体蛋白L36)峰值有

科,属,种或

亚种-特异性种间特异性代表峰值用来区分不同菌种1313肠杆菌（Enterobacteriaceae）MS69核糖体蛋白不受生长条件影响MassspectraofProteusmirabilisDSM4479atdifferentincubationtimesNomajorqualitativechangesinpeakpatternsdistinguishingfamily,genusandspeciesDecreaseofsignalintensityovertimePresenceandabsenceofpeaksIdentificationwith>99%confidence核糖体蛋白不受生长条件影响MassspectraofP70样品SARAMIS工作流程转移细胞到MALDI靶板导入数据至SARAMISLIMS鉴定/比较分析基质样品SARAMIS工作流程转移细胞到MALDI靶板导入数71微生物鉴定流程生长在固体培养基上的菌落全细胞MALDI-TOF谱图数据库中参考谱图输出可信鉴定结果找到匹配度最可信的谱图微生物鉴定流程生长在固体全细胞MALDI-TOF谱图数据库72对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是20-30%991-AllMSIdentificationwith>99%confidenceRecordspectrumatdetectorOperator12peopleSigmaFit™参数（同位素峰形匹配）genus=>species=>strain质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource)。当设置误差范围<3ppm时：MS/MS提供结构信息SigmaTM=0.高度配合有特殊需求使用者高质量准确度测定与液质联用分子式测定和分子结构鉴定：masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinred一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。UniversityofHelsinki,FinlandGenerateMolecularFormula73鉴定结果界面样品名称鉴定结果置信度MS数据日期只需数秒，全自动添加新采集数据至鉴定结果界面！科属种型数据数量不同颜色代表不同置信水平

深绿:99.9%

浅绿:90-99.9%黄色:85-90%

白色:70-85%低于70%不显示置信值红色:提醒复杂的结果匹配2种或以上菌种，置信度>99%:鉴定混合菌对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是20-30%1773SARAMIS鉴定混合菌种AmassspectrumofamixedsamplecontainingPseudomonasaeruginosaandAchromobacterxylosoxidansShowspeaksspecific

tobothspecies300040005000600070008000900010000110001200013000Mass/Charge7291.64331.87319.65237.04973.76320.26692.27575.06618.34433.77097.78562.09086.06345.86045.05735.69402.710029.95209.06674.27487.87201.05014.67763.48880.73161.14700.96306.03787.23645.04543.14353.03344.55266.48745.86714.75676.09588.68403.99959.910123.29427.912565.810534.69215.88584.69724.211401.7SARAMIS鉴定混合菌种Amassspectrumo74

单核增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes(Lm)

兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是

20-30%该菌经常存在于速食食品中Ex.About2,500cases/yearinUSA食品安全

TokyoMarineUniversity,ProfKimuraandDr.TakahashiEatablewithoutheatedandcockedorcockedfood,ex.,ham,dailyproduct,salad,smokedfoodetc现有检测方法需要2步骤和选择培养基，耗时6天单核增生性李斯特菌Listeriamonocytogen75Yakult(养乐多)乳酸菌生产质量控制品种改良Performance+SARAMISYakult(养乐多)乳酸菌生产质量控制76Classifiedasgenus=>species=>strain“Thickness”ofdatabaseisimportant.From2011Europeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdisease菌种鉴定准确度ClassifiedasFrom2011Europe7719/12/202278SARAMISSpectralARchiveAndMicrobial

IdentificationSystem数据库含有超级谱图（SuperSpectra）和参考谱图（ReferenceSpectra）使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图软件包可实现谱图的存储，分析和比较使用者可以做聚类分析，创建系统树图用于菌株分型14/12/202222SARAMISSpectralAR78SARAMIS菌种特异峰型合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰(如在各谱图中出现70%的)在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定具有菌种特异性的峰值权重则会加重SARAMIS菌种特异峰型合成谱图包含所有在个体谱图中出现79SARAMIS–比较工具300040005000600070008000900010000110001200013000m/z5263777496388176879299706009481767464086754583398962102194469678837715709788831426260ClusteranalysisofselectedreferenceandsamplemassspectraComparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabaseSARAMIS–比较工具300040005000600080电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。Differenceincolonyinasamemedia2转移细胞到MALDI靶板GenerateMolecularFormulaFrom2011EuropeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdiseaseFrom2011EuropeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdiseaseSigmaFit™参数（同位素峰形匹配）Identificationwith>99%confidenceCollectisolatesfromourlabandotherfacilities(10)一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。genus=>species=>strainSigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.C55H93O25,1153.SARAMIS与LIMS系统Showspeaksspecifictobothspecies“Thickness”ofdatabaseisimportant.SigmaFit参数>>0用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配，选择Sigma值最小的分子式，即该化合物的分子式为：在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）atypicalreferenceisolatesareover-representedinSARAMISphylogeneticdistancephylogeneticdistancefrequencyfrequency自然界菌种多样性电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。在SA81SARAMISSuperSpectraDatabase1.Unambiguousidentificationwith80+%confidenceLIMSSARAMISReferenceSpectraDatabase2.Identification<80%confidenceornoidentificationbySSp:ExaminationofsignificantmatchesandreleaseLIMS

SARAMIS与LIMS系统

SARAMIS1.Unambiguousidentifi82CulturefromthestockingricelolCultureinvariousconditionsCollectisolatesfromourlabandotherfacilities(10)MeasureMSspectraandconstructDatabaseApplytouncertainty,whichreducestabilityofidentification Differenceincolonyinasamemedia2 HWproducttolerance3system Operator12people Culturemediamaximum5kinds Culturelength24,48,72h Culturevender3vendersMax3,240spectra深度透视数据库Culturefromthestockingric83MicroIDsystemintrucductionVersion1.0SampleTransferofcellstoMALDItargetExportdatatoMicroIDLIMSIdentification/ComparisonAnalysisMatrixMicroIDsystemintrucductionVe84质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用培训课件85自动鉴定界面比对鉴定界面MicroID自动鉴定界面比对鉴定界面MicroID86MALDITOFMS微生物鉴定优势一种对所有微生物都适用的方法无需预选测试与现代分类学结果一致高度配合有特殊需求使用者可扩展新菌种及其应用非常耐用且重复性高样品准备过程非常简化可进行高通量分析绝佳成本与效益比MALDITOFMS微生物鉴定优势一种对所有微生物都适用8788AXIMAMALDI:线性&反射

不只是微生物鉴定32AXIMAMALDI:线性&反射

不只是微生物鉴88MALDITOF全面解决方案MALDITOF全面解决方案89布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS布鲁克各类现代生物质谱离子阱MALDITOF/TOFES90高分辨质谱仪全方位应用

天然产物分析 药物研究 蛋白质组学 代谢组学 ............高分辨质谱仪全方位应用 天然产物分析91micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole电喷雾离子源去溶剂系统飞行管检测器反射镜离子聚焦系统四级杆Q碰撞池micrOTOFQDryGasHeaterOrthogo92micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole电喷雾离子源去溶剂系统飞行管检测器反射镜离子聚焦系统离子漏斗式传输四级杆Q碰撞池micrOTOFQDryGasHeaterOrthogo93布鲁克公司独家专利设计： 离子漏斗式传输系统离子流方向>>>离子传输率大大提高，从而提高灵敏度。增宽传输离子质量范围

离子流方向>>>传统的锥式离子传输布鲁克公司独家专利设计：离子流方向>>>离子传输率大大提高，94micrOTOFQ适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪分子式测定和分子结构鉴定：如：化学合成产品，配位化合物，天然产物，代谢物，残留农药等大分子研究如：蛋白质/多肽，多糖，多聚物等复杂混合物分析micrOTOFQ适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪95精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息MS/MS提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SigmaFit™参数（同位素峰形匹配）精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息96精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息MS/MS提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SigmaFit™参数（同位素峰形匹配）精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息97

C254H383N65O75S6,5735.65

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模拟同位素分布峰形SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配C254H383N65O75S6,5735.650298ExportdatatoMicroID离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即Timeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)Identificationwith>99%confidencegenus=>species=>strain布鲁克公司独家专利设计：布鲁克公司独家专利设计：“Thickness”ofdatabaseisimportant.在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SARAMIS工作流程MassSpectrum2006;20:1161-1167Eatablewithoutheatedandcockedorcockedfood,ex.Fingerprint991-AllMSAmassspectrumofamixedsamplecontaining增宽传输离子质量范围phylogeneticdistanceOrthogonalAcceleratorMicroIDsystemintrucduction

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模拟同位素分布峰形实测同位素分布峰形SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配SigmaFit参数=0SigmaFit参数>>0ExportdatatoMicroID213499437.0425438.0372439.0397440.03690.00.40.81.2437.0427438.0376439.0400440.03590.00.40.81.2437.0396438.0351439.03750.00.40.81.2436.0398Experimental436.0400C12H22NO10S3436.0367C15H18NO10S2024602460246435436437438439440441442m/zsigma=0.0167sigma=0.0231Intensityx104