可见分光光度法

第八章可见分光光度法

组长：何星组员：周鑫一杨啸肖洪杨分光光度法的基本原理光吸收的基本定律—朗伯-比耳定律分光光度计的组成可见分分光光度计的分类定量分析方法分光光度法的应用分光光度法的基本原理

光的特性

光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式λν=ϲ亦反映光的波动性。光又是由大量具有能量的粒子流组成的，称为光子。能量与光长的关系Ε=hϲ/λ,可知光子的能量与光的波长有关，波长越短，光能越大；反之，光能越小。（1）光的颜色与波长人们眼睛能够感受的光是可见光，它是电磁辐射的一小部分颜色波长/nm颜色波长/nm近紫外200～400黄绿560～580紫400～430黄580～590蓝430～480橙590～620青色（蓝绿）480～500红620～760绿500～560近红外760～2500各种颜色光的近似波长范围（2）光的色散与互补当一束白光通过光学棱镜时，即可得到不同颜色的谱带，这种叫光谱，这种现象叫光的色散。白光色散后成为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等七色光，说明白光是由其各种色光按照一定比例混合而成的，所以叫复合光。如果两种色光按适当的强度比列混合后组成白光，则这两种色光称为“互补光色”。呈直线关系的两种光可混合成白光。例如在白色光中分离出蓝光后，剩下的混合光则呈现黄色，因此，蓝色光和黄色光为互补色光。物质对光的选择性吸收（1）物质的颜色物质呈现的颜色是物质对不同波长的光选择性吸收的结果，物质的颜色由透过光或反射光的颜色决定。当一束白光通过有色溶液时，某些波长的光波的光被溶液吸收，另一些波长的光不被吸收而透过溶液。溶液的颜色由透过光波长所决定。列如，KMnO4溶液强烈地吸收黄绿色的光，对其他的光吸收很少或很少吸收，所以溶液呈现紫红色。物质的颜色与吸收光颜色的互补关系物质的颜色黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿吸收光颜色紫蓝绿蓝蓝绿绿黄绿黄橙红波长/nm400～450450～480480～490490～500500～560560～580580～610610～650650～760物质对光的吸收曲线物质对光的选择性和吸收可用吸收光谱曲线（也称为吸收曲线)来描述：用连续的不同波长的光照射化合物的稀溶液，部分波长的光被吸收，被吸收光的波长和吸收程度取决于物质的结构。以波长λ为横坐标、吸收光度A为纵坐标，即得吸收光谱曲线。

不同浓度的高锰酸钾溶液吸收光谱曲线同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸收度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变。而对于不同物质，他们的吸收曲线形状和λmax则不同。③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸收度A有差异，在λmax处吸收度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。光吸收的基本定律—朗伯-比耳定律

朗伯-比耳定律:溶液的浓度愈大，通过的液厚度愈大，入射光愈强，则光被吸收的愈多。即物质对光的吸收程度与液层厚度和溶液的浓度成正比，这是定量分析的依据；表达式：lg

I0/It=Kbc或A=KbcIt/I0—透射率,用符号T表示,lgI0/It—吸光度，用A表示,b—吸收池内溶液的长度，c—溶液中吸光物质的浓度，K—吸光系数。吸光系数的物理意义：单位浓度的溶液，当液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度。K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。光通过吸收物质的示意图摩尔吸光系数当溶液的浓度以物质的量的浓度表示，液层厚度以厘米表示时，相应的比列常数K称为摩尔吸光系数，以Ɛ表示，其单位为L/(mol.cm)。这样，比尔定律可以改写成A=Ɛbc。摩尔吸光系数的物理意义是：浓度为1mol/L的溶液，在厚度为1cm的吸收池中，在一定波长下测得的吸光度。摩尔吸光系数表示物质对某一特定波长光的吸收能力。Ɛ愈大，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度也就愈高。一般认为Ɛ<1

×10⁴L/(mol.cm),灵敏度较低；Ɛ在1

×10⁴～6

×10⁴L/(mol.cm),属于中等灵敏度；Ɛ>6

×10⁴L/(mol.cm),属高灵敏度。摩尔吸光系数由实验测得。在实际测量中，不能直接取1mo/L这样高浓度的溶液去测，只能稀溶液中测量后，换算成摩尔吸光系数。质量吸光系数质量吸光系数适用于摩尔质量未知的化合物。若溶液浓度以质量浓度ρ（g/L)表示，液层厚度以厘米（cm）表示，相应的吸光系数则为质量吸光系数，以α表示，其单位为L/(g.cm)。同样朗伯-比耳定律可表示为：A=abρ偏离朗伯-比耳定律的因素当入射光波长及光程一定时，吸收光度A与吸光物质的浓度C呈线性关系。以某物质的浓度C为横坐标、吸光度A为纵坐标，绘出A-c曲线，所得直线称标准曲线（也称工作曲线）。但在实际工作中，尤其当溶液浓度较高时，标准曲线往往偏离直线，发生弯曲，这种现象称为对朗伯-比耳定律的偏离。如图：偏离朗伯-比耳定律的现象引起这种偏离的原因（1）物理因素引起的偏离单色光不纯单色光不纯引起的偏离的前提条件之一是入射光为单色光，难以获得真正的纯单色光。大多数分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，仍是复合光。因物质对不同波长光的吸收度不同，所以复合光引起定律的偏离。非平行光造成光的损失，使光度降低。杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。杂散光来源主要有仪器本身缺陷和光学元件污染。（2）化学因素引起的偏离化学因素主要包括吸光质点间的相互作用和化学平衡。按照朗伯-比耳定律的假设，所有的吸光质点之间不发生相互作用。但实验证明只有在稀溶液时才符合假设条件。当溶液浓度较大时，吸光质点间可能发生缔合作用，直接影响对光的吸收。在实际测定中应注意选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。

另外，溶液中存在解离、缔合、互变异构。配合物的形成等化学平衡，可导致吸光质点的浓度和吸光性质发生变化而产生对朗伯-比耳定律的偏离，列如：Cr2O72-+H2O⇌2H++2CrO42-CrO42-和Cr2O72-的颜色不同，在同波长下的ε值不同，所以当稀释溶液或增大PH时，平衡右移，Cr2O72-浓度下降，引起朗伯-比耳定律的偏离。分光光度计的组成

分光光度法是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质含量的分析方法。在可见光区的分光光度法称为可见光分光光度法。分光光度法是利用分光光度计来测量溶液的透射率或吸光度的。

分光光度计的基本部件有：光源、单色器、吸收池、检测系统、信号显示系统。光源→单色器→吸收池→检测系统→信号显示系统（1）光源光源的作用是供给符合要求的入射光。实际应用的光源一般分为紫外光光源和可见光光源。（2单色器单色器的作用是把光源发出的连续光谱分解成单色光，并能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光，它是分光光度计的心脏部分。单色器示意图单色器主要由狭缝、色散元件和透镜系统组成。其中色散元件是关键部分，色散元件是棱镜和反射光栅或两者的组合，它能将连续光谱色散成单色光。狭缝和透镜系统主要是用来控制光的方向，调节光的强度和“取出”所需要的单色光，狭缝对单色器的分辨率起重要作用，它对单色光的纯度在一定范围内起着调节作用。

分光光度计的单色器有棱镜和光栅两种。棱镜由玻璃或石英制成。玻璃棱镜只适用于可见光区，而石英棱镜可用于紫外-可见的整个光谱区。（3）吸收池吸收池又称比色皿，是用于盛放待测液和决定透光液层厚度的器件。根据光学透光面的材质，吸收池有玻璃吸收池和石英吸收池。玻璃吸收池用于可见光光区测定；若在紫外光区测定，则必须使用石英吸收池。在实际工作中，为了消除误差，在测量前还必须对吸收池进行配套性检验。为此，必须做到以下几点。拿取吸收池时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面。不能将光学面与硬物或脏物接触，只能用擦镜纸或丝绸擦拭光学面。凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长时间盛放在吸收池中。吸收池使用应立即用水冲洗干净。有色物污染可以用3mol/LHCl和等体积乙醇的混合液浸泡洗涤不得在火焰或电炉上加热或烘烤吸收池。（4）检测器检测器又称接收器，其作用是对透过吸收池的光作出响应，并把它转变成电信号输出，其输出电信号大小与透过光的强度成正比。常用的检测器光电池、光电管、光电倍增管等，对光电转换器的要求是：光电转换有恒定的函数关系，响应灵敏度要高、速度要快，噪音低、稳定性高，产生的电信号易于检测放大等。光电管工作电路示意图（5）显示系统光电转换器产生的各种电信号，经放大等处理后，用一定方式显示出来，以便于计算和记录。可见分光光度计的分类

1单光束分光光度计

单光束分光光度计的光路示意图如图所示，经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种分光光度计结构简单、操作方便、容易维修，用于常规分析。国产721型、722型分光光度计等均属于此类光度计。721型分光光度计示意图2.双光束分光光度计双光束分光光度计的光路，经单色器分光后由扇形镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池，光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射率，经对数变换将它转换成吸收度并作为波长的函数记录下来。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化引起的误差。3.双波长分光光度计双波长分光光度计是一种新型的分光光度计，能把同一光源发出的光通过一个特别的单色器，把光调成两束不同波长的光，经过切光器，使其交替通过吸收池，再至检测器，通过电子系统可以测出样品与参比的吸光度值，从而计算出被测组分的浓度。优点是可以消除人工配制的空白溶液与基底之间的差别而引起的误差，还能测定混合物溶液的吸光度。双波长分光光度计的原理示意图仪器波长的检验与校正按照分光光度计使用的步骤，以空气作参比，以谱钕光片进行波长的校正，具体步骤如下：

（1）调节好仪器后，在波长500~540nm范围内，每隔2nm测一次吸光度，找出吸光度最大时应的波长示值(λ测)。

（2）当|λ测-529|˃3nm时，应仔细调节波长调节螺丝，再按（1）的方法测定。重复以上两步操作，直至λ=529对应的吸光度最大。（3）波长矫正之后，就可以使用该仪器进行测定了。吸收池配套性的检查:石英吸收池在波长220nm处装蒸馏水，在波长350nm处装0.001mol/L的K2Cr2O7的HClO4溶液；玻璃吸收池在波长600nm处装蒸馏水，在波长400nm处装0.001mol/L的K2Cr2O7的HClO4溶液。以一个吸收池为参比，调节T为100%，测量其他各吸收池的透射率。透射率的偏差小于0.5%吸收池可配成一套。可见分光光度计的日常维护与保养（1）对仪器的工作环境的要求应安放在稳定的工作台上，室温保持在15~28℃，室内应干燥，相对湿度宜控制在45％~75％（不超过80%）。室内无腐蚀气体（如SO2,NO2及酸雾），应于化学分析操作室隔开，室内光线不宜过强。（2）仪器保养和维护方法仪器工作电源一般允许（220±22）V的电压波动。为了延长光源使用寿命，在不使用时不要开光灯源，光度减弱及时换新灯，手不要直接接触灯泡，若接触了应用无水乙醇擦拭。单色器是仪器的核心部分，装在密封盒内，不能拆开，还应及时更换单色器内的干燥剂。必须正确使用吸收池，保护吸收池光学面。电转换元件不能长时间曝光，应避免光照射或受潮积尘。定量分析方法1.工作曲线法

工作曲线法又称标准曲线法，它是实际工作中使用最多的一种定量方法。工作曲线的绘制方法是：配置四个以上浓度不同的待测组分的标准溶液，以空白溶液为参比溶液，在选定的波长下，分别测定各标准溶液的吸光度。以标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，在坐标纸上绘制曲线，此曲线即称为工作曲线。在相同条件下对待测试样进行显色反应，并测定其吸收光度Ax。再从坐标曲线上查找试样中待测组分的含量mx。若式样本身为有色的，则无需显色反应。2.比较法这种方法是用已知浓度的标准溶液（ϲs），在一定条件下，测得其吸光度As，然后在相同条件下测得试液ϲx的吸光度Ax。设试液、标准溶液完全符合朗伯-比耳定律：3.多组分定量

多组分是指在被测溶液中含有两个或两个以上的吸光组分。对于多组分的试液，如果各种吸光物质之间没有相互作用，且服从朗伯-比耳定律，这时体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性，由此可得：A总=A1+A2+…An=ε1bc1+ε2bc2…+εnbcn进行多组分混合物定量分析的依据是吸光度的加和性。假设溶液中同时存在两种组分a和b，他们的吸收光谱一般有三种情况。（1）吸收光谱曲线不重叠，或在a组分的最大吸收波长处b不吸收，在b组分的最大吸收波长处a不吸收，则可分别在波长λ1和λ2处测定组分a和b，而相互不产生干扰。（2）吸收光谱曲线部分重叠，在a组分的最大吸收波长处b不吸收，在b组分的最大吸收波长处a有吸收，则可看作a组分的单组份溶液，在波长λ1处测定组分a。（3）吸收光谱曲线重叠时，可选定两个波长λ1和λ2，并分别在λ1和λ2处测定吸光度A1和A2，根据吸光度的加和性，可得:

式中，Ca、Cb分别为a组分和b组分的浓度,画蓝色线的分别表示组分a和b在波长λ1处的摩尔吸光系数，紫色线分别表示为组分a和b组分在波长λ2处的摩尔吸光系数。高含量组分的测定—示差分光光度法

一般分光光度法仅适用于微量组分的测定，对于常量或高含量组分的测定则会产生较大的误差。这是因为待测组分浓度过高时，会偏离朗博-比耳定律，也会因超过适宜的读数范围而产生较大的误差，使结果准确度降低。示差分光光度法与普通光度法主要区别在于它们所采用的参比溶液不同。示差法一般采用一个合适浓度的标准溶液作参比溶液来调节光度计标尺读数以进行测量。

设待测溶液的浓度为cx，标准溶液的浓度为cs。示差法测定时，首先用标准溶液cs作参比调节仪器透射率T为100%（A=0），然后测定待测溶液的吸光度，该吸光度为相对吸光度ΔA。列如