实验五培养细胞的形态观察和计数

实验五培养细胞的形态观察和计数第1页/共20页实验五

培养细胞的形态观察和计数

实验目的了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。

第2页/共20页实验用品一、材料和标本

培养中的几种细胞。二、器材和仪器

倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管。三、试

剂

0.3%台盼兰染液等第3页/共20页实验内容

一、培养细胞的形态观察(一)原理体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞,如内皮细胞,叫贴壁型细胞。体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞-并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL-60,叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。

第4页/共20页第5页/共20页第6页/共20页第7页/共20页第8页/共20页(二)操作1.从培养箱中取出细胞培养瓶,注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。2.打开倒置镜光源,通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。3.调节载物台的高度进行对焦,在看到细胞层之后,再用细调节器将物像调清楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10×物镜。第9页/共20页（三）结果贴壁细胞一般有两种形状,即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片,如HeLa细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有圆核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起,细胞群常借原生质突连接成网,如

NIH3T3。第10页/共20页贴壁细胞在生长状态良好时,细胞内颗粒少,看不到有空泡,细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培养液清澈透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多时,表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌或真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚,透明发亮时,生长较好；反之,则较差或已死亡。第11页/共20页由于培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时,则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多；如呈紫红色,则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、pH、生长周期而改变,但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中,镜下折光率高,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。第12页/共20页第13页/共20页二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定（一）原理细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度,是进行实验必不可少的一种基本技能。第14页/共20页（二）操作1.将培养瓶中的培养液倒人干净试管中,向培养瓶中加入

0.25%胰蛋白酶

/0.02%EDTA混合消化液1.0m1,静置3～5分钟,待见到细胞变圆,彼此不连接为止。2.将试管中的培养液倒回培养瓶中,并轻轻进行吹打,制成细胞悬液。第15页/共20页3.取细胞悬液0.5m1,加入0.3%台盼兰染液0.5ml时,混合后染色

3～5分钟。4.滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上,使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加。在普通光镜10×物镜下计数四个大格内

(如图1，2示)的细胞数,压线者数上不数下,数左不数右。第16页/共20页第17页/共20页（三）结果细胞浓度计数4大格细胞总数×104×稀释倍数/4=细胞数／ml（4大格中细胞总数－染色细胞）×104×稀释倍数/4=活细胞数／ml悬液

注①

4大格中的每一大格体积为0.lmm3。

1ml＝10000大格，因此，1大格细胞数×104＝细胞数／ml。

注②

染色标本在15分钟内检