蛋白互作研究方法

蛋白互作研究方法第1页/共51页1研究蛋白质相互作用的意义

随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学proteomics应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用interactome的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。第2页/共51页2蛋白质相互作用常用研究方法1酵母双杂交(Yeasttwo-hybrid,Y2H)2pull-down3免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4双分子荧光互补技术(Biomolecularfluorescencecomplementation,BiFCorSplitYFP)5Far-westernanalysis第3页/共51页3酵母双杂交技术3.1原理DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentdomainsoftheprotein.第4页/共51页ThetwohybridtechniqueteststheabilityoftwoproteinstointeractbyincorporatingthemintohybridproteinswhereonehasaDNA-bindingdomainandtheotherhasatranscription-activatingdomain.

第5页/共51页3.2酵母双杂交文库构建与筛选BDMatchmaker™LibraryConstruction&ScreeningKits第6页/共51页诱饵蛋白载体构建第7页/共51页第8页/共51页pGADT7-RecVectorInformation第9页/共51页文库构建第10页/共51页第11页/共51页ConstructingADfusionlibrariesbyrecombination-mediatedcloninginyeast.第12页/共51页cDNAlibraryofoilseedrapelineRS-1constructedinyeast第13页/共51页Yeastcellsthataremating.Azygotetypicallyhasthree-lobedshape,thelobesrepresentingthetwohaploid(parental)cellsandthebuddingdiploidcells.Libraryscreeningbymating第14页/共51页PositiveclonesconfirmedonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal第15页/共51页检测特定两个蛋白是否互作第16页/共51页pGADT7VectorInformation第17页/共51页3.3膜蛋白互作研究方法－－－基于泛素的酵母双杂交体系(mating-basedSplitubiquitinsystem"mbSUS“)1）GAL4体系的缺点2)MbSUS体系第18页/共51页mbSUS原理第19页/共51页第20页/共51页InvivocloningintombSUSvectorsGATEWAYcloningmethod第21页/共51页第22页/共51页第23页/共51页第24页/共51页第25页/共51页第26页/共51页第27页/共51页第28页/共51页4pulldown1)原理第29页/共51页第30页/共51页2)试剂盒第31页/共51页TheMagneGST.Pull-DownSystem第32页/共51页Figure1.OverviewoftheMagneGST.Pull-DownSystemprotocol.P=PreyProtein,M=MagneGST.Particle.第33页/共51页5免疫共沉淀Co-IP第34页/共51页第35页/共51页第36页/共51页6Far-westernanalysis第37页/共51页

双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC)分析技术，利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突变体(YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。7双分子荧光互补技术BiFC第38页/共51页PrincipleoftheBiFCassay第39页/共51页GFP的特性绿色荧光蛋白(GFP)来源于水母(Aequoreavictoria)，分子质量约为27kda，能在各种细胞中表达.受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体中发出绿色荧光.1992年，Prasher等[2]克隆了GFP基因.随后，GFP作为一种研究基因表达和蛋白质定位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到了广泛的应用.第40页/共51页GFP的一些定点突变能明显地改变其波长性质.产生的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66

位的酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyanfluorescenceprotein，CFP)，203位的苏氨酸突变为酪氨酸后成黄色荧光蛋白(yellowfluorescenceprotein，YFP)，145位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成蓝色荧光蛋白(bluefluorescenceprotein，BFP)[3].2002年Hu等[1]最先报道了用BiFC技术在活细胞中观察bZIP和Rel家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP作标记，在荧光显微镜下用525nm波长直接检测黄色荧光.第41页/共51页GFP及其各种突变体的片段互补特性第42页/共51页Visualizationofproteininteractionsinlivingplantcellsusingbimolecularfluorescencecomplementation第43页/共51页Detectionofprotein–proteininteractionsinplantsusingbimolecularfluorescencecomplementationDepartmentofPlantSciences,TelAvivUniversity,TelAviv69978,Israel第44页/共51页Confocalimagesofbimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)studies第45页/共51页