药物筛选方法

药物筛选的方法分子水平筛选MicrobeadFCM联合筛选原理：FCM（流式细胞术）（flowcytometry）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，它可以根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合，利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM，不同荧光标记的Microbead就被分离出来，于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。应用：Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。蛋白质-蛋白质；蛋白质-RNA相互作用。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）原理：它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—ProteinA或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。应用：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MS质谱分析鉴定准备样品，常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。主要用于检测大分子和大分子相互作用。放射免疫性检测（RIA）（与EIA，FIA相比灵敏度更高，但由于放射性元素，RIA的使用受到了限制）原理：（1）竞争结合分析：Ag（非标记抗原）+Ab（特异性抗体）-AgAb*Ag（标记抗原）+Ab（特异性抗体）-*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）应用：（1）肿瘤相关抗原的测定：AFP，CEA，CA199，CA125，CA153，CA724，CYFRA211，PSA等（2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素等（3）非激素蛋白质的测定，酶，药物及维生素，免疫分子等的测定。（见文献）闪烁接近检测（SPA）原理：闪烁接近检测于1995年在美国和日本被提请专利。由于当固定在固相载体或96孔圆片上的受体被放射性标记的材料筛选时，需要过滤等额外步骤以定量分析放射性。为简化此步骤，研究人员发明了闪烁接近检测（SPA，ScintillationProximityAssay）法。在这个方法中，高产量的荧光分子被附到带有受体的固体上，通过放射性配体引起成键反应。同时，仍存留于溶液中的未成键的放射性配体被水分子抑制，而与荧光受体成键的配体的放射线被其周围的荧光分子吸收。因此，活性分子仅以荧光量分析而没有任何额外步骤就被简单的筛选出来。该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。紫外吸收光谱法（UVabsorption）原理：很多气体可以很好地吸收紫外光和可见光，尤其是有机化合物往往在此区域内拥有多个吸收峰而形成吸收带；可以通过测定其最强吸收波长处光强的变化，判断反应物的减少量或产物的增加量。不适合在此波长范围内都有吸收的化合物检测。（280~340nm）荧光检测技术（FA）原理：荧光材料在一定条件下每个分子能释放数千个光子，使理论上的单一分子水平检测成为可能。这种特性以及可采用多种荧光模式，使得荧光检测技术（FluorescenceAssay）成为高通量筛选必不可少的方法。然而，这个方法也有局限。荧光化合物不能像放射性同位素那样取代活性抗原的元素，它们必须连在抗原的某些连接位点上，而且这种修饰不能影响抗原的活性。荧光技术在非细胞相筛选分析中广为应用。荧光发射波长比吸收的入射波长要长些（能量损失-E=hν=hc/λ）荧光共振能量转移（FRET）原理：荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）是一种用来确定与不同荧光团结合的二个分子间距离的技术。当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，其能量就能有效地通过偶极子相互作用转移给受体。能量转移效率随供体和受体之间距离成相反变化，故分子间小的空间变化（几个埃）能显著影响能量的有效转移率。R0（50%能量转移效率时D的距离）与供体的发射域和受体的吸收域的重叠同时受体的量子产量还与溶剂有关。如果两个荧光分子相互距离小于R0，当供体的吸收光被发射的时候，理论上受体的荧光将会增强。如果其距离大于R0，当同样的光被发射时，将会检测到供体的荧光增强。所以，如果将荧光分子连接到如蛋白酶那样可作激酶的小分子酶上，很容易检测酶的活性。应用：Rodems等用FRET实验平台高通量的筛选了酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶的作用底物。可用于酶活测定。时间相关荧光技术（TRF）原理：荧光分析的灵敏度常受来源于试剂和容器等背景信号的限制，为了降低荧光背景，人们发明了与时间相关的荧光技术（TRF，TimeresolvedFluorescence）。普通荧光分子的激发态存在周期通常仅有几微秒，但是镧系元素的可达几毫秒。利用脉冲激发光源和门控检测器（或相调节技术）可在样品荧光信号采集之前让背景荧光信号消失。应用：TRF可与FRET联用，Kennedy等利用TRF-FRET技术测定了与早老性痴呆症密切相关的蛋白活性。时间分辨荧光（TRFIA，Timeresolvedfluoroisnmunoassasy）有非常少的稀土金属（Eu,Tb,Sm,Dy）的荧光寿命比较长，可达1-2ms,能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。平时常用的稀土金属主要是Eu和Tb，Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大，易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。荧光偏振检测（FPA）原理：荧光偏振检测（FPA，FluorescencePolarizedAssay）可测定一个由平面偏振光线激发的分子所发射出水平和垂直平面的光线，这两部分光线强度之差除以强度总和即为偏振值P。当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。由于荧光偏振光强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比，所以小分子物质在激发状态旋转速度快，P值较小；大分子物质在激发状态中旋转速度较慢，P值较大。FPmeasurementsprovideinformationonmolecularorientationandmobilityandprocessesthatmodulatethem,includingreceptor-ligandinteractions,proteolysis,protein-DNAinteractions,membranefluidityandmusclecontraction.AlphaScreen(激发波长大于发射波长，与一般的相反)原理：在AlphaScreen系统中主要含有两种核心物质，一为Donorbead，另一为AcceptorBead，当DonorBead所带有的A分子与AcceptorBead所带有的B分子产生交互作用时，可以680nm雷射光去激发DonorBead表面所带有的光敏感物质使其催化周遭的氧分子形成活化态，此活化态的氧分子可与邻近的AcceptorBead产生化学冷光化反应，并进一步借由能量转换激发AcceptorBead所带有的荧光物质产生520~620nm的荧光讯号。Gs偶联的GPCR被激活后，可激活细胞内的cAMP释放，并引起下游的信号转导。AlphaScreen技术用于cAMP检测采用了竞争性实验（CompetitionAssay）。反应体系内供体珠包被了亲和素，用于偶联上生物素化的cAMP；受体珠表面为anti-cAMP抗体；通过生物素化的cAMP可将供体珠和受体珠拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。将细胞裂解液加入反应体系内，胞内含有的游离cAMP同生物素化的cAMP竞争性结合抗体，体系产生的光信号降低。蛋白质交互作用（Protein-Proteininteraction）FusionTagDetectionKit-在此试剂中提供了带有Streptavidin的Donorbead以及带有Fusiontag专一性辨识抗体或分子的Acceptorbead.研究者只要能让两个研究对象（如：A蛋白与B蛋白），一方带有Biotin标定（如：BiotinylatedAprotein），另一方带有任一种常见Fusiontag（如：DIG-,HA-,His-,FITC-,FLAG-,GSTorc-MycfusionBprotein）即可利用此试剂进行蛋白质交互作用的分析实验。与时间相关荧光技术相似在体系内cAMP少，信号就强；与时间相关荧光技术不同在激发光的波长和光源不同。目前，高通量的生物标志物筛选分析对于自动化检测仪器平台的要求较迫切，而目前常见的生物标志物分析技术为ELISA。ELISA技术不可避免地需要多个洗涤步骤，这需要自动化仪器的复杂编程，将增加成本并降低准确性。ELISA技术动态范围为2个数量级，多数情况下需要对样本进行多次稀释以达到ELISA检测的范围内。AlphaLISA技术作为AlphaScreen的延伸，很好地满足生物标志物的高通量筛选需求。检测原理类似于双抗体夹心法。任何技术都是一把双刃剑，有优势也有限制，AlphaScreen/AlphaLISA技术也不例外。AlphaScreen技术主要的限制在于反应体系对于强光或是长时间的室内光敏感；其次，某些化合物对于单体氧分子的捕获会降低光信号；供体珠光漂白效应使得信号检测以单次为佳。与ECL、FMAT技术相似，AlphaScreen也需要高能激光器；同其他技术相比，AlphaScreen对于检测仪器平台有要求。AlphaScreen技术主要优势在于待测物质的范围宽泛，从小分子到大型复合物；均相体系、快速、稳定，灵敏度更高；AlphaScreen检测也不需要荧光标签的引入，避免了空间位阻影响生物分子的相互结合；可用于检测生物学粗提物例如细胞裂解物、血清、血浆、体液等，而不会影响测读效果酶联免疫吸附检测（ELISA）（洗板这一步很关键）原理：ELISA广泛用作非放射性同位素的实验中。其基本原理是首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面（一般为96孔板），并保持其免疫活性；然后使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。目前许多种疾病的诊断，人群流行病学的普查，活性物质筛选均采取这种方法。表面等离子体共振技术（SurfacePlasmonresonance）原理：表面等离子体共振（surfaceplasmonresonance，SPR）技术是一种基于物理光学现象的生化检测技术，SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感，当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR光谱（共振角的变化vs时间）能够反映与金属膜表面接触体系的变化。SPR技术实时检测、无需标记、抗干扰强，使得药物筛选的速度大大提高，成本大大降低，SPR技术应用广泛,作为一个技术平台已应用于生命科学的许多领域，特别是在药物发现过程中，应用SPR技术可通过分析化合物和靶标的亲和力筛选先导化合物。先导化合物被修饰后，用SPR技术还可评估药物与靶标之间的构效关系以及早期ADME评估和临床前后的监测等。小分子、大分子均可检测。等温量热滴定（ITC）原理：是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。大分子-大分子。细胞水平筛选离子通道检测（包括离子浓度，膜电位，pH值等，FLIPR）原理：FLIPR是美国moleculardevices公司开发的可以快速检测细胞内离子流动变化的一项技术。我们主要使用的是MembranePotentialAssayKit（膜电位试剂盒主要检测的是细胞膜内外电压的变化，通过荧光信号的上升或者下降，来评估化合物对离子通道的调节作用。当细胞膜去极化时，染料随着离子进入细胞，荧光信号值增加；而细胞膜过极化时，染料随着离子流出细胞，因此荧光信号值下降。）和Calcium5AssayKit。FLIPR的读数需要使用MD公司的FLIPR或FlexStation仪器进行检测。离子通道是细胞信号传递的基本途径之一,也是细胞许多生理活动过程的重要组成部分。于是电压敏感性FRET染料被用来研究多种药物在细胞内同离子通道的相互作用这对筛选和发现作用于离子通道药物大有帮助。同时这种方法还被用来检测钙离子浓度、膜电位、pH值等