PCR技术的原理及应用课件

定量PCR技术的原理及应用定量PCR技术的原理及应用1PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制ATCGCGATAGCGTAGCT2PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制ATCGCGATAGCGTAGCT3PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制ATCGCGATAGCGTAGCT4PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反应条件标准的PCR反应体系51234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基6实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用提纲实时荧光定量PCR原理提纲7在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时8常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时荧光定量PCR原理常规PCR技术：实时荧光定量PCR原理9实时定量PCR技术：

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实10如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分11实时荧光定量PCR原理--------扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理--------扩增曲线扩增曲线12实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈13实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义14实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴15实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想16实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩17提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理18非特异性荧光标记：1、SYBRGreenⅠ特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR原理---DNA产物的荧光标记QQR非特异性荧光标记：实时荧光定量PCR原理---DNA19实时荧光定量PCR方法1－－－SYBRGreenⅠ法实时荧光定量PCR方法120SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreenⅠ只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreenⅠ发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBRGreenSYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ21实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理522实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔23实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTm实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔24SYBRGreenⅠ法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物SYBRGreenⅠ法融解曲线分析融解曲线分析，单一25CyclenumberFlourescenc104102SampleCyclenumberLgofDNAconcentrationSYBRGreenⅠ法定量原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。CyclenumberFlourescenc104126SYBRGreenⅠ法--PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBRGreenⅠ使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBRGreenⅠ法--PCR反应的建立反应体27SYBRGreenⅠ法优缺点

对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点SYBRGreenⅠ法28实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法实时荧光定量PCR方法229与目标序列互补TaqMan---水解型杂交探针

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针与目标序列互补TaqMan---水解型杂交探针5′端标记30TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法工作原理每扩增一31TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqMan法PCR反应的建立132TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点TaqMan法优缺点33几种方法总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否复性/延伸熔解曲线分析定量和检测目标基因TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤SNP分析定量和检测目标基因几种方法总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应用范围S34实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理35总体注意事项准备一个无模板的对照来验证有无污染制备混合反应液，建议每个样本三个重复总体注意事项准备一个无模板的对照来验证有无污染36单重与多重实验DNA染料法只能做单重反应单重与多重实验DNA染料法只能做单重反应37引物设计一般在75-300bp避免引物二聚体，或扩增产物在二级结构处模板避免有长的（〉4）单碱基重复GC〉50-60%溶解温度在50-65℃避免超过3个G或C重复引物末端碱基为G或C引物设计一般在75-300bp38引物设计重中之重：1、特异性2、跨内含子或用DNA酶处理逆转录产物引物设计重中之重：39体系优化退火温度做一个温度梯度的PCR，其中Ct值最小，为最佳退火温度Ct值

最好不要超过30，否则可能发SCI文章会被拒。可以提高cDNA的浓度或者逆转录前提高mRNA的浓度。实在不行，可以通过拉开阴性对照与目标的Ct值，越大越好。上述都做不到，那改用探针法或其他方法溶解曲线

一般峰值在80度以上，在75度左右的是引物二聚体，出现这种现象，重新设计引物体系优化退火温度40体系优化标准曲线1、用作标准曲线的模板浓度范围必须涵盖所有待测样本的模板浓度2、扩增效率在90-105%之间；R2〉0.983、一致的重复反应体系优化标准曲线41unknown104103标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值unknown104103标准品，标准曲线42体系优化标准曲线

模板：1、已知浓度的样本（譬如多个拷贝的质粒）2、未知浓度的cDNA体系优化标准曲线43实时荧光定量PCR原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理---------标准曲线44确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25确定未知样品的C(t)值Sample实时荧光定量PCR原45数据分析——绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷贝数转基因的拷贝数相对定量：计算初始反应模板的相对含量差异表达分析芯片评估转基因生物的检测基因型检测数据分析——绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的46相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题解决样品材料不均一造成的差别解决加样过程中的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小对目的基因进行均一化：目的基因拷贝／每一个内标基因拷贝相对定量的目的47实时荧光定量PCR法标准样品相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转录的RNA实时荧光定量PCR法标准样品相对定量中的内标绝对定量的标准样48实时荧光定量PCR法定量方法绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）