微生物实验技术

第一章普通光学显微镜使用一、普通光学显微镜

当代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜光学系统中，物镜性能最为关键，它直接影响着显微镜分辨率。

微生物实验技术第1页油镜：放大倍数最大，可达100x，使用时需要在载玻片和镜头之间滴加镜油。1）增加照明亮度2）增加显微镜分辨率

微生物实验技术第2页微生物实验技术第3页微生物实验技术第4页二、使用前准备：1）光源调整自带光源或自然光源2）目镜调整双筒显微镜目镜间距能够适当调整，左目镜上普通还配有屈光度调整环，能够适应眼距不一样或双眼视力有差异观察者。3）聚光器调整光圈、光源亮度、聚光器高度微生物实验技术第5页三、显微观察

1）低倍镜观察：个体较大微生物如酵母菌观察，也用来确定高倍镜观察视野。养成好调焦习惯：侧面观察2）高倍镜观察：个体较小微生物观察。适当调整光圈及视野亮度。物镜同焦3）油镜观察：主要用来观察细菌。香柏油，光圈，照明

微生物实验技术第6页普通情况下，应恪守从低倍镜到高倍镜再到油镜观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发觉目标及确定检验位置。注意：切不可将高倍镜转动经过加有镜油区域。按照说明书对显微镜进行清洁保养。微生物实验技术第7页第二章细菌制片一、涂片

取一块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于载玻片中央；用接种环无菌操作在营养琼脂斜面上挑取适量菌苔，将沾有菌苔接种环置于载玻片上蒸馏水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养物涂片，可用接种环蘸取1－2环菌液直接涂于载玻片上。微生物实验技术第8页二、干燥自然干燥、用电吹风干燥。三、固定

涂菌面朝上，经过火焰2-3次。四、镜检

微生物实验技术第9页微生物实验技术第10页第三章细菌革兰氏染色微生物中细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有显著明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们结构。所以，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色反衬作用，能够十分清楚地观察到细菌形状、基本结构（壁、膜、细胞质、核及内含物）及从属结构（荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等）。微生物实验技术第11页革兰氏染色

1.制片取活跃生长久菌种按常规方法涂片(不宜过厚)、干燥和固定。2.初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1min后倾去染液，水洗至流出水无色。微生物实验技术第12页

3.媒染先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。4.脱色将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管加95%乙醇脱色(普通20-30s)，当流出液无色时马上用水洗去乙醇。微生物实验技术第13页5.复染将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。6.镜检油镜观察。微生物实验技术第14页微生物实验技术第15页革兰氏阴性菌：

细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，含有较多易被乙醇溶解类脂质，所以用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁通透性，使初染结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。微生物实验技术第16页革兰氏阳性菌：细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，所以细菌仍保留初染时颜色，展现蓝紫色。微生物实验技术第17页第四章真菌形态观察一、酵母菌形态观察及死活细胞判别

单细胞酵母菌个体是常见细菌几倍甚至几十倍，普通经过美蓝染液水浸片法或水一碘液浸片法来观察酵母菌形态。

微生物实验技术第18页1、美蓝染液水浸片法

滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。

用镊子取一块盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，迟缓将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。微生物实验技术第19页

将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态，并依据细胞颜色区分死活细胞。

染色30mm后再次观察，注意死活细胞百分比是否发生改变。

微生物实验技术第20页美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。因为新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变成无色还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱衰老细胞胞内还原能力弱，染色后细胞呈蓝色