水通道蛋白4在大鼠脑水肿中的表达及其意义

水通道蛋白4在大鼠脑水肿中的表达及其意义

脑出血会导致大脑损伤和水肿，颅内压会增加，甚至脑疝。因此,对脑水肿的诊断和治疗一直是临床探讨的重点课题之一。近年来,水通道蛋白-4(AQP4)作为介导脑组织水与电解质运输和平衡过程的重要因子,已引起了广泛关注。本研究应用出血性脑水肿大鼠模型,通过免疫组化方法观察AQP4在脑出血后不同时间脑组织的分布,探讨AQP4与出血性脑水肿之间的内在联系,为进一步研究其作用机制提供理论依据。1材料和方法1.1各组造模不注胶原酶结果比较成年健康雄性Wistar大鼠40只,体质量250～300g,购自重庆医科大学实验动物中心。随机分为正常对照组5只(不做任何处理),假手术组5只(造模不注胶原酶),出血组:30只,出血后6h、1d、3d、5d、7d每个时间点各6只。多克隆AQP4抗体为美国Chemicon公司产品,胶原酶VII型由美国Sigma公司提供,SP试剂盒为北京中山公司产品,其余化学试剂为国产分析纯。1.2免疫组化染色1.2.1脑出血模型制作参照Rosenberg等报道的方法,实验鼠经水合氯醛麻醉后,按包新民等方法将大鼠固定于立体定位仪上,取头皮正中切口,剥离骨膜,暴露前囟,于前囟后1mm,中线向左旁开3mm处钻一直径为1mm小孔,用固定于立体定位仪上的微量进样器沿针孔进针,进针深度为5.9mm,缓慢注射胶原酶1U,注完后留针5min,退针缝合皮肤。术后观察神经损害的症状和体征。模型成功的评分判断:大鼠清醒后,按Bederson等的评定方法分为3级,Ⅰ级:将大鼠尾巴提起,瘫痪侧前肢回收后屈曲于腹下,正常侧前肢向地面伸展;Ⅱ级:除Ⅰ级体征外,向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低;Ⅲ级:除以上体征外,大鼠有向瘫痪侧侧旋的行为。1.2.2AQP4免疫组化染色术后将出现神经功能障碍的大鼠随机分组,在预定时间点将鼠作常规灌注固定后取脑,在前囟及前囟后3.5mm将脑切成3部分,进行冰冻切片,片厚7μm。免疫组化步骤如下:(1)羊血清封闭,室温30min;(2)弃去血清,加抗AQP4抗体(1∶600)4℃过夜;(3)PBS洗3次,每次5min;(4)滴加生物素化羊抗鼠IgG(1∶100)37℃孵育1h;(5)PBS洗3次,每次5min;(6)加SABC底物,室温孵育1h;(7)PBS洗3次,每次5min;(8)DAB显色;(9)脱水、透明,中性树胶封片。免疫组化染色结果的判断:根据显色的有无及强弱综合评定,将免疫组化的结果分为5级:阴性(-):不着色;弱阳性(+):淡黄色;阳性(++):黄色;中等阳性(+++):棕黄色;强阳性(++++):为深棕黄色。1.2.3图像分析在20×10光学显微镜下,观察每一组动物同一部位切片,选择5个不重复视野进行观察,采用北航(CM-2000B)生物医学图像分析系统定量分析阳性细胞的平均面积。1.2.4统计学方法数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,用SPSS软件进行统计分析。2结果2.1aqp4表达见表1。脑组织免疫组化染色结果显示,AQP4在血肿周围的星形胶质细胞表达,神经元未见表达。AQP4阳性反应产物主要表达在细胞膜上,强阳性时胞浆有极少量表达,细胞核不表达。正常组和假手术组AQP4表达呈弱阳性,出血组各时间点AQP4表达均增强,AQP4的表达强度以脑出血后3d为最高。2.2出血前后d阳性细胞面积的变化脑出血后6h水肿带AQP4阳性细胞的平均面积开始增加,出血后第3d阳性细胞的平均面积最大,此后逐渐下降,出血后第7d阳性细胞面积仍高于正常水平(P<0.05)。3出血侧脑水肿的发生及病理生理特征AQP4是1994年新发现的一种水通道蛋白,应用Northernblot及Rnase方法测定的结果显示AQP4-mRNA在成熟大脑中含量最高,而在眼、肾、肠及肺含量较少,原位杂交实验显示其mRNA分布于导水管系统的室管膜细胞、构成脑皮质边缘的星形胶质细胞、下丘脑的视上核和室旁核中分泌加压素的神经元,并认为其在中枢神经系统作为渗透压感受器介导和调节水的运输和平衡。已有研究表明,AQP4不仅参与脑组织水代谢的生理和病理过程,而且可能调节脑脊液的形成及细胞外液容积的变化。若AQP4表达及调节失控,将导致后叶加压素失调,从而引起自发性尿崩症等疾病。Manley等研究AQP4在缺血性脑水肿中的作用,发现大脑梗死灶边界区AQP4过度表达,而正常鼠脑内AQP4低表达,缺乏AQP4的大鼠生存能力强,在AQP4低表达的鼠脑内水的容量和星形胶质细胞周围毛细血管水肿明显减轻,提示AQP4参与脑水肿的形成。Sato等在缺血性脑水肿的研究也得到类似的结果。这说明AQP4在缺血性脑水肿的病理过程中起关键性作用,然而AQP4在出血性脑水肿的分布目前尚未见报道。本实验结果显示,正常对照组、假手术组和实验组未出血侧大脑AQP4在各时相点均表达弱阳性,证实了Agre等的实验结果,即在生理条件,水通道基本上是处于激活状态,水转运过程很快,一般不需门控和其他调节。而在脑出血后6h,水肿区的阳性细胞数增多,阳性细胞面积增大,AQP4表达增强,第3d达高峰,此后逐渐回落,但1周后仍明显高于正常组。除此之外,在出血侧海马的锥体细胞层、齿状回的颗粒细胞层和多形细胞层有染色较弱的阳性标记,这与Venero等用原位杂交法在海马观察到的结果一致。表明在出血性脑水肿的形成过程中,随着出血时间的推移,AQP4的表达范围不断扩大,表达的强度也不断增加。以上结果提示:脑出血导致细胞内外水及电解质平衡失调,细胞内外渗透压发生改变,从而激活了位于细胞膜上的AQP4,使AQP4生物活性增高,促进水和电解质通过水通道,导致细胞水肿。因此,AQP4可能是造成出血性脑水肿的一个重要因素。Taniguchi等用原位杂交结合MRI发现,AQP4-mRNA在大脑中动脉阻塞后第1d已经有弱的上调,在第3d最明显,第7d后逐渐下降,此时脑水肿也开始消退,这与借助MRI检测脑水肿的形成及消退的过程呈平行关系。本实验结果与Taniguchi等的发现很相似,推测AQP4在参与缺血性脑水肿和出血性脑水肿的形成过程中,可能有相同的作用机制。AQP4分布于下丘脑视上核和室旁核已为大多数学者所证实,本研究也观察到同样结果。同时,我们还观察到在出血侧视上核和室旁核AQP4蛋白的表达与脑水肿的严重程度呈正相关。据Jung等报道,视上核和室旁核的牵张性离子通道对细胞膨胀等容量变化十分敏感,渗透压改变1%即可发生反应,通过合成和释放抗利尿加压素,调节脑内水与电解质的运输和平衡。AQP4作为渗透压感受器或受体,可以适时感受和调节视上核和室旁核组织内渗透压变化,从而参与抗利尿加压素的释放和调节。由此可见,AQP4在神经内分泌活动中具有十分重要的功能意义。此外,我们也发现AQP4还分布于脑表面的软脑膜、室管膜和脉络丛,与脑脊液的重吸收部位一致,推测脑水肿的发生发展过程与脑脊液的分泌和吸收障碍密切相关。然而,AQP4是否位于神经元的细胞膜,至今仍持不同的意见。Yamamoto等通过体外培养技术,采用RNase和RT-PCR检测方法,发现AQP4仅在星形胶质细胞表达,神经元和其他胶质细胞均未见表达。本实验结果除了发现AQP4分布在上述部位外,神经元亦未见表达,提示在视上核和室旁核表达AQP