《药物分析方法与运用》(研究生)全册配套完整课件

《药物分析方法与运用》(研究生)全册配套完整课件药物分析方法与应用我们的食品、药品怎么了？农药残留由于蔬果上的混合农药残留，居民几乎每天都在饮用一杯威胁健康的“农药鸡尾酒”“大量”合成色素的添加有6种人工色素包括人们所熟知的柠檬黄、日落黄会影响儿童的智力，严重时可导致儿童的智力严重下降“超量”防腐剂-“长寿月饼”食品防腐剂在食品中大量存在，如果大量使用和食用将对人体产生危害。特别是儿童、孕妇等，不宜食用那些过多使用防腐剂的食品。每人一天最多能喝几瓶饮料？国家《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-96)上规定：苯甲酸钠的最大添加量：0.2g/kg医学专家的实验结论，人体每天食用苯甲酸钠的安全量：5mg/kg计算一下：我们一天最多能喝几瓶？

2006年8月15日，国家药监局正式对外公布了“欣弗事件”的调查结果：安徽华源生物药业有限公司违反规定生产，无菌检查和热原检查不符合规定，是导致这起不良事件的主要原因。“百年品牌”漏洞百出从感冒药到止疼片，从抗过敏药到医疗器械，强生2010年已进行了大大小小15次召回。如何保证食品、药品的安全？大量各类违禁药物、残留化合物的分析以及病源微生物的检疫是至关重要的学习本课程的目的

通过本课程的学习，掌握食品药品分析中现代仪器分析原理和方法；熟悉各类药品的特性；了解相应的药物法规和药典的基本内容。本课程的考核方式课堂交流与课后思考题占40%出勤率占15%期末考试占45%（提交研究论文）

本课程的教学参考资料——图书《药物分析方法及应用》

马广慈主编《药物分析》安登魁主编《药物分析》刘文英主编《药物分析》

盛龙生等主编《生物药物分析》

何华主编《现代药物分析选论》

安登魁主编药物分析的参考资料——图书《中药制剂分析》魏璐雪主编《中药分析学》王强主编《现代药品检验学》马剑文等主编《生物技术制药》熊宗贵主编《实用药物分离鉴定手册》沈克温主编《PharmaceuticalAnalysis—ModernMethods》《AnalyticalProfilesofDrugSubstances》药物分析的参考资料——期刊分析化学（ChineseJournalofAnalyticalChemistry),1972年创刊药物分析杂志（ChineseJournalofPharmaceuticalAnalysis),1981年创刊中国药学杂志（ChinesePharmaceuticalJournal),1953年创刊药学学报（ActaPharmaceuticalSinica),1953年创刊TheAnalyst,1876年创刊，UKAnalyticalAbstracts，1960年创刊，UKAnalyticalBiochemistry，1960年创刊，USAJournalofAnalyticalToxicology,1977创刊，USA药物的参考资料——数据库资源CAS（ChemicalAbstractService)系统（)是目前世界上最完整、最权威、更新最快的化学资源数据库CA（ChemicalAbstacts）光盘数据库BA（BiologicalAbstacts）光盘数据库CPICD（中国药学文摘光盘数据库）CMMCC（中文生物医学期刊数据库）TTD(药靶数据库）Drugbank（药物数据库）PharmGKB（药物基因组数据库）Drugbank数据库PharmGKB第一章药物分析导论药物分析导论——药物分析的性质（一）

药物是指用于预防、治疗、诊断人类疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症、用法和用量的物质。包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生物制药、放射性药品、血清制品和诊断药品等。药物分析导论——药物分析的性质药物分析是运用化学、物理化学或生物化学的方法和技术研究化学结构已经明确的合成药物、天然药物和生物药物及其制剂的质量控制方法的学科。药物分析研究内容为药物的检验、药物稳定性、生物利用度，药物临床监测以及生物药物检定等多方面的定性定量分析；也包括毒物分析，运动员的兴奋剂检测等。药物分析导论——药物分析的任务药品质量检验——基本任务（1）对药物生产过程的质量监控（2）对药物制成品的质量检验（3）对药物贮运过程的质量监测（4）对临床用药进行监护药物分析导论——药物分析的任务新药研发——重要任务（1）药品质量标准建立与修订（2）药品稳定性研究（3）药代动力学研究（4）生物利用度研究药物分析导论——药物分析的任务临床药物分析

——为相关学科提供帮助（1）治疗药物监测(TDM)

（2）临床药理学(ClinicalPharmacology)

（3）临床药剂学(ClinicalPharmaceutics)药物分析导论——药物分析中常用的

分析方法

容量分析法重量分析法色谱分析法光谱分析法电化学分析法现代仪器分析技术经典化学分析方法分子生物学技术药物分析导论——药物分析中常用的

分析方法色谱分析法经典色谱法现代色谱法纸色谱法(PC)薄层色谱法(TLC)柱色谱法(CC)气相色谱法(GC)高效毛细管电泳法(HPCE)高效液相色谱法(HPLC)药物分析导论——药物分析中常用的

分析方法紫外—可见分光光度法(UV—Vis)红外分光光度法(IR)原子吸收分光光度法(AAS)原子发射分光光度法(AES荧光分析法(Fluor)质谱法(MS)核磁共振法(NMR)光谱分析法(波谱分析法)药物分析导论——药物分析中常用的

分析方法电泳杂交技术生物芯片PCR技术分子生物学技术免疫荧光技术蛋白相互作用药物分析导论——药物的质量标准

药品质量标准是国家对药品质量、规格及检验方法所作的技术规定，是药品生产、供应、使用、检验和药政管理部门共同遵循的法定依据。药物分析导论——药物的质量标准判断一个药品的质量是否符合药品质量标准的规定要求，必须全面考察以下三方面的检验结果，只要有任何一项不符合规定要求，即为不合格品。鉴别：依据药品的化学结构和理化性质进行某些特殊反应或测试某些专属的物理常数，来判断药品的真伪；检查：对生产中或引进的杂质，按照药品质量标准规定的项目进行检查，判断药品的纯度是否符合限量要求；含量测定：采用化学分析方法或物理方法，测定药品的有效成分含量是否符合规定的含量标准。

药物分析概论——药物的质量标准为了保证药品的质量，我国制定了三级药品质量标准，药品的质量标准是国家管理药品生产和管理的依据，具有法定的约束力。《中华人民共和国药典》，简称《中国药典》《中华人民共和国卫生部药品标准》

简称《部颁标准》

地方各省、市、自治区的《地方药品标准》药物分析导论——中国药典的基本内容我国自建国以来，分别于1953、1963、1977、1985、1990、1995、2000、2005年、2010年《中国药典》，2010.10.1开始正式执行2010版。英文名：ChinesePharmacopeia，缩写为ChP（2010）药物分析导论——中国药典的基本内容《中国药典》2010年版分为一、二、三部一部为中药（收载品种2165种）二部为化学药（收载品种2271种）三部为生物制品（收载品种131种）药物分析导论——中国药典的基本内容药典的内容凡例（GeneralNotices）正文（Monographs）附录（Appendix）索引（Index）药物分析导论——中国药典（2000版）示例药物分析导论——中国药典（2000版）示例药物分析导论——常见的国外药典进出口药品检验或仿制国外药品标准时，可供参考的国外药典有：美国药典（TheUnitedStatesPharmacopeia,USP,目前31版)美国国家处方集(TheNationalFormulary,NF，目前26版)英国药典（BritishPharmacopeia,BP，目前为2004年版)欧洲药典(EuropeanPharmacopeia，EP，目前为第52版)日本药局方(JapanesePharmacopeia，JP，目前为15版)…../pharmacopeia/bp.asp药物分析导论——药物分析工作的基本程序药品检验工作的基本程序： 准备、取样、性状、鉴别、杂质检查、含量测定、检验记录和检验报告。

药物分析导论——药物分析工作的基本程序取样（Sample）方法：要考虑取样的科学性、真实性与代表性

基本原则均匀、合理特殊装置如固体原料药用取样探子取样取样量设样品总件数为x

x≤3时，每件取样

3＜x≤300时，按ｘ＋１随机取样

x﹥300时，按ｘ／２＋１随机取样药物分析导论——药物分析工作的基本程序性状（Description）项下记述药品的：

1.外观、臭、味和稳定性；

2.物理常数，包括溶解度、旋光、比重等；例：苯甲酸

[性状]本品为白色有丝光的鳞片或针状结晶或结晶性粉末；质轻；无臭或微臭；在热空气中微有挥发性；水溶液显酸性反应。本品在乙醇、氯仿或乙醚中易溶，在沸水中溶解，在水中微溶。熔点本品的熔点（附录ⅣC）为121.0～124.5℃。药物分析导论——药物分析工作的基本程序鉴别（Identification）

判断已知药物及其制剂的真伪。判断一种药品不能只根据一种鉴别试验，必须经过几种特征试验才能作出判断性结论。例：苯甲酸

[鉴别]（1）取本品约0.2g，加4%氢氧化钠溶液15ml，振摇，滤过，滤液中加三氯化铁试液2滴，即生成赭色沉淀。（2）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱(光谱集233图)一致。药物分析导论——药物分析工作的基本程序杂质检查（Tests）在保证药品的有效和安全的原则下，允许药品在生产和贮藏过程引入的微量杂质的存在，亦称限度检查或纯度检查。药物分析导论——药物分析工作的基本程序含量测定（Assay）采用化学分析方法或物理分析方法准确测定药物的有效成分的含量。测定方法一般力求简便快速，易于推广和掌握。药物分析导论——药物分析工作的基本程序检验报告必须有检验人员、复核人员及部门负责人签名或盖章，必要时由检验单位盖章。1.原始记录必须真实，不得涂改，包括药品名称、批号、规格、数量、药品来源、取样方法、包装、检验项目、检验方法、检验数据等；2.检验报告书必须完整，简洁，包括记录内容、鉴别、检查、含量测定、结论等。药物分析导论——药物分析工作的基本程序示例一：经全面检验，“维生素C”的质量符合中国药典（2005版）的规定示例二：经全面检验，本品为“葡萄糖”；乙醇溶液的澄清度项不符合规定，其他各项检验均符合中国药典（2005年版）的规定。可改作“口服葡萄糖”用，但不得供制备注射剂用。示例三：经全面检验，本品为“葡萄糖注射液”，其热原检查不符合中国药典（2005年版）的规定，不得供药用。示例四：送检单位只要求做“维生素B12注射液”的pH值检验，pH值为5.5，“pH值”项符合中国药典（2005年版）的规定（pH值应为4.0～6.0）。药物分析导论——药物分析中的数据处理药物分析导论——药物分析中的数据处理误差：实际测定结果与真实值之间的差。系统误差：方法误差、仪器误差、人为误差、

试剂误差偶然误差：分布呈高斯曲线分布，也称随机误差3.过失误差：药物分析导论——药物分析中的数据处理准确度：测定值与真实值接近的程度，是由绝对误差和相对误差来表示1.绝对误差：2.相对误差：药物分析导论——药物分析中的数据处理精密度：表示2个或2个以上平行测定值相互之间接近的程度，即测定结果的重现性。平均偏差：相对偏差：标准偏差：

药物分析导论——药物分析中的数据处理有效数字：包括该数据中所有可确定的数字和第一个可疑的数字。

药物分析导论——药物分析中的数据处理可疑数据——过失误差的判断

在测定结果中有时会有偏离平均值很多的测定值，对可疑数据的取舍一般采用以下三种方法。四倍法：药物分析导论——药物分析中的数据处理2.Q检验法：药物分析导论——药物分析中的数据处理药物分析导论——药物分析中的数据处理3.格鲁布斯（Grubbs）T检验法：药物分析导论——药物分析中的数据处理分析方法的准确性——系统误差的判断1.t检验

（1）

平均值（X）与标准值的比较（μ）药物分析导论——药物分析中的数据处理（2）

两组数据的平均值比较（同一个样品）药物分析导论——药物分析中的数据处理2.F检验药物分析导论——药物分析中的数据处理相关与相关系数：

当r=+1或-1时，表示所有点处于同一直线上；当r=0时，表示排列杂乱无章或在一条曲线上；当r

>0时，称为正相关；当r<0时，称为负相关。第二章色谱法导论一、色谱法概述二、基本术语三、色谱理论概述四、分离条件的选择2024/9/4

随着科学的进步，某些关系到人们生命安全的生物药品，尤其是注射药品和生物工程产品等，都需要高度纯化。但是，经典的分离方法（如萃取、结晶等）很难满足需要。色谱法应运而生。产生的必然性《色谱技术丛书》傅若农主编汪正范刘虎威副主编本丛书包括共23个分册：《色谱分析概论》(第二版）傅若农《色谱柱技术》(第二版）

刘国诠余兆楼《毛细管电泳技术及应用》(第二版）陈义《高效液相色谱方法及应用》(第二版）于世林《气相色谱方法及应用》(第二版）刘虎威《液相色谱检测方法》（第二版）云自厚欧阳津张晓彤《气相色谱检测方法》（第二版）吴烈钧《色谱定性与定量》（第二版）汪正范《色谱联用技术》（第二版）

汪正范杨树民等《离子色谱方法与应用》（第二版）牟世芬刘克纳丁晓静《平面色谱方法及应用》（第二版）何丽一《色谱分析样品处理》（第二版）王立汪正范

《色谱仪器维护与故障排除》（第二版）

吴方迪《制备色谱技术及应用》袁黎明《亲和色谱方法及应用》

于世林《裂解气相色谱方法及应》金熹高《色谱手性分离技术及应》

邓玉林《气相色谱在石油化工中的应用》杨海鹰《色谱在环境分析中的应用》

江桂斌牟世芬《色谱在食品安全分析中的应用》王绪卿吴永宁《色谱在生命科学中的应用》

廖杰钱小红《色谱在药物分析中的应用》田颂九胡昌勤《色谱在无机材料分析中的应用》

胡净宇梅一飞2024/9/4一、

色谱法概述

色谱法是一组相关技术的总称，又叫做色谱分离、层析法，是一种高效而有用的分离技术。2024/9/4碳酸钙石油醚色谱带植物色素的石油醚提取液

发展史创始人：茨维特1906纸色谱薄层色谱气相色谱高效液相色谱离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱2024/9/4混合物样品流动相固定相2024/9/4色谱法分离原理

分配系数K分配过程物质在固定相和流动相之间发生的吸附、脱附和溶解、挥发的过程分配系数K在一定的温度和压力下，组分在两相之间达到分配平衡时的浓度比当K=1时，组分在固定相和流动相中浓度相等；当K>1时，组分在固定相中的浓度大于在流动相中的浓度；当K<1时，组分在固定相中的浓度小于在流动相中的浓度。物理意义：组分保留程度的量度:K值小，先出柱子

K值大，后出柱子影响因素：K只与固定相、温度或压力有关，

与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。

cs：组分在固定相中的浓度cM：组分在流动相中的浓度图

不同K值对两组份分离的影响ΔK值比较小ΔK值比较大不同物质在两相间具有不同的分配系数分配系数是色谱分离的依据二、色谱基本术语2024/9/4峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差σ峰面积相对保留时间色谱基本术语保留时间tR：进样到出现色谱峰的时间保留体积VR：进样到出现色谱峰时消耗流动相的体积死时间t0：流动相流过色谱柱的时间死体积V0：色谱柱的空隙体积相对保留时间t’R：

t’R=tR-t0

相对保留体积V’R；

V’R=VR-V0

VR=tR*uu——流动相流动线速度2024/9/4分配比（容量因子或容量比）k在一定的温度和压力下，组分在两相之间达到分配平衡时，组分在两相中的质量比ms：组分在固定相中的质量；mM：组分在流动相中的质量；k与固定相,流动相性质及柱温有关；与流速，柱尺寸无关分配系数K与分配比k的关系式中：VM：流动相的体积；Vs：色谱中表示固定液的体积

或吸附剂的表面容量；

β:相比；称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，=6~35；对毛细管柱，=60~6002024/9/4k与tr、t0相关，

可由实验测得分配比k与保留时间t的关系2024/9/4相对保留值（分离因子）r：r由两个组分的热力学性质决定，与色谱柱的长短粗细无关fs=0.95～1.05，色谱峰为对称峰fs<0.95,前延峰fs>1.05，拖尾峰2024/9/4对称因子fst三、色谱理论概述热力学理论：塔板理论——平衡理论（基础）

动力学理论：速率理论——vanDeemter方程2024/9/4

最早由Martin等人1952年提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。塔板理论（platetheory）塔板理论：（四个假设）

色谱柱存在多个塔板，在每个塔板上，组分分配瞬间达到平衡流动相间歇式（脉动式）进入色谱柱，每次进气一个塔板体积样品和流动相均加在第0号塔板上，且忽略样品沿柱方向的纵向扩散分配系数在各塔板上是常数。2024/9/4理论塔板数的计算和测定

色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

理论塔板数n——组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数2024/9/4由此可知，组分保留时间越长，峰形越窄，理论塔板数越大，所以n和H做为描述色谱柱效能的指标，高柱效有大的n值和小的H值

理论塔板高度

H——为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置，阐明了分配比k与柱效的关系，提出了评价柱效高低的n和H的计算式塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。

为了消除死时间的影响，通常使用有效理论塔板数n有效和有效塔板高度H有效作为色谱柱效能指标2024/9/4塔板理论的贡献：塔板理论不足：做出了四个与实际不相符的假设，忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程

只定性给出塔板高度的概念，却无法解释塔板高度的影响因素

排除了一个重要参数——流动相的流速u，因而无法解释柱效与流速关系，更无法提出降低板高的途径

2024/9/4速度理论：速率理论是1956年荷兰学者VanDeemter等提出，因此又称作VanDeemter方程运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素

2024/9/4涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项A——涡流扩散项：固定相填充不均匀引起的扩散2024/9/4产生原因：流动相携样品进柱，遇到来自固定相颗粒的阻力→路径不同→涡流扩散

影响因素：固体颗粒越小，填充越均匀，A项越小B——分子扩散项：分子沿色谱柱轴向扩散引起

的色谱带展宽2024/9/4产生原因：峰在固定相中被流动相推动向前、展开→两边浓度差

C——传质阻力项：组分在流动相和固定相之间传质的阻力2024/9/4产生原因：样品在气液两相分配，样品未及溶解就被带走，从而造成峰扩张2024/9/4A项（颗粒度和柱床填装的优良程度）线速度U

（mm/sec）最低HETP=>最优化的塔板数C项（传质）B项（轴向扩散）三项加在一起最终得到的“vanDeemter曲线”VanDeemteer方程式VanDeemteer方程式优点：—吸收了塔板理论的有效成果——H，—从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素速率理论的意义：为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导2024/9/4四、分离条件的选择色谱柱对样品分离效果，可以从三个方面进行评价：1、有较低的塔板高度H或较大的理论塔板数n2、有较好的选择性α3、分离度R的大小2024/9/4选择性：分离两种组分的调整保留时间之比，用选择因子α表示，即为相对保留

值r

2024/9/4α

越大，两个组分分离效果越好分离度R：衡量混合物中两个成分的分离程度，是一个综合指标，考虑了保留时间和峰宽2024/9/42024/9/4分离度R与n的平方根成正比，增加柱长可以改进分离度，但同时引起峰展宽。故在达到一定的R时应使用短一些的色谱柱；增加n的另一种方法是减小色谱柱的H值。容量因子k值较大，对R有利。选择因子a越大，柱选择性越好，分离效果越好；增大a值是提高分离度的有效办法2024/9/4分离条件的选择103思考讨论题色谱流出曲线（色谱图）中，相邻两峰之间的距离是由分配系数还是由扩散速率决定的？为什么？另外一个因素会对色谱图造成什么影响？第三章气相色谱法

(GasChromatography,

GC)2024/9/4一、气相色谱仪概述二、色谱柱三、检测器四、定性、定量方法五、应用1947年Janák发明第一台气相色谱仪，分析挥发性烃类化合物。1952年Martin和James发明了第一个气相色谱检测器TCD。用来检测脂肪酸的分离。1958年Gloay首次提出毛细管柱，同年，Mcwillian和Harley同时发明了FID，Lovelock发明了氩电离检测器（AID）。1960年Lovelock提出电子俘获检测器（ECD）。1966年Brody等发明了FPD。20世纪80年代，弹性石英毛细管柱的快速广泛应用。20世纪90年代，由于电子技术、计算机和软件的飞速发展，从而使气相色谱成为快速、灵敏的分析仪器之一。一、气相色谱仪概述——发展气相色谱仪分类2024/9/4气相色谱仪结构2024/9/4载气系统进样系统检测系统分离系统载气系统——获得纯净、流速稳定的载气。包括载气、压力计、流量计及气体净化装置。2024/9/4各类净化器2024/9/42024/9/4进样系统2024/9/4柱分离系统：柱分离系统是色谱分析的心脏部分。分离柱包括填充柱和毛细管柱。柱材料包括金属、玻璃、融熔石英、Teflon等柱温：是影响分离的最重要的因素2024/9/42024/9/4恒温：45oC程序升温：30~180oC恒温：145oC温度低，分离效果较好，但分析时间长程序升温，分离效果好，且分析时间短温度高，分析时间短，但分离效果差程序升温与恒温对分离的影响比较温度对分离效果的影响2024/9/4二、色谱柱气相色谱柱是色谱仪的分离系统色谱柱分两类：填充柱毛细管柱2024/9/4

2024/9/4不锈钢填充柱玻璃填充柱0.53mm0.32mm0.25mm…..石英毛细管柱固定相2024/9/4常用的吸附剂2024/9/4固定液2024/9/4

固定液：高沸点难挥发有机化合物，种类繁多。(1)对固定液的要求

应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应。

(2)选择的基本原则

“相似相溶”，选择与试样性质相近的固定相。(3)固定液分类方法2024/9/4

如按化学结构、极性、应用等的分类方法。在各种色谱手册中，一般将固定液按有机化合物的分类方法分为：脂肪烃、芳烃、醇、酯、聚酯、胺、聚硅氧烷等，(4)最高最低使用温度

高于最高使用温度易分解，温度低呈固体；(5)混合固定相

对于复杂的难分离组分通常采用特殊固定液或将两种甚至两种以上配合使用；(6)固定液的相对极性2024/9/4

规定：角鲨烷（异三十烷）的相对极性为零，

β，β’—氧二丙睛的相对极性为100.2024/9/4HP-1、HP-5、HP-5ms色谱柱HP-1色谱柱固定相为：100%-二甲基聚硅氧烷；HP-5色谱柱固定相为：（5%）-二苯基（95%）-二甲基聚硅氧烷；HP-5ms柱的固定相为：（5%）-二苯基（95%）-二甲基亚芳基硅氧烷共聚物ms柱热稳定性能比普通色谱柱好一些。2024/9/42024/9/4填充柱和毛细柱的特点对比材料填充柱的材料为不锈钢或玻璃管毛细柱的材料为柔性石英管外观填充柱的内径粗，一般2～3毫米；长度一般0.5～3米毛细柱的内径细，0.2～0.53毫米；长度一般15～100米填充柱和毛细柱的特点对比内部

填充柱内有涂过固定液的填料，会形成气阻

毛细柱为空管，固定液涂在毛细管的内管壁

表面，气阻很小分离效率

填充柱低，塔板数一般不超过2000/米

毛细柱高，塔板数一般达几万流量

填充柱的流量一般为20～30毫升/分

毛细柱的流量一般为0.2～5毫升/分2024/9/42024/9/4毛细管柱填充柱三、气相色谱检测器2024/9/4

色谱仪的关键部件之一，种类较多，原理和结构各异。有的具有广普性，有的具有高选择性，仅对某类物质有高响应。1、检测器特性

浓度型检测器：测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测信号值与组分的浓度成正比。质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比。检测器的类型热导检测器

(Thermalconductivitydetector,TCD);氢火焰离子化检测器(Flameionizeddetector,FID);电子捕获检测器

(Electroncapturedetector,ECD);火焰光度检测器(Flamephotometricdetector,FPD);氮磷检测器（NPD）也称热离子检测器(Thermionicdetector,TID);具有定性功能的检测器（联用技术）2024/9/4

热导检测器（TCD）2024/9/42024/9/42024/9/4

氢火焰离子化检测器（FID）2024/9/4

有机物在火焰中电离形成离子流，根据离子流的出现和大小进行分析2024/9/4

电子捕获检测器（ECD）2024/9/42024/9/42024/9/4最常用检测器的排名TCD和FID一直是互为第1、2位的，是二个最常用的检测器ECD和FPD基本上互为稳居第3、4位NPD和PID为第5、6位其他检测器有MSD、HID及AED2024/9/4FTIR、2024/9/4检测器的分类检测方法工作原理检测器应用范围物理常数法热导系数差异热导检测器TCD所有化合物气相电离法火焰电离火焰电离检测器FID有机物热表面电离氮磷检测器NPD氮、磷化合物化学电离电子捕获检测器ECD电负性化合物光电离光电离检测器PID所有化合物光度法原子发射原子发射检测器AED多元素分子发射火焰光度检测器FPD硫、磷化合物分子吸收傅立叶变换红外光谱FTIR红外吸收化合物分子吸收紫外检测器UVD紫外吸收化合物电化学法电导变化电导检测器ELCD卤、硫、氮化合物质谱法电离和质量色散质量选择检测器MSD所有化合物2024/9/4四、定性、定量分析GC分析对象是在气化室温度下能生成气态的物质。为保护色谱柱、降低噪声、防止生成新物质（杂峰），需要在进样前对样品进行处理。水、乙醇和可能被柱强烈吸附的极性物，会使柱效下降非挥发性成份，会产生噪声，同时慢慢分解，产生杂峰。稳定性差的组分，可能生成新物质，形成杂峰。2024/9/4色谱图2024/9/4定性分析方法2024/9/42024/9/42024/9/4保留指数计算公式

[lgt’(x)

–lgt’(N)][lgt’(N+1)-lgt’(N)]2024/9/4I=100N+2024/9/42024/9/4定量分析方法2024/9/4峰面积2024/9/42024/9/4定量分析方法2024/9/4定量分析方法2024/9/4定量分析方法2024/9/42024/9/42024/9/4五、气相色谱法的优点：速度快、分离效能高、灵敏度高2024/9/4外标法测定柴油成分藏青蒿精油的GC谱2024/9/4用C6～C20正构烷烃计算I值2024/9/4气相色谱仪2024/9/4气相色谱仪2024/9/4安捷伦6850气相色谱仪2024/9/42024/9/4安捷伦6850界面完成仪器参数设置2024/9/4安捷伦6850界面完成仪器参数设置和工作状况监控任务2024/9/42024/9/4安捷伦6850界面完成仪器参数设置6850数据再处理界面2024/9/46850数据报告2024/9/4课堂思考与练习：毛细管柱的柱效明显高于填充柱，是不是填充柱可以被取代了？如果不是，请写出理由？实验室需要采购一台GC，主要对大气中的CO、CO2、NO等进行检测，请问应该必须选配什么检测器？第四章液相色谱

（LiquidChromatogrphy，LC）一、液相色谱概述二、仪器结构三、溶剂优化和梯度洗脱四、定性和定量分析2024/9/42024/9/4液固色谱液液色谱一、液相色谱与气相色谱的比较相同之处——基本概念一致：

保留因子k、塔板数n、塔板高度H、分离度R、选择性a2024/9/4LC与GC的不同之处GCLC流动相气体液体应用范围可挥发性物质，热稳定性好化合物（约占有机物的20%）高沸点、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物、高聚物（约占有机物的70-80%）分离作用流动相载气是惰性气体，不参与分配平衡过程，样品只与固定相相互作用

流动相参与分配平衡，与固定相争夺样品分子，对于提高选择性又增加了一个因素流动相的扩散性样品在气体中的扩散性极强，柱外效应可以忽略溶质在液相中的传质速度慢，柱外效应不可忽视样品分析量分析量小，不宜用于大量制备样品容易回收，适于大量制备仪器技术成熟，价格低廉缺乏通用检测器，仪器比较复杂，价格昂贵2024/9/4液相色谱的分类2024/9/41、液固吸附色谱2024/9/42、液液分配色谱2024/9/4化学键合固定相类型

化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N正相液相色谱流动相极性小于固定相极性极性小的组分先流出，极性大的组分后流出固定相是改性硅胶、氰基柱流动性主要是正己烷等适用于分离极性化合物2024/9/4正相色谱分离条件正相色谱的流动相冲洗顺序：

正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇极性弱的组分先流出2024/9/4反相液相色谱流动相极性大于固定相极性极性大的组分先流出，极性小的后流出固定相是十八烷基键合硅胶（C18柱）流动相为：甲醇、乙腈、四氢呋喃等适合分离非极性、中等极性化合物2024/9/4反相色谱分离条件反相色谱的流动相冲洗顺序：H2O<甲醇<乙腈<丙醇<异丙醇<四氢呋喃

常用组成：甲醇-H2O，乙腈-H2O极性大疏水性小的先流出2024/9/4高速逆流色谱(HSCCC)2024/9/4HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。高速逆流色谱(HSCCC)2024/9/4为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。3、离子色谱法2024/9/4离子交换色谱固定相2024/9/4离子交换色谱流动相2024/9/4流动相常使用水缓冲溶液、甲醇、或乙醇同水缓冲溶液混合使用；缓冲溶液中钠、钾的柠檬酸盐，磷酸盐、碳酸盐等酸性缓冲液或碱性缓冲液4、凝胶色谱（又称排阻色谱）2024/9/42024/9/4凝胶色谱2024/9/45.亲和色谱法（AC）亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。2024/9/42024/9/4液相色谱分离类型的选择2024/9/42024/9/4二、高效液相色谱仪（HPLC）Waters的HPLC系统2024/9/42024/9/42024/9/4安捷伦的最新的HPLC2024/9/42024/9/4高压输液系统

输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性

。2024/9/4进样系统2024/9/4液相色谱柱

色谱柱是液相色谱实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱效能与柱的结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。2024/9/4常用分离柱2024/9/4

柱体为直型不锈钢管，见下图

柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。HPLC常用色谱柱2024/9/42024/9/4色谱柱化学材料与柱性能的关系色谱柱柱效的测定2024/9/4测定柱效的方法2024/9/4正确使用色谱柱(一)2024/9/4正确使用色谱（二）2024/9/4色谱柱的存放2024/9/4色谱柱的故障与异常2024/9/4检测器

HPLC检测器用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组分和含量变化的装置。2024/9/4常用的检测器紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器质谱检测器蒸发光散射检测器示差折光检测器选择性破坏性通用性紫外-可见检测器（UV）是最常用的检测器利用化合物的最大吸收波长进行检测从200nm到800nm波长范围进行连续扫描非破坏性，样品经检测后可回收2024/9/42024/9/4荧光检测器（Flourescence，FL）具有非常高的灵敏度和良好的选择性，检测浓度可达ng/ml只适于能产生荧光衍生物物质的检测是痕量分析理想的检测器信号依赖于检测条件，限制了FL的广泛使用2024/9/4电化学检测器(Electrochemicaldetector，ECD)基于化合物产生的电流或电压的变化，主要用于离子色谱法的检测；用于容易氧化合还原的有机化合物；灵敏度高，检测限量可达10-12g/ml；常用于酚类和芳香胺的测定，对溶剂纯度要求很高；电极表面可能发生吸附、催化反应，工作电极需常清洗，使用寿命不长。2024/9/4质谱检测器(Massspectrometrydetector,

MS)灵敏度、选择性、通用性豆很好，可以提供化合物的分子量和结构信息；仪器价格昂贵，对操作条件有一定的要求。2024/9/4蒸发光散射检测器样品经雾化器蒸发成为微粒气雾流，用强光照射，检测散射光适合无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测2024/9/4示差折光检测器(Refractiveindexdetector,RID)利用组分与流动相折光率的差异进行检测，为浓度性检测器；几乎对所有物质都有响应；可用分面积归一化法进行未知成分的定量分析；灵敏度不高，且不能用于梯度洗脱；使用于制备性HPLC。2024/9/4其他的检测器（较少使用）化学反应检测器放射性检测器旋光检测器小角激光散射检测器核磁共振检测器2024/9/4三、溶剂优化和梯度洗脱溶剂的选择——溶剂的纯度高——不能引起柱效损失或保留特性变化——对样品有适宜的溶解度——溶剂的粘度要低——必须与检测器匹配溶剂的处理——溶剂的纯化——溶剂的脱气——缓冲溶剂的处理2024/9/4溶剂优化2024/9/4溶剂优化2024/9/4溶剂优化2024/9/4梯度洗脱梯度洗脱的实质是通过不断的变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，是所有色谱带都以最佳平均的k值通过色谱柱，达到好的分离效果。等同于气相色谱中的程序升温，在液相色谱中，溶质的k值是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的。2024/9/4梯度洗脱

在HPLC分析时，流动相的组成在色谱运行过程中不断地变化，最常用的是二元溶剂系统。优点：—增加样品保留范围的宽度，满足0.5<k’<20的要求；—适用于大分子量的样品，如肽、蛋白、合成湖和物等；—可分离含强保留的成分，如中药成分的分析—可在柱上富集稀的样品。2024/9/4梯度洗脱缺点：

—对设备要求高，不同仪器的分离结构存在差异；—基线随着流动相组成的改变容易发生漂移；—对检测器有要求，有些检测器不能用于梯度洗脱；—梯度洗脱要求色谱系统两相能迅速达到平衡，有些柱-溶剂系统不宜使用梯度洗脱，如硅胶正相色谱法；2024/9/4梯度洗脱形式2024/9/42024/9/4流动相起始浓度对梯度洗脱分离的影响四、定性和定量分析定性分析利用标准品进行对照定性：

—利用保留特性

—利用不同柱比较

与其他方法结合定性：—利用化学反应定性—收集峰的流出物，进行IR、MS、NMR鉴别

—液-质联用仪

2024/9/4定性和定量分析定量分析峰面积归一化法：

与GC不同（GC检测器对各化合物的响应一致），HPLC检测器不是质量检测器，对各组分的灵敏度不同，需用校正因子校正

2024/9/4定性和定量分析外标法：样品与标准品在相同的条件下分别进行HPLC测定，计算峰面积比。2024/9/4定性和定量分析内标法：在被检测的样品中加入已知的标准品进行HPLC的测定，计算面积比

内标物的要求：

—在待测样品中不存在—与样品各组分完全分离—与待测物的保留时间相近—与待测物峰的大小相近—不与待测物中各组分发生化学反应—纯度高，贮存时稳定2024/9/4定性和定量分析内加法：加进已知量的待测物的纯物质，将混合物进行HPLC分离，该待测物增加的峰面积与加进的纯物质的量成正比。2024/9/4高效液相色谱的优缺点2024/9/4优点：1、检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高2、应用范围广，适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且多为有毒性

HPLC的应用

1.环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37～50m)

流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2.稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：C18流动相：20%甲醇-水～100%甲醇分离条件：线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2024/9/4讨论课（10月12日）目前，有不少地沟油流向市场，如果你是一名检测人员，应该怎样进行检测？要求：1）4～5人一组，10月12日，每组6～8min2）报告中包括检测的物质、实验流程、可靠性3）在10月11日晚上12点之前将ppt发到nanpeng@2024/9/4谢谢！第五章

吸收光谱一、光谱分析概述二、吸收光谱基本原理

三、紫外-可见光谱四、红外光谱一、光谱分析概述光谱分析主要为：原子光谱、分子光谱2024/9/4原子光谱：原子外层电子在不同能级间运动所产生线状光谱电子能级与振动、转动能级综合效应，产生带状光谱分子光谱：分子外层电子在不同能级间运动所产生2024/9/4吸收、发射与荧光光谱吸收光谱：原子或分子吸收特定波长的光后跃迁至更高能级，光强减弱。发射光谱：处于激发态的原子回到低能级，放出相应波长的光。荧光光谱：吸收光至激发态，又回到基态放出波长稍长的光。2024/9/4光谱分析分类原子光谱分子光谱

AAS

AES吸收其他发光紫外可见红外荧光磷光化学发光

AFS光的基本性质2024/9/4

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105可见光紫外光谱区（UV）：200~400nm可见光谱区（Vis）：400~760nm红外光谱区（IR）：2.5~25µm单色光、复合光、光的互补2024/9/4单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿物质的颜色与光的关系2024/9/4完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光二、吸收光谱的基本原理光是否被物质吸收，取决于

光子的能量

物质的结构2024/9/4

分子吸收光谱是由于分子中能级的跃迁产生的。在分子中有电子跃迁能级、振动能级和转动能级2024/9/42024/9/4物质对光的吸收物质对光的吸收满足Plank条件h

S2S1S0S3E2E0E1E3光吸收曲线吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。吸收曲线的特点：——不同的物质因其分析结构不同而具有不同的吸收曲线；——同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和λmax的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。——吸收曲线是吸光度法选择测量波长的依据。2024/9/42024/9/4Cr2O72-、MnO4-的吸收曲线300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance3502024/9/4苯和甲苯在环己烷中的吸收曲线苯(254nm)甲苯(262nm)A

230250270吸收光谱的性质：不同物质吸收光谱的形状以及

max不同——定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同——定量分析的基础2024/9/46004005000.1000.2000.3000.400光吸收基本定律:朗伯-比尔定律朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

当入射光的

,吸光物质的c

一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.2024/9/4比尔定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

当入射光的

,液层厚度b

一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c成正比.朗伯-比尔定律吸光度A：表征物质对光吸收程度的量

A=lgIi/I0=-lgT=bcA--吸光度

--摩尔吸光系数C--被测物浓度Ii--入射光强2024/9/4

T--透过率

b--液层厚度（光程长度）

I0--透射光强吸光度A、透射比T与浓度c的关系2024/9/4AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20

用标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为朗伯—比耳定律的偏离。

引起这种偏离的两大类因素：

——物理性因素

——化学性因素

2024/9/4偏离朗伯—比耳定律的原因工作曲线三、紫外-可见光谱2024/9/4（一）电子跃迁类型σ轨道电子：化合物中的单键电子π轨道电子：化合物中的双键电子n

轨道电子：杂原子上未成键的孤对电子2024/9/4各种跃迁所需要的能量：σ

σ*>nσ*≥π

π*>nπ*

（二）有机化合物紫外光谱结构解析2024/9/4

1.可获得的结构信息（1）200-400nm无吸收峰。饱和化合物，单烯。（2）

270-350nm有吸收峰，（ε=10-100）醛酮n→π*

跃迁产生的。（3）

250-300nm有中等强度的吸收峰（ε=200-2000），

芳环的特征吸收。（4）

200-250nm有强吸收峰（ε

104），表明含有一个共轭体系。2.光谱解析注意事项(1)确认

max，并算出㏒ε，初步估计属于何种吸收带；

(2)观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；(3)乙酰化位移2024/9/4B带：262nm(ε302)274nm(ε2040)261nm(ε300)(4)pH值的影响:加NaOH红移→酚类化合物，烯醇;加HCl兰移→苯胺类化合物。3.共轭烯吸收的计算值2024/9/4共轭醛、酮紫外吸收(K带)的计算2024/9/42024/9/44.立体结构顺式：λmax=280nm；εmax=10500反式：λmax=295.5nm；εmax=29000共平面产生最大共轭效应，εmax大5.互变异构：酮式：λmax=204nm；无共轭烯醇式：λmax=243nm2024/9/42024/9/42024/9/4示例：吸收波长计算2024/9/42024/9/4松香酸235～248nm左旋海松酸260～283nm紫外吸收光谱用来决定双键的位置，既简单又有效，例如：如：2024/9/4α-紫罗兰酮β-紫罗兰酮<2024/9/4四、红外光谱

以红外光波长（λ）或波长的倒数——波数（cm-1）为横坐标，用透光率（T）为纵坐标做图，就得到了红外吸收光谱（简称IR）。红外吸收光谱的波数范围为400～4000cm-1。作用应用：有机化合物的结构解析。定性：基团的特征吸收频率；定量：特征峰的强度；2024/9/4

分子吸收光谱是由于分子中能级的跃迁产生的。在分子中有:

电子能级振动能级

转动能级(一）吸收光谱的基本原理2024/9/4乙酸苯酯的红外光谱

4000350030002500200018001600140012001000800600

2.53456789101215

100500T（%）σ/cm-1Λ(μm)2024/9/4红外吸收峰产生的原因

分子中的一个化学键可有几种不同的振动形式，每种振动形式都可产生红外吸收峰。化学键的振动形式分为两大类——伸缩振动和弯曲振动。分子的振动能级（量子化）：

E振=（V+1/2）h

V：化学键的振动频率；

：振动量子数。2024/9/4伸缩振动（stretchingvibration）弯曲振动(bendingvibration)

2024/9/4

一个化合物在IR谱中吸收峰的数目取决于分子振动自由度。自由度是指描述有机分子中所有原子(n)在空间位置所需坐标总数(3n)。分子振动自由度是自由度减去分子平动自由度和分子转动自由度。

分子振动自由度非线性分子3n-6

线性分子3n-52024/9/4

对称伸缩νs=3652cm-1

不对称伸缩

νas=3756cm-1

面内弯曲δ=

1595cm-1例如：

H2O（非线形分子）分子振动自由度:3×3-6=32024/9/44000 3000 1500600水分子的红外光谱图不对称伸缩对称伸缩变形振动2024/9/4二氧化碳的IR光谱CO2（线形分子）分子振动自由度:3×3-5=4

O=C=OO=C=OO=C=OO=C=O

对称伸缩振动反对称伸缩振动面内弯曲振动

面外弯曲振动不产生吸收峰2349667667

因此O=C=O的IR光谱只有2349和667/cm二个吸收峰2024/9/42024/9/4红外光谱吸收峰的两大区域

4000～1330cm－1：特征谱带区，或称为官能团区（functionalgroupregion），官能团的特征吸收峰较多，是红外光谱分析的主要依据。1330～650cm-1：指纹区（fingerprintregion），单键的弯曲振动所产生的吸收峰，对分子结构的鉴定提供重要信息。2024/9/4红外光谱的分区4000-2500cm-1:X-H单键的伸缩振动区。2500-2000cm-1:为叁键和累积双键伸缩振动区2000-1500cm-1:为双键伸缩振动区1500-600cm-1:主要提供C-H弯曲振动的信息2024/9/4键化合物类型频率范围

cm-1-C-H=C-H=C-H

C-HC=CC

CC=CC-OC=OO-H

N-HC-NC

N-NO2烷烃烯烃芳香烃炔烃烯烃炔烃芳香烃醇，醚，羧酸，酯醛，酮，羧酸，酯游离醇，酚形成氢键的醇，酚羧酸胺胺腈硝基化合物2850-2960,1350-14703020-3080（m），675-10003000-3100（m），675-87033001640-1680(v)2100-2260(v)1500,1600(v)1080-13001690-17603610-3640(v)3200-3600(宽)2500-3000(宽)3300-3500（m）1180-13602210-2260(v)1515-1560,1345-13852024/9/4红外吸收峰的强度

红外光谱中吸收峰的强度主要取决于化合物的吸收特征。如果化合物的分子在吸收红外光后的振动过程中引起偶极矩的变化越大，则吸收峰越强。例如，由电负性相差较大的原子构成的C=O、C=N、C-N、C-O等，振动时引起偶极矩的变化较大，红外吸收峰一般都很强，而C—C、C—H的吸收峰较弱。另外，吸收峰也随跃迁几率的增加而增强，所以样品的浓度增大，吸收峰也会增强。2024/9/4红外光谱的吸收强度

2024/9/4红外吸收强度及其表示符号

摩尔消光系数（ε）强度符号＞200很强VS75~200强S25~75中等M5~25弱W0~5很弱VW2024/9/4（二）各类化合物的红外光谱图1.烃类化合物2.含氧化合物3.胺类化合物2024/9/4

烯烃的n（C=C）吸收峰；1640～1680cm-1；

炔烃的n（C≡C）吸收峰：2100～2200cm-1；

取代烯烃或炔烃相当对称时，n（C=C）或n（C≡C）不会引起偶极矩的变化，而无吸收峰

烷烃中n（Csp3-H）在2800～3000cm-1；

烯烃的n（Csp2-H）在3000～3100cm-1；

炔烃的n（Csp-H）在3300cm-1

。

1.

烃类化合物2024/9/41-庚烯红外光谱

2.5345678910121540003500300025002000