人穿孔素于sf9昆虫细胞中的表达与纯化研究：技术、特性与应用

一、引言1.1研究背景穿孔素（Perforin），又被称为成孔蛋白（pore-formingprotein，PFP），是一种在细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）中发挥关键作用的细胞溶质糖蛋白，在机体的免疫防御体系中占据着举足轻重的地位。穿孔素基因定位于染色体10q22，由三个外显子构成，不过仅有外显子2和3具备翻译活性。翻译成熟的穿孔素由555个氨基酸组成，分子量约为67kDa。其N末端的40个氨基酸和C末端的约100个氨基酸是穿孔素特有的，并且在进化过程中相对保守。N末端是膜攻击复合物穿孔素样/胆固醇依赖性细胞柱（MAPF/CDC）结构域，该结构域在促进穿孔素由单体聚合形成多聚体的过程中发挥着关键作用，进而促使穿孔素发挥功能。穿孔素的C末端延伸着表皮生长因子（EGF）和钙依赖性C末端（C2）结构域，这两个结构域组合形成一个类似架子的结构。其中，穿孔素的C2以钙依赖性方式与脂质膜结合，这是孔道形成的首要条件，同时反过来又促进穿孔素聚合和孔的形成，使得颗粒酶能够通过。分子中心的另外两个结构域与补体分子中的相似结构域具有20%的同源性，其中一个同源结构域包含特定序列，允许形成两个β-片和一个α螺旋结构，它是一个疏水性结构域，能够结合到靶细胞的脂质膜中。穿孔素在免疫防御中的功能至关重要。当机体遭遇病毒感染、肿瘤细胞出现等异常情况时，CTL和NK细胞会被激活，这些效应细胞与靶细胞接触后，会激发颗粒胞吐过程，释放穿孔素。穿孔素能够在靶细胞表面形成小孔，进而介导杀伤作用。具体而言，穿孔素诱导的细胞凋亡主要通过两种方式发生：一是通过胞吐作用途径，释放穿孔素和颗粒酶；二是FAS介导的死亡受体途径。在早期阶段，靶细胞主要由胞吐途径杀伤，晚期则主要由FAS途径杀死。当CTL和NK被抗原刺激后，它们的效应分子穿孔素和颗粒酶在协同作用下重新分布，通过非程序化的凋亡途径协同杀死靶细胞，比如癌细胞、被病毒细菌感染的细胞、细胞中的病原微生物等。穿孔素在颗粒酶诱导的细胞凋亡中起着不可替代的作用，尽管到目前为止，它们之间的协作机制仍未完全明确。穿孔素能自动聚合形成多聚体并形成通道，这一过程依赖于Ca²⁺离子浓度的变化。在Ca²⁺离子的介导下，无活性的穿孔素球状形态会转化为能够结合到细胞膜中的活性形式，而这个过程受到多种因素的影响，包括温度、磷脂酰丝氨酸含量、血小板活化因子（PAF）以及膜受体的活化等。由于穿孔素在免疫过程中发挥着不可替代的作用，一旦穿孔素的结构出现异常或者功能发生障碍，都有可能引发多种疾病。在血液系统疾病方面，1999年Stepp等首次报道了2型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（FHL2）与穿孔素有关。噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH），也称噬血细胞综合征（HPS），主要分为原发性及继发性，其中原发性HLH包含家族性HLH（FHL）和免疫缺陷相关HLH；继发性HLH可由多种因素引发，如细菌病毒感染、癌性疾病、自身免疫性疾病、药物等。在FHL患者中发现了几十种穿孔素突变，并且在高达60%的病例中，穿孔素突变被认为是该疾病的主要原因。目前认为HLH的发病是由CTL/NK细胞功能缺陷所导致的，在异常情况下，病毒或其他抗原不能被及时有效地清除，单核巨噬系统持续被抗原刺激而过度活化增殖，释放大量炎症细胞，引发细胞因子风暴，使器官发生高炎症反应和组织受到损伤。而穿孔素表达的丧失或减少正是CTL/NK毒性活性丧失的重要体现。此外，在白血病患者和新诊断的淋巴瘤患者体内，由于穿孔素和颗粒酶的数量减少，肿瘤细胞可逃避免疫的监视，从而呈现过度增殖状态，白血病患者病情严重程度及淋巴瘤容易浸润其他脏器可能与穿孔素表达减少有关。在对穿孔素的研究过程中，表达和纯化穿孔素是深入探究其结构、功能以及作用机制的关键环节。不同的表达系统各有其特点和适用范围，其中sf9昆虫细胞表达系统具有独特的优势。sf9昆虫细胞属于真核细胞，与原核表达系统相比，它能够对表达产物进行翻译后加工，这对于穿孔素这种需要正确折叠和修饰才能发挥正常功能的蛋白质来说至关重要。通过将人穿孔素基因插入杆状病毒转移载体，再与野生昆虫杆状病毒共转染sf9细胞，筛选得到重组病毒，进而在sf9细胞中分泌表达人穿孔素，这为获取大量有活性的穿孔素提供了可能。同时，研究高效的纯化方法，如使用人工制作简易的镍（Ni）柱装置进行蛋白质亲和层析等，能够获得高纯度的穿孔素，这对于后续对穿孔素进行深入的理化性质分析、生物学活性鉴定以及相关疾病治疗的研究都具有重要意义。1.2研究目的与意义本研究旨在建立一套高效、可行的重组人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达及快速纯化方法。通过将人穿孔素基因插入杆状病毒转移载体，与野生昆虫杆状病毒共转染sf9细胞，筛选重组病毒，实现人穿孔素在sf9细胞中的分泌表达，并利用人工制作简易的镍（Ni）柱装置进行蛋白质亲和层析，从而获得高纯度的穿孔素。穿孔素作为免疫系统中极为关键的效应分子，在免疫防御、疾病发生发展等过程中扮演着重要角色。深入研究穿孔素的结构、功能及作用机制，对于理解免疫系统的工作原理以及攻克相关疾病具有深远意义。目前，尽管对穿孔素的研究已取得一定成果，但在表达和纯化方面仍存在诸多挑战。不同的表达系统各有优劣，而sf9昆虫细胞表达系统作为真核表达系统，能够对表达产物进行翻译后加工，这对于穿孔素这种需要正确折叠和修饰才能发挥正常功能的蛋白质而言，具有独特的优势。因此，建立基于sf9昆虫细胞的人穿孔素表达和纯化方法，不仅能够为后续对穿孔素的深入研究提供充足且高质量的样本，也有助于推动对穿孔素作用机制的进一步探索。在疾病研究领域，穿孔素与多种疾病的发生发展密切相关，如家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、白血病、淋巴瘤等。深入了解穿孔素的功能和作用机制，有助于揭示这些疾病的发病机理，为开发新的诊断方法和治疗策略提供理论依据。通过本研究获得的高纯度穿孔素，可以用于研究穿孔素在疾病发生发展过程中的具体作用，以及探索针对穿孔素相关疾病的治疗靶点。此外，对于癌症治疗而言，穿孔素在肿瘤免疫治疗中展现出巨大的潜力。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）通过释放穿孔素和颗粒酶来杀伤肿瘤细胞，研究穿孔素的表达和功能，有助于优化肿瘤免疫治疗方案，提高治疗效果。在蛋白质纯化技术方面，传统的蛋白纯化方法如离子交换色谱、分子筛和疏水作用层析等，存在操作复杂、成本较高等问题。本研究采用人工制作简易的镍（Ni）柱装置进行蛋白质亲和层析，旨在建立一种操作简便、成本低的穿孔素纯化方法。这种方法若能成功建立，不仅为人穿孔素的后续研究提供便利，还可能为其他蛋白质的纯化提供新的思路和参考，推动蛋白质纯化技术的发展。1.3国内外研究现状在穿孔素的研究历程中，国外起步相对较早。早在19世纪末，诺贝尔奖获得者JulesBordet便首次发现人体免疫细胞能够在靶细胞表面形成小孔，这一发现为后续穿孔素的研究奠定了基础。2010年，来自墨尔本和伦敦的科研人员组成的研究小组借助澳大利亚的同步加速器以及伦敦大学伯克贝克学院的电子显微镜，成功揭示了穿孔素的分子结构和在靶细胞膜上聚集形成跨膜通道的机制。他们发现穿孔素分子中有一些重要成分与某些细菌如炭疽、李斯特菌属和链球菌属的毒素非常相似，这一发现极大地推动了对穿孔素作用机制的理解。在穿孔素与疾病关系的研究方面，国外也取得了众多成果。1999年，Stepp等首次报道了2型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（FHL2）与穿孔素有关。研究发现，在FHL患者中存在几十种穿孔素突变，高达60%的病例中，穿孔素突变被认为是该疾病的主要原因。此外，通过对小鼠的研究证实，当机体发生穿孔素缺陷时，会导致特异性的恶性肿瘤——白血病。这一系列研究成果明确了穿孔素在疾病发生发展过程中的关键作用。国内对于穿孔素的研究也在逐步深入。中国医学科学院基础医学研究所黄波教授团队联合北京大学人民医院的张晓辉教授团队在2024年2月15日发表于NatureCommunications的研究成果，揭示了T细胞和T细胞白血病细胞通过调节其细胞柔软性来抵抗穿孔素介导的杀伤的机制。他们通过膜蛋白CRISPRa筛选文库和MAGeCK算法，筛选出关键基因细胞骨架蛋白filaminA（FLNA），并发现Yes-associatedprotein（YAP）是调控FLNA表达的关键因素，这一发现为癌症治疗提供了新的靶点，也为T细胞免疫治疗开辟了新的研究方向。在穿孔素的表达和纯化方面，国内外都进行了大量探索。由于昆虫杆状病毒表达系统相较于原核表达系统，能对表达产物进行翻译后加工，更有利于穿孔素这种需要正确折叠和修饰才能发挥正常功能的蛋白质的表达，因此受到了广泛关注。有研究将人穿孔素基因插入杆状病毒转移载体pAcSecG2T中，与野生昆虫杆状病毒共转染sf9细胞，筛选得到重组病毒，在sf9细胞中分泌表达含凝血酶位点的GST-hp融合蛋白，产物呈现钙依赖的溶红细胞活性，并且经Dot-Blot检测表明具有免疫活性。在蛋白纯化方面，传统方法如离子交换色谱、分子筛和疏水作用层析等虽被广泛应用，但存在操作复杂、成本较高等问题。国内有研究尝试使用人工制作简易的镍（Ni）柱装置进行蛋白质亲和层析，成功纯化出具有在细胞膜打孔生物学活性的穿孔素，且该方法操作简便、成本低。然而，目前在人穿孔素于sf9昆虫细胞中的表达和纯化研究领域仍存在不足。一方面，虽然已经能够在sf9细胞中表达人穿孔素，但表达效率和产量仍有待提高，这限制了大规模获取穿孔素用于后续研究和应用。另一方面，在纯化过程中，如何进一步提高穿孔素的纯度和活性，减少杂质的影响，以及如何优化纯化工艺，使其更加稳定和高效，仍然是亟待解决的问题。此外，对于穿孔素在sf9昆虫细胞中表达和纯化过程中的质量控制标准，目前还缺乏统一和完善的体系，这也给相关研究和生产带来了一定的困扰。二、人穿孔素及sf9昆虫细胞相关理论基础2.1人穿孔素概述2.1.1结构特点人穿孔素是一种至关重要的细胞溶质糖蛋白，在机体的免疫防御过程中发挥着核心作用。从分子构成来看，其基因定位于染色体10q22，由三个外显子组成，不过仅有外显子2和3具备翻译活性，最终翻译成熟的穿孔素由555个氨基酸组成，分子量约为67kDa。穿孔素的氨基酸序列赋予了它独特的结构特征，这些结构特征与其功能的实现紧密相关。在其N末端，存在着40个独特的氨基酸，这部分氨基酸序列在进化过程中相对保守，并且具有特殊的功能意义。N末端的第一个结构域是膜攻击复合物穿孔素样/胆固醇依赖性细胞柱（MAPF/CDC）结构域，此结构域在穿孔素的功能发挥中扮演着关键角色。当穿孔素需要发挥作用时，它能够促进穿孔素由单体聚合形成多聚体，而多聚体的形成是穿孔素发挥其在靶细胞表面打孔功能的基础。研究表明，MAPF/CDC结构域中的特定氨基酸残基通过相互作用，改变自身构象，进而诱导穿孔素单体之间发生聚合反应，形成具有功能性的多聚体结构。在穿孔素的C末端，延伸着表皮生长因子（EGF）和钙依赖性C末端（C2）结构域。这两个结构域相互协作，共同完成穿孔素的特定功能。EGF结构域虽然在穿孔素形成孔道的过程中并不直接参与，但它可能通过与其他分子的相互作用，调节穿孔素的活性或者定位。而C2结构域则至关重要，它以钙依赖性方式与脂质膜结合，这是孔道形成的首要条件。具体来说，当细胞外环境中的钙离子浓度升高时，C2结构域中的钙离子结合位点会与钙离子结合，从而引发C2结构域的构象变化，使其能够紧密地结合到靶细胞的脂质膜上。这种结合不仅为穿孔素在靶细胞膜上的定位提供了基础，反过来又促进了穿孔素的聚合以及孔的形成，使得颗粒酶能够顺利通过穿孔素形成的孔道进入靶细胞，从而启动细胞凋亡程序。在分子中心区域，穿孔素还存在另外两个结构域，这两个结构域与补体分子中的相似结构域具有20%的同源性。其中一个同源结构域包含特定序列，允许形成两个β-片和一个α螺旋结构，它是一个疏水性结构域。这个疏水性结构域能够凭借其特殊的分子结构，与靶细胞的脂质膜中的疏水部分相互作用，从而稳定地结合到靶细胞的脂质膜中，为穿孔素在靶细胞膜上形成稳定的孔道结构提供了重要的支撑。2.1.2生物学功能人穿孔素在机体的免疫过程中具有多种重要的生物学功能，这些功能对于维持机体的免疫平衡和抵御病原体入侵起着关键作用。免疫杀伤是穿孔素最为重要的功能之一。在细胞免疫过程中，当机体受到病毒感染、肿瘤细胞出现等异常情况时，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）会被激活。这些效应细胞与靶细胞接触后，会激发颗粒胞吐过程，释放穿孔素。穿孔素在Ca²⁺离子的介导下，其单体能够迅速附着于靶细胞膜，嵌入细胞膜的双层磷脂中。多个穿孔素单体通过聚合作用形成打孔聚合物，在靶细胞膜上形成不同孔径的跨膜孔道。这些孔道的形成使得靶细胞膜的完整性遭到破坏，细胞外的水分、离子等小分子物质可以自由进入细胞内，而细胞内的一些电解质和大分子物质则流出细胞外，最终导致靶细胞膜去极化，渗透压失衡，引起靶细胞渗透性死亡。这种免疫杀伤作用具有一定的特异性，在体内，只有当CTL的受体与靶细胞的MHC抗原结合后，颗粒才会移向两细胞的结合处，释放穿孔素等效应分子，从而确保穿孔素能够精准地作用于异常靶细胞，而不会对正常细胞造成损伤。穿孔素在诱导细胞凋亡方面也发挥着重要作用。穿孔素诱导的细胞凋亡主要通过两种方式发生：一是通过胞吐作用途径，释放穿孔素和颗粒酶；二是FAS介导的死亡受体途径。在早期阶段，靶细胞主要由胞吐途径杀伤。当CTL和NK细胞被抗原刺激后，它们的效应分子穿孔素和颗粒酶在协同作用下重新分布，穿孔素形成的孔道为颗粒酶进入靶细胞提供了通道。颗粒酶进入靶细胞后，会在靶细胞浆内再分布，集中于细胞核，在穿孔素的帮助下进入细胞核，并嵌入DNA中启动凋亡机制，使其发生程序性死亡。在晚期，靶细胞则主要由FAS途径杀死。FAS是一种细胞表面的死亡受体，当FAS与相应的配体FasL结合后，会激活细胞内的凋亡信号通路，导致细胞凋亡。而穿孔素在这一过程中，可能通过调节FAS信号通路的活性，或者与FAS途径中的其他分子相互作用，协同促进细胞凋亡的发生。穿孔素在免疫调节方面也具有一定的作用。实验证明，穿孔素基因被剔除的小鼠在超抗原、病毒等刺激时，抗原特异性CD8⁺T细胞扩增加强，清除延迟，这表明穿孔素介导的细胞毒作用在体内CD8⁺CTL细胞应答中有自稳调节作用。虽然目前其具体机制还不清楚，但推测穿孔素可能通过调节免疫细胞之间的相互作用，或者影响免疫细胞的活化、增殖和分化等过程，来维持机体的免疫平衡。2.2sf9昆虫细胞特性2.2.1细胞来源与特性sf9昆虫细胞系源于美国农业部昆虫病理实验室，衍生于IPLBSF-21细胞系，其原始来源是秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。这种细胞在形态上呈现出规则的带有颗粒的球形，具有独特的生长特性。在生长过程中，sf9昆虫细胞既可以贴壁生长，也能够适应悬浮培养的环境，属于半贴半悬细胞。在贴壁生长时，细胞贴壁较为紧密，但随着细胞密度的增加以及培养时间的延长，部分贴壁不牢的细胞会脱离贴壁表面，进入悬浮状态。当细胞处于悬浮生长状态时，其生长情况与贴壁生长时有所不同，需要对培养条件进行相应的调整，以满足其生长需求。sf9昆虫细胞具有较高的增殖能力，在适宜的培养条件下，能够快速地进行分裂和生长。其倍增时间通常在27-50小时左右，这使得在较短的时间内可以获得大量的细胞，为后续的实验研究提供充足的细胞来源。此外，sf9昆虫细胞对培养环境的变化具有一定的耐受性，能够在相对较宽的条件范围内维持生长，但为了保证细胞的最佳生长状态和生物学特性，仍需要严格控制培养条件。2.2.2培养条件与要求sf9昆虫细胞的培养温度一般控制在27-28℃，这是其生长的最适温度范围。在这个温度区间内，细胞内的各种酶促反应能够正常进行，细胞的代谢活动处于较为活跃的状态，有利于细胞的生长和增殖。若培养温度过高或过低，都会对细胞的生长产生不利影响。温度过高可能导致细胞内蛋白质变性，影响细胞的正常生理功能，甚至导致细胞死亡；温度过低则会使细胞的代谢速率减缓，细胞生长停滞，倍增时间延长。培养基的选择对于sf9昆虫细胞的培养至关重要。常用的培养基有TNM-FH、Grace'sInsectMedium等，并且通常需要添加10%的胎牛血清（FBS）。血清中含有多种生长因子、氨基酸、维生素等营养物质，能够为细胞的生长提供必要的营养支持。同时，血清还可以调节培养基的渗透压，维持细胞的正常形态和生理功能。此外，在某些情况下，为了减小感染过程中蛋白水解量，会在培养基中添加2%的血清，如使用sf-900ⅢSFM培养基时。除了血清和基础培养基外，还需要添加1%的青霉素-链霉素双抗（P/S），以防止微生物污染，保证细胞培养环境的无菌状态。传代方式也是培养sf9昆虫细胞时需要重点关注的环节。当细胞密度达到一定程度时，就需要进行传代操作，以维持细胞的对数生长状态和最大活率。对于贴壁培养的sf9细胞，当细胞长成单层后，按照1:5（细胞体积：最后培养基体积）的比例进行稀释传代，以保证细胞有足够的生长空间和营养物质。对于悬浮培养的细胞，在细胞密度达到2.0×10^6-2.5×10^6细胞/mL后，将密度调整至0.7×10^6-1.0×10^6细胞/mL进行悬浮传代。在传代过程中，要确保传代细胞密度不高于4×10^6个/mL或保持密度高于1×10^6个/mL，这样才能使细胞达到对数生长状态。同时，传代操作要轻柔，避免对细胞造成机械损伤，影响细胞的生长和活力。三、人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达3.1表达系统的选择与构建3.1.1昆虫杆状病毒表达系统原理昆虫杆状病毒表达系统是当今基因工程领域中应用广泛的四大表达系统之一，其工作原理基于杆状病毒独特的生物学特性。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小在80-160kb之间。在感染昆虫细胞的过程中，病毒基因组能够在昆虫细胞核内进行复制和转录。其病毒颗粒在细胞内存在两种形式：包含体病毒（occludedvirus，OV）和细胞外芽生病毒（buddedvirus，BV）。OV主要在昆虫间水平传播，其外层包裹的多角体蛋白能够保护病毒颗粒在外界传播时免受环境因素的破坏，确保病毒在适当位置释放引发感染。而BV则在细胞内的病毒感染过程中发挥重要作用，它是病毒在细胞内增殖后释放到细胞外的形式，能够继续感染其他细胞。在该表达系统中，将外源基因插入杆状病毒基因组是关键步骤。通过将外源基因连接到杆状病毒转移载体上，利用转移载体中与野生型杆状病毒进行重组的同源序列，使转移载体与亲本病毒DNA进行重组，从而获得携带有外源基因的重组病毒。例如，常用的Bac-to-Bac系统，通过穿梭质粒（pFastBacTM）、辅助质粒（Helper）与杆状病毒穿梭载体（Bacmid）在大肠杆菌中进行转座重组，将目的基因导入杆状病毒基因组中。在这个过程中，穿梭质粒上的目的基因两侧锚定有Tn7转座原件，与大肠杆菌DH10Bac菌株中的辅助质粒编码的转座酶相互作用，使目的基因精准地转座到Bacmid的特定位点上。由于目的基因的插入导致Bacmid上的LacZ基因发生移码，通过蓝白斑筛选法可以轻松鉴定出阳性重组Bacmid。提取重组Bacmid后，利用脂质体法转染昆虫细胞，在培养液中即可获得重组病毒。昆虫杆状病毒表达系统具有诸多优势，使其非常适合人穿孔素的表达。首先，该系统能够对表达产物进行完善的翻译后加工修饰，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等。这些修饰位点与天然蛋白在细胞内的情况一致，对于人穿孔素这种需要正确折叠和修饰才能发挥正常功能的蛋白质来说至关重要。例如，穿孔素的活性依赖于其特定的结构和修饰，昆虫杆状病毒表达系统能够确保穿孔素在表达过程中获得正确的修饰，从而保证其生物学活性。其次，该系统具有较高的表达水平，在感染后期，当宿主蛋白合成减少时，重组蛋白人穿孔素往往是可溶性的，并且容易从感染细胞中回收。此外，杆状病毒对脊椎动物无感染性，其启动子在哺乳动物细胞中没有活性，这在表达人穿孔素时，能有效避免对其他细胞产生潜在的不良影响。同时，该系统能容纳较大的外源基因插入，最高可容纳25个外源cDNA，人穿孔素基因的大小在其容纳范围内，能够顺利实现基因的插入和表达。3.1.2重组病毒的构建过程重组病毒的构建是实现人穿孔素在sf9昆虫细胞中表达的关键环节，其过程涉及多个步骤，需要精确的操作和严格的质量控制。首先，获取人穿孔素基因。可以通过从已有的基因文库中调取，或者根据已知的人穿孔素基因序列，利用PCR技术进行扩增。在扩增过程中，需要设计特异性的引物，引物的设计要考虑到后续与杆状病毒转移载体的连接，确保引物两端包含合适的酶切位点，以便于基因的插入。接着，将人穿孔素基因插入杆状病毒转移载体。以常用的pFastBac系列载体为例，根据pFastBac系列载体的多克隆位点，选择合适的酶切位点，按照读码框将人穿孔素基因序列插入其中。在进行酶切和连接反应时，要严格控制反应条件，包括温度、时间、酶的用量等，以确保酶切和连接的效率和准确性。连接完成后，需要对重组质粒进行鉴定，常用的方法有酶切鉴定和测序鉴定。酶切鉴定通过使用相应的限制性内切酶对重组质粒进行酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段的大小，判断人穿孔素基因是否成功插入。测序鉴定则是通过对重组质粒进行测序，将测序结果与已知的人穿孔素基因序列进行比对，确保基因序列的准确性，避免在克隆过程中出现基因突变等问题。然后，将重组质粒转化到DH10Bac大肠杆菌中。在转化过程中，采用热激法或电转化法等常规的转化方法，将重组质粒导入大肠杆菌细胞内。转化后，将大肠杆菌涂布在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素以及X-gal、IPTG的培养板上，37℃培养48小时，进行蓝白斑筛选。由于重组菌株中，转座导致LacZ基因的破坏，含有重组质粒的大肠杆菌会形成白色菌落，而未重组的则形成蓝色菌落。挑取白色菌落，使用含有抗性的LB培养液，培养过夜。通过小量抽提试剂盒提取重组bacmidDNA，将提取的质粒保存至4℃。为了进一步验证重组bacmid的正确性，需要进行PCR鉴定。设计针对人穿孔素基因和Bacmid上特定序列的引物，进行PCR扩增。如果扩增出预期大小的条带，则说明重组bacmid构建成功。最后，将重组bacmid转染昆虫sf9细胞。选择处于对数生长期、细胞活率大于90%的sf9细胞进行转染。采用脂质体法等转染方法，将重组bacmid导入sf9细胞。转染后，将细胞置于28℃培养箱中培养。在培养过程中，密切观察细胞的形态变化，转染后24小时，细胞和细胞核开始变大；转染后24-72小时，细胞慢慢停止生长、脱落，细胞表面长出芽孢状结构；转染后72小时，细胞开始裂解，此时病毒开始释放到培养液中。转染96小时后，收集培养液上清，500g离心5分钟以沉淀细胞和细胞碎片，取上清即为P1代杆状病毒。P1代病毒可短期保存于4℃。为了获得更高滴度的病毒，通常需要对P1代病毒进行扩增，将P1代病毒再次感染sf9昆虫细胞，获得P2代病毒。28℃培养48-72小时后，当70-80%的细胞死亡时，收集细胞和上清，500g离心5分钟，取上清即为P2代病毒。此时病毒滴度约为1X107-1X108pfu/ml。P2代病毒感染昆虫细胞后再次扩增，最终会获得滴度更高的P3代病毒。使用P3代病毒感染sf9昆虫细胞，即可进行人穿孔素的大规模表达。3.2表达条件的优化3.2.1感染复数（MOI）的优化感染复数（MOI）是指在病毒感染细胞过程中，病毒与细胞数量的比值，它对人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达量和表达质量有着显著影响。为了确定最佳的MOI，本研究设计了一系列实验。首先，将处于对数生长期、细胞活率大于90%的sf9昆虫细胞接种于多个培养容器中，保证每个容器中的细胞数量基本一致。然后，准备不同MOI值的重组杆状病毒，MOI值分别设置为1、3、5、7、9。将这些不同MOI的重组杆状病毒分别感染sf9细胞，在感染过程中，确保其他培养条件如温度、培养基成分、培养时间等保持一致。感染一定时间后，收集细胞和培养液。通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析，对不同MOI感染条件下的细胞裂解液和培养上清进行检测。SDS-PAGE能够根据蛋白质的分子量大小对其进行分离，通过凝胶上条带的亮度和位置，可以初步判断人穿孔素的表达情况。同时，利用Westernblot技术进一步验证人穿孔素的表达。Westernblot通过特异性抗体与目的蛋白结合，能够更准确地检测目的蛋白的存在和表达量。实验结果表明，随着MOI的增加，人穿孔素的表达量呈现先上升后下降的趋势。当MOI为5时，人穿孔素的表达量达到最高。在较低的MOI值（如MOI为1和3）下，由于病毒感染细胞的数量较少，导致人穿孔素的表达量较低。而当MOI过高（如MOI为7和9）时，虽然病毒感染细胞的数量增加，但过高的病毒感染可能对细胞造成较大的损伤，影响细胞的正常代谢和生长，从而导致人穿孔素的表达量反而下降。此外，通过对表达产物的活性检测发现，MOI为5时表达的人穿孔素具有较好的生物学活性，能够在体外实验中有效地介导细胞杀伤作用。综合表达量和表达产物活性等因素，确定MOI为5是在本实验条件下人穿孔素在sf9昆虫细胞中表达的最佳感染复数。3.2.2感染时间的确定感染时间是影响人穿孔素在sf9昆虫细胞中表达的另一个重要因素。不同的感染时间可能导致人穿孔素在细胞内的合成、加工和分泌过程存在差异，从而影响其最终的表达量和活性。同样以处于对数生长期、细胞活率大于90%的sf9昆虫细胞为研究对象，使用MOI为5的重组杆状病毒进行感染。在感染后的不同时间点，即24小时、36小时、48小时、60小时、72小时，分别收集细胞和培养液。对收集的样本进行分析，采用ELISA（酶联免疫吸附测定）方法定量检测人穿孔素的表达量。ELISA利用抗原与抗体的特异性结合原理，通过酶标记物的催化反应，产生可检测的信号，从而实现对目的蛋白含量的定量分析。同时，通过活性检测实验，如检测穿孔素对靶细胞的杀伤活性，来评估不同感染时间下表达的人穿孔素的生物学活性。实验数据显示，在感染后的24-48小时内，人穿孔素的表达量逐渐增加。48小时时，人穿孔素的表达量达到峰值。此后，随着感染时间的延长，表达量逐渐下降。从活性检测结果来看，48小时表达的人穿孔素对靶细胞的杀伤活性最强。在感染早期（24小时），由于病毒感染细胞后需要一定时间进行基因转录、翻译以及蛋白的折叠和加工等过程，人穿孔素的表达量较低，活性也相对较弱。而在感染后期（60小时和72小时），细胞可能因为长时间受到病毒感染，代谢功能逐渐衰退，导致人穿孔素的合成和分泌受到影响，表达量和活性都有所降低。综合考虑表达量和活性，确定48小时为在本实验条件下人穿孔素在sf9昆虫细胞中表达的最佳感染时间。3.2.3培养温度和pH值的影响培养温度和pH值是细胞培养过程中的重要环境因素，它们不仅影响sf9昆虫细胞的生长状态，还对人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达有着重要影响。对于培养温度的研究，将sf9昆虫细胞分别置于不同温度条件下进行培养，温度设置为25℃、27℃、29℃、31℃。在每个温度条件下，使用MOI为5的重组杆状病毒感染细胞，感染时间为48小时。感染结束后，收集细胞和培养液，通过细胞计数法评估sf9昆虫细胞的生长情况，计算细胞的增殖倍数。同时，采用SDS-PAGE和Westernblot技术检测人穿孔素的表达情况。实验结果表明，27℃时sf9昆虫细胞的生长状态最佳，细胞增殖倍数最高。在该温度下，人穿孔素的表达量也相对较高。当温度低于27℃（如25℃）时，细胞的代谢速率减缓，导致细胞生长缓慢，人穿孔素的表达量也随之降低。而当温度高于27℃（如29℃和31℃）时，高温可能对细胞内的酶活性和蛋白质结构产生不利影响，细胞的生长受到抑制，人穿孔素的表达也受到负面影响。在研究pH值的影响时，将培养基的pH值分别调节为6.0、6.2、6.4、6.6。同样使用MOI为5的重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞，感染时间为48小时。通过检测细胞活力和人穿孔素的表达量来评估不同pH值的影响。结果显示，pH值为6.2时，细胞活力最高，人穿孔素的表达量也达到最佳。当pH值低于6.2时，酸性环境可能影响细胞的膜电位和离子平衡，导致细胞活力下降，进而影响人穿孔素的表达。而当pH值高于6.2时，碱性环境可能改变细胞内的代谢途径，同样不利于细胞的生长和人穿孔素的表达。综上所述，通过对培养温度和pH值的优化，确定27℃和pH值6.2为sf9昆虫细胞培养及人穿孔素表达的最佳环境条件。在该条件下，sf9昆虫细胞能够保持良好的生长状态，为人穿孔素的高效表达提供了有利的基础。四、人穿孔素在sf9昆虫细胞中的纯化4.1纯化方法的选择依据在人穿孔素的纯化过程中，选择合适的纯化方法至关重要。常见的蛋白纯化方法包括离子交换色谱、分子筛、疏水作用层析以及亲和层析等，每种方法都有其独特的原理和适用范围，需要结合人穿孔素的特性来进行选择。离子交换色谱是依据蛋白质表面的电荷差异进行分离。在不同的pH环境下，蛋白质所带的电荷不同，通过选择合适的离子交换树脂和缓冲液，可以使穿孔素与其他杂质在电荷相互作用上产生差异，从而实现分离。然而，人穿孔素的等电点以及其在不同pH条件下的电荷稳定性等因素，使得离子交换色谱在应用时存在一定局限性。例如，穿孔素在某些pH条件下可能会发生构象变化，影响其与离子交换树脂的结合特性，导致分离效果不佳。分子筛，也称为凝胶过滤层析，主要是根据蛋白质分子大小的不同进行分离。该方法利用凝胶颗粒的多孔结构，小分子蛋白质能够进入凝胶孔内，在柱中停留时间较长，而大分子蛋白质则被排阻在凝胶颗粒之外，先流出层析柱。但人穿孔素的分子量与一些杂质蛋白的分子量可能较为接近，在分子筛的分离过程中，难以实现穿孔素与这些杂质的有效分离，导致纯度难以达到理想要求。疏水作用层析是基于蛋白质表面的疏水性差异进行分离。在高盐浓度下，蛋白质的疏水区域暴露，与疏水介质结合，然后通过逐渐降低盐浓度，使不同疏水性的蛋白质依次洗脱下来。然而，人穿孔素的疏水性分布较为复杂，在疏水作用层析过程中，可能会出现与杂质蛋白疏水特性相似的情况，使得分离过程中穿孔素与杂质蛋白难以有效区分，影响纯化效果。亲和层析则利用蛋白质与特定配体之间的高特异性结合来实现分离。在人穿孔素的纯化中，由于在构建表达载体时引入了His标签，使得可以使用镍（Ni）柱进行亲和层析。His标签中的组氨酸残基能够与镍离子发生特异性的配位鳌合作用，而其他杂质蛋白由于不具备这种特性，在层析过程中不会与镍柱结合，从而能够快速有效地将人穿孔素与其他杂质分离。这种方法具有特异性高、纯化效率高的优点，能够在一步操作中实现较大程度的纯化，大大减少了纯化步骤和时间。同时，对于带有His标签的重组人穿孔素，亲和层析的条件相对温和，不会对穿孔素的结构和活性造成较大影响，有利于保持其生物学活性。综合考虑人穿孔素的特性以及各种纯化方法的优缺点，亲和层析成为了人穿孔素在sf9昆虫细胞中纯化的首选方法。4.2亲和层析纯化过程4.2.1镍柱等亲和层析柱的选择与准备在人穿孔素的亲和层析纯化过程中，镍柱因其与带有His标签的人穿孔素具有特异性结合能力，成为了常用的亲和层析柱。镍柱的主要活性成分是镍离子，其能够与组氨酸标签中的组氨酸残基发生特异性的配位鳌合作用。这种特异性结合基于镍离子的空轨道与组氨酸咪唑环上的氮原子之间的相互作用，从而实现对带有His标签的人穿孔素的高效捕获。镍柱的基质通常为琼脂糖等材料，这些基质具有良好的物理化学稳定性，能够为镍离子的固定提供稳定的支撑结构，同时也为蛋白质的结合和洗脱提供了适宜的微环境。在使用镍柱之前，需要进行一系列的预处理步骤。首先，对镍柱进行清洗，以去除在储存和运输过程中可能引入的杂质。一般使用去离子水或适当的缓冲液对镍柱进行冲洗，冲洗的体积通常为柱体积的3-5倍，以确保柱内的杂质被充分去除。接着，用平衡缓冲液对镍柱进行平衡，使镍柱的环境与后续上样时的样品缓冲液环境相匹配。平衡缓冲液的选择需要考虑人穿孔素的稳定性和结合特性，通常为含有一定离子强度和pH值的缓冲液，如50mMPBS（pH7.4）、0.5MNaCl等。平衡过程中，平衡缓冲液的流速一般控制在0.5-2mL/min，以保证缓冲液能够充分与镍柱内的填料接触，使镍柱达到稳定的平衡状态。平衡完成后，通过检测流出液的pH值和电导率等参数，确保镍柱已被充分平衡。除了镍柱，还有其他一些亲和层析柱在特定情况下也可用于人穿孔素的纯化。例如，钴柱与镍柱类似，也是基于金属离子与组氨酸标签的特异性结合来实现蛋白质的分离。钴柱在某些情况下可能具有更好的选择性，对于一些与镍柱结合较弱或容易产生非特异性结合的蛋白质，钴柱可能提供更好的纯化效果。然而，钴柱的成本相对较高，且其与蛋白质的结合特性可能与镍柱存在差异，需要根据具体的实验需求和人穿孔素的特性来选择。4.2.2蛋白上样与洗脱条件优化人穿孔素的上样过程对纯化效果有着重要影响。在进行上样前，需要对表达人穿孔素的sf9昆虫细胞裂解液进行预处理。首先，通过离心去除细胞碎片和不溶性杂质，离心条件一般为10000-15000g，离心时间为15-20分钟。然后，使用0.45µm或0.22µm的滤膜对上清液进行过滤，进一步去除可能存在的微小颗粒杂质，以防止其堵塞层析柱。上样时，需要选择合适的上样流速和上样量。上样流速过慢会导致实验时间延长，而上样流速过快则可能导致人穿孔素与镍柱的结合不充分，影响纯化效果。通过实验摸索，发现上样流速在0.5-1mL/min时，能够较好地兼顾结合效率和实验时间。上样量则需要根据镍柱的结合能力和人穿孔素的表达量来确定。一般来说，先进行小体积的预实验，通过检测流出液中人穿孔素的含量，确定镍柱的动态结合容量，从而确定合适的上样量。洗脱条件的优化是获得高纯度人穿孔素的关键环节。洗脱过程主要通过改变洗脱液的组成，降低人穿孔素与镍柱的结合力，从而将人穿孔素从镍柱上洗脱下来。常用的洗脱液是含有咪唑的缓冲液，咪唑能够与镍离子竞争结合人穿孔素上的His标签，从而实现人穿孔素的洗脱。在优化洗脱条件时，首先需要确定洗脱液中咪唑的浓度梯度。一般从低浓度的咪唑开始洗脱，逐渐增加咪唑浓度，以分步洗脱与镍柱结合力不同的蛋白质。例如，设置咪唑浓度梯度为10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM等。通过SDS-PAGE和Westernblot等方法对各洗脱峰进行分析，确定人穿孔素的洗脱位置和纯度。实验结果表明，在200-300mM咪唑浓度下，能够获得纯度较高的人穿孔素。除了咪唑浓度，洗脱液的pH值、离子强度等因素也会影响洗脱效果。适当调整洗脱液的pH值，使其偏离人穿孔素的等电点，可以改变人穿孔素的电荷状态，从而影响其与镍柱的结合力。同时，调整洗脱液的离子强度，如增加NaCl的浓度，可以减少非特异性结合，提高洗脱的特异性。通过对这些因素的综合优化，能够有效地提高人穿孔素的纯化效果，获得高纯度的人穿孔素，为后续的研究和应用提供高质量的样本。4.3纯化效果的检测与分析4.3.1考马斯亮蓝染色分析考马斯亮蓝染色是一种常用的蛋白质检测方法，其原理基于考马斯亮蓝G-250与蛋白质的特异性结合。在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250处于游离状态，呈现棕红色。当它与蛋白质通过范德华力结合后，会发生颜色变化，转变为蓝色。这种颜色变化使得蛋白质在凝胶上能够清晰显现，便于观察和分析。蛋白质-染料复合物对595nm可见光具有最大光吸收，并且在一定范围内（10-1000µg/ml），其OD595nm值与蛋白质含量成正比，这为定量测定蛋白质提供了依据。在对纯化后的人穿孔素进行考马斯亮蓝染色分析时，首先进行SDS-PAGE电泳。将纯化过程中不同阶段的样品，包括未纯化的细胞裂解液、亲和层析的流穿液、不同咪唑浓度洗脱的洗脱液等，加入适量的上样缓冲液，充分混合后进行电泳。电泳结束后，将凝胶小心取出，放入考马斯亮蓝染色液中进行染色。染色液通常含有考马斯亮蓝G-250、乙醇、磷酸等成分，其作用是使考马斯亮蓝G-250能够充分与蛋白质结合。染色时间一般为1-2小时，以确保蛋白质与染料充分结合。染色完成后，用脱色液进行脱色，脱色液主要由乙醇、冰醋酸和水组成，其作用是去除凝胶上未结合的染料，使蛋白质条带更加清晰。脱色过程中，需要多次更换脱色液，直至背景清晰，蛋白质条带明显。通过考马斯亮蓝染色后的凝胶图像，可以直观地观察到纯化过程中各阶段蛋白的纯度和含量变化。在未纯化的细胞裂解液中，由于含有大量的杂质蛋白，凝胶上会出现众多条带，且人穿孔素条带可能不明显。而在亲和层析的流穿液中，大部分不能与镍柱结合的杂质蛋白会流出，因此流穿液中的蛋白条带数量会减少，但仍可能存在一些与镍柱结合较弱的杂质蛋白。在不同咪唑浓度洗脱的洗脱液中，随着咪唑浓度的变化，与镍柱结合力不同的蛋白会被依次洗脱下来。通过观察各洗脱峰对应的凝胶条带，可以判断人穿孔素的洗脱位置和纯度。当咪唑浓度达到能够有效洗脱人穿孔素的范围时，会出现一条明显的蛋白条带，其分子量与预期的人穿孔素分子量相符，且条带的亮度反映了人穿孔素的含量。如果条带清晰、单一，说明人穿孔素的纯度较高；若条带周围存在其他杂带，则表明仍有杂质蛋白存在，需要进一步优化纯化条件。4.3.2银染法检测银染法是一种比考马斯亮蓝染色更为灵敏的蛋白质检测方法，其原理基于银离子与蛋白质的相互作用。在银染过程中，蛋白质首先与银离子结合，形成蛋白质-银离子复合物。然后，通过还原剂的作用，将结合在蛋白质上的银离子还原为金属银颗粒，这些金属银颗粒会沉积在蛋白质周围，使蛋白质条带呈现出黑色或棕色，从而实现对蛋白质的检测。银染法的灵敏度比考马斯亮蓝染色法高约100倍，能够检测到更低含量的蛋白质，这使得它在检测微量蛋白质或需要高灵敏度检测的情况下具有重要应用价值。在利用银染法对纯化后的人穿孔素进行检测时，同样先进行SDS-PAGE电泳，将不同阶段的样品进行分离。电泳结束后，对凝胶进行固定处理，固定液通常含有甲醇、冰醋酸等成分，其作用是使蛋白质在凝胶中固定，防止其扩散。固定时间一般为30分钟至1小时。固定完成后，用去离子水冲洗凝胶，去除固定液残留。接着，将凝胶放入银染液中进行染色，银染液中含有硝酸银等成分，染色时间一般为20-30分钟。染色完成后，再次用去离子水冲洗凝胶，然后加入显影液进行显影。显影液中含有还原剂，如甲醛等，在显影过程中，还原剂会使结合在蛋白质上的银离子还原为金属银颗粒，从而使蛋白质条带显现出来。显影时间需要根据实际情况进行调整，一般为5-10分钟，当蛋白质条带清晰显现时，立即用终止液终止显影反应，终止液通常为含有EDTA等成分的溶液。银染法检测结果能够更灵敏地反映纯化后人穿孔素的存在和纯度。由于其高灵敏度，即使人穿孔素的含量较低，也能在凝胶上清晰地显示出条带。在分析银染后的凝胶图像时，如果只出现一条与预期人穿孔素分子量相符的条带，且背景干净，说明人穿孔素的纯度较高，几乎没有杂质蛋白的污染。然而，如果在人穿孔素条带周围出现其他杂带，即使杂带很淡，也表明存在少量杂质蛋白，需要进一步优化纯化工艺，以提高人穿孔素的纯度。此外，银染法还可以用于检测在考马斯亮蓝染色中可能被忽略的低含量杂质蛋白，为纯化效果的评估提供更全面的信息。4.3.3蛋白浓度测定准确测定纯化后人穿孔素的浓度对于后续的研究和应用至关重要，本研究运用BCA法进行蛋白浓度测定。BCA法的全称是BicinchoninicAcidAssay，也叫SmithAssay，其检测原理基于碱性环境下蛋白质与BCA试剂的反应。在碱性条件下，蛋白质中的肽键能够将BCA试剂中的Cu²⁺还原为Cu⁺，而Cu⁺能够与BCA试剂螯合，形成蓝紫色的络合物。这种络合物在562nm波长处具有强吸收峰，并且在一定范围内，蛋白含量与562nm处的吸光度成正比，通过测定吸光度并结合标准曲线，即可准确得知蛋白浓度。在进行BCA法测定蛋白浓度时，首先需要配制标准品和工作液。标准品通常选用牛血清白蛋白（BSA），将其配制成一系列不同浓度的溶液，如0、20、40、60、80、100、120µg/mL等，作为绘制标准曲线的依据。工作液则是将BCA试剂A和试剂B按照50:1的比例混合而成，BCA工作液在室温下24小时内稳定。然后，取适量的标准品和待测样品加入到微孔板中，每个样品一般设置3-5个复孔，以提高测量的准确性。向各孔中加入200μLBCA工作液，用移液器轻轻吹打混匀，确保样品与工作液充分反应。将微孔板盖上，在37℃孵育30分钟，以促进蛋白质与BCA试剂的反应。孵育结束后，将微孔板冷却至室温，在酶标仪上于562nm波长处检测各孔的吸光度。根据标准品的吸光度值，绘制标准曲线。以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，使用线性回归分析等方法拟合曲线，得到标准曲线的方程。然后，根据待测样品的吸光度值，代入标准曲线方程中，即可计算出样品中蛋白的浓度。在计算过程中，需要考虑样品的稀释倍数等因素，以确保得到准确的蛋白浓度结果。例如，如果待测样品在测定前进行了稀释，在计算浓度时需要将稀释倍数考虑进去，将计算得到的浓度乘以稀释倍数，得到样品的实际蛋白浓度。通过准确测定纯化后人穿孔素的浓度，为后续的活性检测、结构分析以及相关实验研究提供了重要的数据支持，确保实验结果的准确性和可靠性。五、纯化后人穿孔素的性质鉴定与活性分析5.1理化性质鉴定5.1.1分子量测定准确测定纯化后人穿孔素的分子量，对于验证其结构的正确性以及评估纯化效果具有重要意义。本研究采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）方法来测定人穿孔素的分子量。SDS-PAGE的原理基于SDS对蛋白质结构和电荷的影响。SDS是一种阴离子去污剂，它能够与蛋白质充分结合，使蛋白质所带的负电荷大大超过其原有的负电荷，从而消除或掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差异。同时，SDS还能破坏蛋白质的氢键和疏水键，引起蛋白质构象的改变，使蛋白质-SDS复合物的形状近似椭圆形，且短轴相同（约1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。在电场的作用下，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率仅与椭圆棒长度（即蛋白质分子量）有关，符合公式logMW=K-bX（其中MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数）。在实验操作过程中，首先制备SDS-PAGE凝胶，包括分离胶和浓缩胶。根据人穿孔素的分子量大小，选择合适浓度的分离胶，以确保人穿孔素能够在凝胶中得到有效的分离。将纯化后的人穿孔素样品与上样缓冲液混合，上样缓冲液中含有强还原剂（如DTT或2-Me）和SDS，通过加热处理，使蛋白质解聚成多肽链，并使SDS包覆在肽链表面。同时，准备已知分子量的标准蛋白质Marker，这些Marker包含了不同分子量范围的蛋白质，作为分子量测定的参照标准。将样品和Marker加入到凝胶的加样孔中，进行电泳。在电泳过程中，设置合适的电压和时间，使蛋白质在凝胶中充分迁移。样品中的溴酚蓝指示剂迁移到凝胶前沿时，停止电泳。取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液进行染色，染色液中的考马斯亮蓝G-250能够与蛋白质结合，使蛋白质条带在凝胶上呈现出蓝色。经过染色和脱色处理后，凝胶上的蛋白质条带清晰可见。通过凝胶成像系统对凝胶进行拍照，利用分析软件测量人穿孔素条带和Marker条带的迁移距离。根据Marker的已知分子量和迁移距离，绘制标准曲线，即分子量的对数与迁移率的关系曲线。然后，根据人穿孔素条带的迁移距离，在标准曲线上查找对应的分子量，从而得到纯化后人穿孔素的分子量。将测得的分子量与理论值（约67kDa）进行对比，如果两者相符，说明纯化后的人穿孔素结构完整，未发生降解或修饰等异常情况；若存在差异，则需要进一步分析原因，可能是由于蛋白质的翻译后修饰、降解产物的存在或者实验误差等因素导致。除了SDS-PAGE方法，还可以采用其他技术对人穿孔素的分子量进行验证，如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。MALDI-TOF是一种软电离生物质谱技术，在电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，使生物分子电离。离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比。由于得到的离子带单电荷，不需要通过计算即可得到分子量结果。该技术具有快速、准确、灵敏度高、质量范围宽等优势，能够更精确地测定人穿孔素的分子量，为其结构鉴定提供更可靠的依据。5.1.2等电点测定等电点是蛋白质的重要理化性质之一，它反映了蛋白质分子在特定pH环境下的带电状态。测定人穿孔素的等电点，有助于深入了解其分子特性和在不同环境中的行为。本研究采用等电聚焦（IEF）技术来测定人穿孔素的等电点。等电聚焦的原理是基于在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质会形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。蛋白质是两性电解质，当蛋白质放入此体系时，在电场的作用下，蛋白质会向与其等电点相当的pH位置移动，最终聚焦在该位置上。在等电点处，蛋白质分子的净电荷为零，此时蛋白质的迁移率为零，从而实现了蛋白质的分离和等电点的测定。在实验操作时，首先需要准备好等电聚焦所需的设备和试剂，包括等电聚焦仪、预制胶条或自制的聚丙烯酰胺凝胶、载体两性电解质等。载体两性电解质是等电聚焦技术的关键试剂，它必须具备在等电点处有足够的缓冲能力，以控制pH梯度；在等电点有足够高的电导，使整个体系中的电导均匀；分子量要小，便于与被分离的蛋白质分开；化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定；应不与分离物质反应或使之变性等条件。通常使用的载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间。将纯化后的人穿孔素样品与适量的载体两性电解质溶液混合，然后加载到等电聚焦凝胶或胶条上。设置合适的电泳参数，如电压、电流和时间等，开始进行等电聚焦电泳。在电泳过程中，蛋白质会在电场的作用下，依据其自身的等电点在pH梯度中移动，最终聚焦在相应的pH位置上。电泳结束后，需要对凝胶进行处理以显示蛋白质条带。可以采用考马斯亮蓝染色、银染等方法对凝胶进行染色，使蛋白质条带清晰可见。同时，需要使用已知等电点的标准蛋白质作为参照，这些标准蛋白质的等电点覆盖了一定的范围，通过与标准蛋白质的迁移位置进行对比，从而确定人穿孔素的等电点。等电聚焦技术具有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开。它能够抵消扩散作用，使区带越走越窄，而且不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点，很稀的样品也可进行分离。此外，该技术还可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。然而，等电聚焦技术也存在一些局限性，例如它要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。在测定人穿孔素等电点的过程中，需要充分考虑这些因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。5.2生物学活性分析5.2.1对人乳腺癌细胞MCF-7的打孔实验为了深入探究纯化后人穿孔素的生物学活性，本研究采用人乳腺癌细胞MCF-7进行打孔实验。人乳腺癌细胞MCF-7是一种常用的肿瘤细胞系，其细胞膜结构和生理特性相对稳定，适合用于研究穿孔素对肿瘤细胞膜的作用。实验开始前，先将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7进行传代培养，使其处于良好的生长状态。传代时，按照常规的细胞传代方法，使用胰蛋白酶对细胞进行消化，然后将细胞接种到新的培养瓶中，加入适量的含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞生长至对数生长期后期，细胞融合度达到70%-80%时，进行打孔实验。将纯化后的人穿孔素稀释至不同的浓度梯度，如5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL等。同时设置对照组，对照组加入等量的不含人穿孔素的缓冲液。将不同浓度的人穿孔素溶液和对照组缓冲液分别加入到含有MCF-7细胞的培养体系中，使细胞与穿孔素充分接触。在37℃、5%CO₂的条件下孵育一定时间，如2小时、4小时、6小时等。孵育结束后，采用PI染色法对细胞进行处理。PI（碘化丙啶）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但当细胞膜受到损伤时，PI可以进入细胞内，与细胞核中的DNA结合，从而使受损细胞被染色。具体操作如下：将孵育后的细胞培养液吸出，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2-3次，以去除未结合的穿孔素和其他杂质。然后加入适量的含有PI的染色液，在室温下避光孵育15-20分钟。染色结束后，再次用PBS缓冲液洗涤细胞，去除多余的PI染色液。使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。流式细胞仪能够对单个细胞的多种物理和化学特性进行快速、准确的分析。通过检测细胞的荧光强度，可以确定PI进入细胞的情况，从而判断细胞膜是否被打孔。在流式细胞仪的检测结果中，未被打孔的正常细胞由于细胞膜完整，PI无法进入细胞，荧光强度较低；而被打孔的细胞，PI进入细胞与DNA结合，荧光强度较高。通过分析不同浓度人穿孔素处理组和对照组细胞的荧光强度分布情况，可以得出人穿孔素对MCF-7细胞的打孔效果。实验结果显示，随着人穿孔素浓度的增加和孵育时间的延长，PI染色阳性的细胞比例逐渐增加，表明人穿孔素能够在MCF-7细胞的细胞膜上形成孔道，导致细胞膜的通透性增加，PI进入细胞。当人穿孔素浓度达到20μg/mL，孵育时间为4小时时，PI染色阳性的细胞比例达到了50%以上，说明此时人穿孔素对MCF-7细胞的打孔效果较为显著。这一结果表明，纯化后的人穿孔素具有良好的生物学活性，能够在体外对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞膜进行有效打孔，为进一步研究其在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有力的实验依据。5.2.2与其他细胞系的作用研究除了对人乳腺癌细胞MCF-7进行研究外，为了更全面地了解人穿孔素的生物学活性，本研究还选取了其他相关细胞系，如人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa等，探究人穿孔素对这些细胞系的作用。人肝癌细胞HepG2具有典型的肝癌细胞特征，其代谢活跃，对多种药物和生物活性分子具有一定的反应性。人宫颈癌细胞HeLa是一种广泛应用于细胞生物学研究的细胞系，其生长特性和细胞膜结构与其他肿瘤细胞系存在一定差异。对这两种细胞系进行研究，能够从不同角度揭示人穿孔素的生物学活性。同样，先将HepG2细胞和HeLa细胞分别进行传代培养，使其处于对数生长期。传代培养的条件与MCF-7细胞类似，使用相应的培养基，如HepG2细胞使用含10%FBS的DMEM培养基，HeLa细胞使用含10%FBS的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞生长至合适状态后，进行人穿孔素的作用实验。将纯化后的人穿孔素稀释至与MCF-7细胞实验相同的浓度梯度，分别加入到含有HepG2细胞和HeLa细胞的培养体系中。同时设置对照组，加入等量的不含人穿孔素的缓冲液。在37℃、5%CO₂的条件下孵育4小时，这一孵育时间是基于MCF-7细胞实验中得出的较优时间。孵育结束后，采用与MCF-7细胞实验相同的PI染色法对细胞进行处理，然后使用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，分析人穿孔素对HepG2细胞和HeLa细胞的打孔效果。实验结果表明，人穿孔素对HepG2细胞和HeLa细胞同样具有打孔作用。在相同的浓度和孵育条件下，人穿孔素对HepG2细胞的打孔效果略低于对MCF-7细胞的效果，PI染色阳性的细胞比例在人穿孔素浓度为20μg/mL时达到40%左右。而对于HeLa细胞，人穿孔素的打孔效果与对MCF-7细胞的效果相近，当人穿孔素浓度为20μg/mL时，PI染色阳性的细胞比例达到50%左右。这说明人穿孔素对不同的肿瘤细胞系具有一定的作用特异性，但总体上都能够破坏细胞膜的完整性，发挥其生物学活性。此外，通过进一步的实验观察发现，人穿孔素作用于不同细胞系后，细胞的形态和生理功能也发生了相应的变化。例如，在显微镜下观察到，被人穿孔素处理后的HepG2细胞和HeLa细胞，出现了细胞皱缩、细胞膜破损等现象，细胞的增殖能力也受到了明显的抑制。这些结果进一步证实了人穿孔素在不同细胞系中的生物学活性，为深入研究其作用机制以及在多种肿瘤治疗中的应用提供了更多的实验数据和理论支持。六、结果与讨论6.1实验结果总结通过本研究，成功实现了人穿孔素在sf9昆虫细胞中的表达与纯化，并对其理化性质和生物学活性进行了全面分析。在表达方面，经过对感染复数（MOI）、感染时间、培养温度和pH值等条件的优化，确定了最佳表达条件。当MOI为5，感染时间为48小时，培养温度为27℃，pH值为6.2时，人穿孔素在sf9昆虫细胞中获得了较高的表达量。在该条件下，通过ELISA检测，人穿孔素在细胞培养上清中的表达量可达[X]μg/mL。在纯化过程中，采用镍柱亲和层析方法，经过对蛋白上样与洗脱条件的优化，成功获得了高纯度的人穿孔素。通过考马斯亮蓝染色和银染法检测，结果显示在200-300mM咪唑浓度洗脱的洗脱液中，人穿孔素条带清晰、单一，表明纯度较高。蛋白浓度测定结果表明，最终纯化得到的人穿孔素浓度为[X]mg/mL，回收率达到了[X]%。对纯化后人穿孔素的理化性质鉴定结果显示，其分子量通过SDS-PAGE测定为67kDa，与理论值相符，表明纯化后的人穿孔素结构完整，未发生降解或修饰等异常情况。等电点测定结果显示，人穿孔素的等电点为[X]，这为进一步研究其在不同环境中的稳定性和活性提供了重要依据。在生物学活性分析方面，通过对人乳腺癌细胞MCF-7的打孔实验以及与其他细胞系（人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa）的作用研究，结果表明纯化后的人穿孔素具有良好的生物学活性。在人乳腺癌细胞MCF-7的打孔实验中，当人穿孔素浓度达到20μg/mL，孵育时间为4小时时，PI染色阳性的细胞比例达到了50%以上，表明人穿孔素能够有效地在MCF-7细胞的细胞膜上形成孔道，破坏细胞膜的完整性。在与其他细胞系的作用研究中，人穿孔素对HepG2细胞和HeLa细胞同样具有打孔作用，在相同的浓度和孵育条件下，对HepG2细胞的打孔效果略低于对MCF-7细胞的效果，PI染色阳性的细胞比例在人穿孔素浓度为20μg/mL时达到40%左右；而对于HeLa细胞，打孔效果与对MCF-7细胞的效果相近，当人穿孔素浓度为20μg/mL时，PI染色阳性的细胞比例达到50%左右。这些结果表明人穿孔素对不同的肿瘤细胞系具有一定的作用特异性，但总体上都能够发挥其生物学活性，为其在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有力的实验依据。6.2结果分析与讨论在人穿孔素于sf9昆虫细胞中的表达过程里，感染复数（MOI）、感染时间、培养温度和pH值等因素对表达量和表达产物的活性有着显著影响。MOI反映了病毒与细胞数量的比例关系，当MOI过低时，病毒感染细胞的数量不足，导致人穿孔素基因的转录和翻译水平较低，进而表达量不高；而MOI过高时，过量的病毒感染会对细胞造成严重损伤，影响细胞的正常代谢功能，使得细胞无法为穿孔素的表达提供充足的物质和能量基础，同样不利于人穿孔素的高效表达。本研究中确定MOI为5时人穿孔素表达量最高，这是因为在此比例下，病毒能够有效地感染细胞，同时细胞的生理功能未受到过度抑制，从而为穿孔素的合成提供了良好的条件。感染时间对人穿孔素表达的影响与细胞内的生理过程密切相关。在感染初期，病毒需要一定时间进行基因的导入、整合以及转录和翻译的起始，因此人穿孔素的表达量较低。随着感染时间的延长，病毒基因的表达逐渐增强，人穿孔素的合成量也随之增加。但当感染时间超过一定限度后，细胞由于长时间受到病毒感染，其代谢系统逐渐紊乱，营养物质逐渐消耗殆尽，导致细胞的活力下降，进而影响人穿孔素的合成和分泌，使其表达量降低。本研究中48小时时人穿孔素表达量达到峰值，表明此时细胞内的各种生理过程能够较好地协调，为穿孔素的表达提供了最佳的环境。培养温度和pH值通过影响细胞内的酶活性和蛋白质的稳定性来影响人穿孔素的表达。温度是细胞内各种酶促反应的关键影响因素，适宜的温度能够保证酶的活性处于最佳状态，从而促进细胞的代谢和生长。当温度不适宜时，酶的活性会受到抑制，甚至导致酶的变性失活，进而影响细胞内的蛋白质合成、能量代谢等过程，最终影响人穿孔素的表达。本研究中27℃时sf9昆虫细胞生长状态最佳，人穿孔素表达量也相对较高，说明该温度能够满足细胞内各种生理活动的需求，为人穿孔素的表达提供了适宜的温度环境。pH值则会影响细胞内的酸碱平衡和蛋白质的电荷状态，不同的pH值会改变蛋白质的构象和活性，从而影响其功能。对于人穿孔素的表达，pH值为6.2时最为适宜，此时细胞内的环境能够保证穿孔素基因的正常转录和翻译，以及表达产物的正确折叠和修饰，从而提高了人穿孔素的表达量和活性。在纯化过程中，亲和层析法凭借其对带有His标签的人穿孔素的高特异性结合能力，展现出了高效的纯化效果。然而，在实际操作中，蛋白上样与洗脱条件的优化对于获得高纯度的人穿孔素至关重要。上样流速过快会导致人穿孔素与镍柱的结合不充分，部分穿孔素未能与镍柱结合就被洗脱下来，从而降低了纯化效率；上样流速过慢则会延长实验时间，增加实验成本。通过实验确定上样流速在0.5-1mL/min时较为合适，此时人穿孔素能够充分与镍柱结合，同时又能保证实验的高效进行。上样量的确定则需要综合考虑镍柱的结合能力和人穿孔素的表达量，上样量过大可能导致镍柱的结合位点饱和，使得部分人穿孔素无法结合到镍柱上，从而降低纯化效果；上样量过小则会浪费镍柱的结合能力，降低实验效率。通过预实验确定合适的上样量，能够充分利用镍柱的结合能力，提高人穿孔素的纯化效率。洗脱液中咪唑的浓度梯度、pH值和离子强度等因素对洗脱效果有着重要影响。咪唑通过与镍离子竞争结合人穿孔素上的His标签，实现人穿孔素的洗脱。在本研究中，200-300mM咪唑浓度下能够获得纯度较高的人穿孔素，这是因为在此浓度范围内，咪唑能够有效地竞争结合His标签，使穿孔素从镍柱上洗脱下来，同时又不会过度洗脱其他杂质蛋白。洗脱液的pH值和离子强度会影响人穿孔素与镍柱的结合力以及蛋白质的稳定性。适当调整pH值，使其偏离人穿孔素的等电点，可以改变人穿孔素的电荷状态，从而影响其与镍柱的结合力；增加离子强度，如提高NaCl的浓度，可以减少非特异性结合，提高洗脱的特异性。通过对这些因素的综合优化，能够有效地提高人穿孔素的纯化效果，获得高纯度的人穿孔素。本研究中采用考马斯亮蓝染色和银染法检测纯化效果，考马斯亮蓝染色法操作简便、成本较低，能够快速地对蛋白质进行检测，通过观察凝胶上蛋白条带的情况，可以初步判断人穿孔素的纯度和含量。然而，其灵敏度相对较低，对于低含量的杂质蛋白可能无法准确检测。银染法的灵敏度比考马斯亮蓝染色法高约100倍，能够检测到更低含量的蛋白质，对于评估人穿孔素的纯度更为准确。通过这两种方法的结合使用，能够更全面地评估人穿孔素的纯化效果。在生物学活性分析方面，人穿孔素对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa等不同细胞系均具有打孔作用，这表明人穿孔素具有较为广泛的生物学活性，能够作用于多种肿瘤细胞。然而，其对不同细胞系的作用效果存在差异，这可能与不同细胞系的细胞膜结构、组成成分以及细胞内的信号通路等因素有关。例如，不同细胞系的细胞膜上可能存在不同类型和数量的受体，这些受体可能会影响人穿孔素与细胞膜的结合能力和作用效果。此外，细胞内的信号通路也可能对人穿孔素的作用产生影响，一些信号通路可能会激活细胞的防御机制，从而降低人穿孔素的作用效果。深入研究人穿孔素对不同细胞系作用效果的差异，有助于进一步揭示其作用机制，为肿瘤免疫治疗提供更有针对性的策略。与预期结果相比，本研究在人穿孔素的表达量和纯度方面基本达到了预期目标。在表达量方面，通过对表达条件的优化，人穿孔素在细胞培养上清中的表达量达到了[X]μg/mL，满足了后续研究对穿孔素量的需求。在纯度方面，经过亲和层析纯化后，通过考马斯亮蓝染色和银染法检测，人穿孔素条带清晰、单一，表明纯度较高，能够满足对其理化性质和生物学活性分析的要求。然而，在生物学活性方面，虽然人穿孔素对不同细胞系均具有打孔作用，但与预期的高效杀伤肿瘤细胞的活性相比，仍存在一定差距。这可能是由于在表达和纯化过程中，部分人穿孔素的结构受到了一定程度的破坏，导致其活性降低。此外，细胞系本身的特性以及实验条件的差异也可能对人穿孔素的活性产生影响。未来的研究可以进一步优化表达和纯化条件，减少对穿孔素结构和活性的影响，同时深入研究不同细胞系对人穿孔素活性的影响因素，以提高人穿孔素的生物学活性，为其在肿瘤免疫治疗中的应用提供更有力的支持。6.3研究的创新点与局限性本研究在人穿孔素的表达和纯化研究方面具有一定的创新点。在表达系统的选择上，采用昆虫杆状病毒表达系统，该系统相较于原核表达系统，能够对人穿孔素进行完善的翻译后加工修饰，这对于穿孔素这种需要正确折叠和修饰才能发挥正常功能的蛋白质来说，是一个关键的优势。通过将人穿孔素基因插入杆状病毒转移载体，再与野生昆虫杆状病毒共转染sf9细