酶促反应动力学课件

酶促反应动力学

Enzyme概念酶促反应动力学（Kineticsofenzyme-catalyzedreactions）：是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。

化学反应的两个基本问题：反应进行的方向、可能性和限度反应进行的速率和反应机制一、化学动力学基础化学热力学化学动力学（一）反应速率及其测定

——以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。Ｖ随着反应的进行，反应物逐渐消耗，分子碰撞的机会也逐渐减小，因此反应速率减慢。（二）反应分子数和反应级数1.反应分子数：——反应中真正相互作用的分子的数目单分子反应：AP（有机反应中的分子重排，同分异构体的互变等）

双分子反应：A+BP+Q单分子反应

v=kc双分子反应

v=kc1c2c、c1、c2：反应物浓度（mol/l）

k：比例常数/反应速率常数2.反应级数能以v=kc表示，为一级反应；能以v=kc1c2表示，则为二级反应；

v与反应物浓度无关，则为零级反应。双分子反应、一级反应蔗糖的稀水溶液中，水的浓度比蔗糖浓度大得多，水浓度的减少与蔗糖比较，可以忽略不计，故可将水的浓度可以作为常数。因此反应速度只决定于蔗糖的浓度。（三）各级反应的特征

1.一级反应：

反应速率与反应物浓度的一次方成正比。

v=kc

C0C0/20t½[P]Ct反应物的消耗产物的增加半衰期t1/2：有一半反应物转化为产物所需的时间lnC0lnC0/20t½Ctk当t=t½时，c=1/2c0,则t½＝0.693／k,即半衰期与反应物的初浓度无关。2.二级反应：凡是反应速率与反应物质浓度二次方（或两种物质浓度的乘积）成正比的，这种反应称为二级反应。

v=k（a-x）（b–x）

a、b：反应物A、B的初浓度

x：t时已发生反应的物质浓度

（a-x）、（b–x）：t时后A、B的浓度

t½＝1／ka初始浓度越大，反应产物减少一半所需要的时间就越短，这是二级反应的特征。3.零级反应：v=k一级反应：半衰期与反应物的初浓度无关二级反应：半衰期与反应物的初浓度成反比零级反应：半衰期与反应物的初浓度成正比反应速率是一常数。t½＝a／2k单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。（[S]》[E]）研究前提二、底物浓度对酶反应速率的影响产物0时间初速度酶促反应速度逐渐降低酶促反应的时间进展曲线

在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。反应初速度随底物浓度变化曲线当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax（一）中间络合物学说三个假设：（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即

V＝k3[ES]。（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。（3）这步反应：在反应的初始阶段，产物浓度很低，ES分解为产物的逆反应可以忽略不计。当酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物ES，然后生成产物，释放出酶。（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程的推导1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Km+[S]＝──具体推导过程稳态：指反应进行一段时间后，系统的复合物ＥＳ浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断地变化，复合物ＥＳ也在不断地生成和分解，但当反应系统中ＥＳ的生成速率和ＥＳ的分解速率相等时，络合物ＥＳ浓度保持不变的这种反应状态就称为稳态。在稳态下，ES的生成速率d[ES]/dt=k1([E]-[ES])·[S]……(1)K4生成速率与K1和K4有关，但K4反应忽略不计，因此只与Ｋ1有关。([E]-[ES])表示未与底物结合的游离状态的酶浓度。ES的分解速率与K2和K3有关，即可得出-d[ES]/dt=k2[ES]+K3[ES]……………(2)在稳态下，ES的生成速率与ES的分解速率相等，即(1)＝(2)。即得出：k1([E]-[ES])·[S]=k2[ES]+K3[ES]移项可得：([E]-[ES])·[S]/[ES]=(K2+K3)/K1…(3)用Km表示K1、K2和K3这3个常数。

Km=(K2+K3)/K1………(4)将(4)式代入(3)式，即可得到：

([E]-[ES])·[S]/[ES]=Km…………(5)由(5)式可以得到稳态的[ES]：

[ES]=[E][S]/(Km+[S])………(6)因为酶促反应速度(v)与[ES]成正比，即v=K3[ES]…(7)将(6)式代入(7)式，可得到：v=K3[E][S]/(Km+[S])…(8)由于反应体系中[S]»[E]，当[S]很高时，所有的酶都被底物所饱和形成ES，即[E]=[ES]，酶促反应速度达到最大反应速度Vmax,因此，Vmax=K3[ES]=K3[E]…………(9)将(9)式代入(8)式，可得：ＶVmax[S]Km+[S]＝──

a.当[S]很小时V=V[S]/Km一级反应反应初速度随底物浓度变化曲线米氏曲线V=V[S]Km+[S]b.当[S]很大时V=V[S]/[S]=V

0

级反应混合级Km=?Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]2、动力学参数的意义（1）米氏常数Km的意义Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2

①Km是酶的特性常数：

与pH、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0②可以判断酶的专一性和天然底物Km值最小的底物——最适底物/天然底物1/Km近似表示酶对底物的亲和力：1/Km越大、亲和力越大Km=

k2+k3k1Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，亲和力越强。k2>>k3时④Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径催化可逆反应的酶对正/逆两向底物Km不同

——Km较小者为主要底物③根据Km：判断某一[s]浓度时，其反应速率v与Vmax的关系。乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛丙酮酸浓度较低时，不能同时被几种酶所作用，这时代谢哪条途径决定于Km最小的酶.一底物多酶反应（2）Vmax和k3（kcat)的意义一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。[S]很大时，Vmax＝k3[E]。k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，——又称为转换数、催化常数kcat

kcat越大，酶的催化效率越高（3）kcat/km的意义：V=

Vmax[S]Km+[S]∵Vmax=kcat[Et]∴V=kcat[Et][S]Km+[S]当[S]<<Km时，[E]＝[Et]大多数酶分子处于游离形式。是E和S反应形成产物的表观二级速率常数。其大小可用于比较酶的催化效率。kcat/km的大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法3、

Km与V的求取（2）Eadie-Hofstee作图法vV[S]Vmax斜率－Km三、多底物的酶促反应动力学

分为单底物、双底物和三底物反应1.酶促反应按底物分子数分类：酶促反应按底物分子数的分类底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分率单底物异构酶A↔B5%单向单底物裂合酶A↔B+C12%假单底物水解酶A·B+H2O↔A·OH+B·H26%双底物氧化还原酶转移酶A·H2+B↔A+B·H227%A+B·X↔AX+B24%三底物连接酶A+B+ATP↔AB+ADP+Pi6%①有序反应（orderedreactions）领先底物释放释放A和Q竞争地与自由酶结合（1）序列反应或单－置换反应2.多底物反应按动力学机制分类：严格说在缺少Ａ时，Ｂ不能结合自由的酶。②随机反应（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应AAEPE’PEE’QEQEBB

A和Q竞争自由酶E形式

B和P竞争修饰酶形式E’A和Q不同E’结合

B和P也不与E结合。(2)乒乓反应或双－置换反应此反应中没有三元复合物形成。

四、影响酶促反应速率的其他因素

（一）pH对酶促反应的影响最适pH因酶而异，多数酶在7.0左右各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH是酶的特性之一酶的活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低，通常把表现出酶最大活力的pH称为该酶的最适pH（optimumpH）一些酶的最适pH酶底物最适pH胃蛋白酶鸡蛋白蛋白1.5血约蛋白2.2丙酮酸羧化酶丙酮酸4.8脂肪酶低级酯5.5～5.8过氧化氢酶H2O27.6核糖核酸酶RNA7.8胰蛋白酶苯甲酰精氨酰胺7.7精氨酸酶精氨酸9.7pH对酶活力的影响的主要原因（1）极端的pH值即过酸或过碱引起酶蛋白变性，因而酶活力丧失。（2）pH的改变影响酶分子上酸性和碱性氨基酸残基的侧链基团的解离状态。如果基团处于酶的活性中心，直接影响酶与底物的结合和进一步的催化反应；如果处在中心之外，则影响酶的三维空间结构，从而影响酶活性。（3）pH值改变也影响底物的解离状态，或者底物不能与酶结合，或者结合后不能生成产物。

在达到最适温度之前提高温度，可以增加酶促反应的速度。反应温度每提高10℃，其反应速度与原来的反应速度之比称为反应的温度系数（temperaturecoefficient），用Q10表示。Q10多为1～2，也就是说温度每增加10℃，酶反应速度为原反应速度的1～2倍

。

（二）、温度对酶反应的影响

在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimumtemperature）.一般动物组织中的酶其最适温度为35～40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30～60℃，少数酶可达60℃以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。

温度对酶促反应速度的影响机理：

1.温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。2.温度影响酶的活性：酶是蛋白质，过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。

最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。（三）激活剂对酶反应的影响

能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和合成酶的激活剂，Cl-是动物唾液中的α-淀粉酶的激活剂。

激活剂激活剂的作用特点：（1）酶对激活剂有一定的选择性，且有一定的浓度要求，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂；（2）某些离子具有拮抗作用，如Na+抑制K+的激活作用，Ca++抑制Mg++的激活作用；（3）有些金属离子激活剂可互相替代，如Mg++可被Mn++所替代；（4）当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂；（5）激活剂的作用机制多种多样，可能是作为辅酶或辅基的一个组成部分，也可能直接作为酶活性中心的构成部分。

五、酶的抑制作用失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。抑制剂：能引起抑制作用的物质。研究酶抑制作用的意义是用于研究酶的结构与功能、酶的催化机制以及阐明代谢调控途径的基本手段；可以为医药设计新药物和为农业生产新农药提供理论依据。（一）抑制程度的表示方法V0：Vi：不加入抑制剂时的反应速率加入抑制剂后的反应速率以反应速率的变化表示。1.相对活力分数（残余活力分数）2.相对活力百分数（残余活力百分数）V0ViViV03.抑制分数——指被抑制而失去活力的分数V0Vi4.抑制百分数

Vi

V0

抑制率

依据：

能否用透析、超滤等物理方法

除去抑制剂，使酶复活。可逆抑制与不可逆抑制（二）抑制作用的分类

抑制作用可通过超滤、透析等方法除去。原因：非共价键结合可逆抑制竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveI.）反竞争性抑制(uncompetitiveI.)

1、可逆抑制作用：这类抑制可用米-曼氏动力学方程进行分析。（1）竞争性（Competitive)抑制

抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。

I：

抑制剂（inhibitor）竞争性抑制的特点：⑴竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；⑵抑制剂与酶的结合部位和底物与酶的结合部位相同；⑶抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；⑷动力学参数：Km值增大，Vm值不变。【举例】

丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸琥珀酸竞争性抑制磺胺药物的抑菌作用人体作为微生物的宿主，可以从食物中摄取四氢叶酸，因此磺胺类药物不影响正常叶酸代谢，而微生物靠自身合成四氢叶酸，一旦叶酸代谢受阻，生命不能继续，因此微生物对磺胺类药物敏感。与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药抗菌机理：（与对氨基苯甲酸是结构类似物）竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。

抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。（2）非竞性（Non-competitive)抑制抑制物无法形成产物Noncompetitiveinhibition（2）特点：

⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；⑷动力学参数：Km值不变，Vm值降低。含义和反应式

反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。

（3）反竞争性（Uncompetitive）抑制反竞争性抑制的特点：⑴反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；⑶必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；⑷动力学参数：Km减小，Vm降低。2、不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)

不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。按其作用特点，又分专一性及非专一性两种。

不可逆抑制剂

非专一性不可逆抑制剂（作用于一/几类基团）

专一性不可逆抑制剂（作用于某一种酶的活性部位基团）不可逆抑制常见的不可逆抑制剂青