肠道菌群在糖尿病心血管疾病中的作用

肠道菌群在糖尿病心血管疾病中的作用演讲人01肠道菌群在糖尿病心血管疾病中的作用02引言：肠道菌群与糖尿病心血管疾病的交叉视角03肠道菌群的基础特性与代谢功能：宿主健康的第一道防线04糖尿病状态下肠道菌群的变化特征：失调的“微生物组景观”05心血管疾病的病理生理基础：糖尿病并发症的核心靶点06肠道菌群调控糖尿病心血管疾病的机制：多维度的互作网络07研究挑战与未来方向：精准医疗时代的菌群研究08结论与展望：肠道菌群——糖尿病心血管疾病防治的新视角目录01肠道菌群在糖尿病心血管疾病中的作用02引言：肠道菌群与糖尿病心血管疾病的交叉视角1糖尿病心血管疾病的流行病学现状与临床挑战糖尿病心血管疾病（DiabeticCardiovascularDisease,DCVD）是糖尿病患者最主要的并发症和死亡原因，全球约50%的糖尿病患者死于心血管事件，包括冠心病、心力衰竭、脑卒中等。高血糖、胰岛素抵抗等代谢紊乱通过内皮功能障碍、炎症反应、氧化应激等多途径加速动脉粥样硬化进程，但传统降糖、调脂治疗仍难以完全降低DCVD风险。近年来，随着“肠-轴”理论的兴起，肠道菌群作为连接饮食、代谢与免疫的关键“器官”，其失调在DCVD发生发展中的作用逐渐被揭示，为疾病防治提供了新思路。1糖尿病心血管疾病的流行病学现状与临床挑战1.2肠道菌群：从“共生微生物”到“器官级调节者”的认知转变肠道菌群是寄居于人体肠道的复杂微生物生态系统，包含约100万亿个微生物，基因数量是宿主基因的100倍以上，被称为“第二基因组”。过去十年，宏基因组学、代谢组学等技术的发展使我们对菌群的认识从“共生微生物”深化为“器官级调节者”——其通过代谢产物（如短链脂肪酸、胆汁酸）、信号分子（如脂多糖、神经递质）与宿主免疫系统、代谢系统、神经系统持续对话，参与能量代谢、屏障功能、炎症调控等关键生理过程。3本文研究框架与核心科学问题本文将从肠道菌群的基础特性出发，系统阐述糖尿病状态下菌群的变化规律，解析菌群通过代谢、免疫、神经内分泌等通路影响心血管疾病的机制，探讨菌群作为诊断标志物和治疗靶点的潜力，并展望未来研究方向。核心科学问题包括：①糖尿病如何改变肠道菌群结构？②失调的菌群通过哪些具体途径促进心血管病变？③如何基于菌群调控开发DCVD防治新策略？03肠道菌群的基础特性与代谢功能：宿主健康的第一道防线1肠道菌群的组成与动态平衡1.1宏观组成：门、纲、属、种的层级结构肠道菌群以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势菌门（占比＞90%），其次为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）等。在属水平，拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃菌属（Prevotella）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）等常见，其中双歧杆菌、乳酸杆菌等为益生菌，而大肠杆菌（Escherichia）、克雷伯菌（Klebsiella）等条件致病菌在菌群失调时可过度增殖。1肠道菌群的组成与动态平衡1.2定植特征：肠道区室化与年龄、饮食的影响肠道菌群具有明显的区室化特征：近端小肠（十二指肠、空肠）菌群较少（10³-10⁴CFU/g），以链球菌、葡萄球菌等需氧菌为主；远端回肠及结肠菌群密集（10¹¹-10¹²CFU/g），以厌氧菌为主。年龄是影响菌群的重要因素：婴儿期菌群以拟杆菌门为主，成人后厚壁菌门比例上升，老年期菌群多样性降低，致病菌增多。饮食结构（如高脂、高纤维饮食）可快速改变菌群组成——高脂饮食厚壁菌门/拟杆菌门比值升高，而膳食纤维可促进产短链脂肪酸菌增殖。2肠道菌群的代谢功能与宿主互作2.1短链脂肪酸：能量底物与信号分子肠道菌群发酵膳食纤维产生短链脂肪酸（SCFAs），包括乙酸、丙酸、丁酸（占比约60:20:20）。丁酸是结肠上皮细胞的主要能量来源，维持肠道屏障完整性；丙酸通过门静脉入肝抑制胆固醇合成；乙酸可通过血脑屏障影响神经功能。此外，SCFAs作为配体激活G蛋白偶联受体（GPR41/43、GPR109a），促进肠道L细胞分泌胰高血糖素样肽-1（GLP-1），增强胰岛素敏感性，抑制食欲，发挥代谢调节作用。2肠道菌群的代谢功能与宿主互作2.2胆汁酸代谢：从消化液到激素的转化肝脏合成初级胆汁酸（胆酸、鹅脱氧胆酸），随胆汁进入肠道后，在肠道细菌（如梭状芽胞杆菌）作用下转化为次级胆汁酸（脱氧胆酸、石胆酸）。次级胆汁酸通过激活法尼酯X受体（FXR）和G蛋白偶联胆汁酸受体（TGR5），调节脂代谢、葡萄糖稳态和炎症反应——FXR激活可抑制肝脏糖异生，TGR5激活促进GLP-1分泌，但过量次级胆汁酸（如石胆酸）具有细胞毒性，损伤肠道屏障。2肠道菌群的代谢功能与宿主互作2.3色氨酸代谢物：神经递质与免疫调节膳食色氨酸经肠道菌群代谢产生犬尿氨酸、血清素、吲哚等产物。犬尿氨酸通过芳香烃受体（AhR）调节免疫细胞功能，过量时促进炎症；血清素（5-HT）可调节肠道蠕动和血小板聚集；吲哚及其衍生物（如吲哚-3-丙酸）激活AhR和Nrf2通路，抗氧化和抗炎。菌群失调时色氨酸代谢向犬尿氨酸途径偏移，导致神经炎症和代谢紊乱。2肠道菌群的代谢功能与宿主互作2.4其他代谢产物：维生素、神经递质等肠道菌群合成维生素K、B族维生素（B1、B2、B12、叶酸）等必需营养素，参与凝血、能量代谢等过程；此外，部分细菌（如γ-氨基丁酸杆菌）产生γ-氨基丁酸（GABA），调节神经递质平衡；肠道菌群还可影响胆碱代谢，减少促炎物质三甲胺（TMA）的合成，降低动脉粥样硬化风险。04糖尿病状态下肠道菌群的变化特征：失调的“微生物组景观”1菌群多样性降低与结构紊乱1.1α多样性与β多样性的变化规律α多样性反映菌群丰富度和均匀度，2型糖尿病（T2DM）患者肠道菌群α多样性显著降低，表现为菌种数量减少、优势菌丧失；β多样性反映菌群组成差异，T2DM患者与对照组菌群结构明显分离，形成独特的“糖尿病菌群型”（diabetes-associatedenterotype）。一项纳入2000余人的Meta分析显示，T2DM患者厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值降低，而变形菌门（革兰阴性菌）丰度升高，后者是内毒素的主要来源，与胰岛素抵抗正相关。1菌群多样性降低与结构紊乱1.2关键菌属的丰度改变：有益菌减少与致病菌增加T2DM患者中，产SCFAs的益生菌（如双歧杆菌、普拉梭菌、罗斯氏菌）丰度显著降低，而条件致病菌（如大肠杆菌、拟杆菌、梭状芽胞杆菌）丰度升高。例如，普拉梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii）是丁酸的主要产生菌，其丰度降低与T2DM患者炎症水平升高直接相关；变形菌门中的革兰阴性菌（如克雷伯菌）通过脂多糖（LPS）激活TLR4通路，诱导胰岛素抵抗。2糖尿病菌群失调的驱动因素2.1饮食结构：高脂高糖饮食的破坏作用高脂饮食（HFD）和高糖饮食通过改变肠道pH值、竞争性抑制有益菌生长，导致菌群失调。HFD增加胆汁酸分泌，促进革兰阴性菌增殖，LPS入血引发“代谢性内毒素血症”；高糖饮食促进黏附侵袭性大肠杆菌（AIEC）过度生长，破坏肠道屏障。此外，饮食中膳食纤维不足，导致SCFAs产生减少，削弱肠道屏障和免疫调节功能。3.2.2药物影响：二甲双胍、SGLT2抑制剂等的菌群调节效应部分降糖药物可直接或间接调节肠道菌群。二甲双胍通过增加肠道氧含量，促进α-变形菌纲（如大肠杆菌）生长，进而提升SCFAs产生；SGLT2抑制剂通过增加粪便葡萄糖浓度，促进益生菌增殖，抑制致病菌。而长期使用抗生素可导致菌群多样性永久性降低，增加T2DM发病风险。2糖尿病菌群失调的驱动因素2.3免疫炎症：高血糖环境下的菌群-免疫恶性循环高血糖状态下，肠道上皮细胞紧密连接蛋白（如occludin、claudin-1）表达降低，肠道通透性增加，LPS等细菌产物入血，激活巨噬细胞TLR4/NF-κB通路，释放IL-6、TNF-α等促炎因子，进一步加重胰岛素抵抗；胰岛素抵抗又可通过影响肠道血供和黏液分泌，加剧菌群失调，形成“菌群失调-炎症-胰岛素抵抗”的恶性循环。3菌群失调与糖尿病病理进程的互作3.1胰岛素抵抗：菌群代谢产物与信号通路异常菌群失调导致的LPS入血可激活TLR4/MyD88通路，抑制胰岛素受体底物（IRS）酪氨酸磷酸化，抑制PI3K/Akt信号，导致胰岛素抵抗；SCFAs减少导致GLP-1分泌不足，胰岛素敏感性降低；次级胆汁酸异常激活FXR，抑制肝脏糖异生作用减弱，升高血糖。3.3.2β细胞功能：炎症因子与菌群代谢物的双重影响菌群失调引起的慢性炎症（IL-1β、TNF-α）可直接损伤胰岛β细胞，促进细胞凋亡；而部分菌群代谢物（如丁酸）可通过激活GPR109a，抑制NLRP3炎症小体活化，保护β细胞功能。此外，菌群产生的支链氨基酸（BCAAs）过多可激活mTOR通路，抑制β细胞增殖，加速功能衰竭。05心血管疾病的病理生理基础：糖尿病并发症的核心靶点1内皮功能障碍：血管健康的“第一道裂缝”1.1NO/ET-1失衡与氧化应激高血糖、氧化应激（ROS）增加导致一氧化氮（NO）合成减少，内皮素-1（ET-1）分泌增加，血管舒张功能受损；ROS可激活蛋白激酶C（PKC），促进血管细胞黏附分子（VCAM-1）、细胞间黏附分子（ICAM-1）表达，促进单核细胞黏附，启动动脉粥样硬化。1内皮功能障碍：血管健康的“第一道裂缝”1.2炎症因子对内皮细胞的损伤IL-6、TNF-α等炎症因子可诱导内皮细胞凋亡，破坏血管屏障完整性；MMP-9（基质金属蛋白酶-9）过度表达降解细胞外基质，促进斑块不稳定。2动脉粥样硬化：慢性炎症驱动的血管病变2.1脂质代谢异常与泡沫细胞形成糖尿病状态下，脂蛋白脂酶（LPL）活性降低，富含甘油三酯的脂蛋白（VLDL、乳糜微粒）清除障碍，小而密LDL（sdLDL）增加，易被氧化修饰（ox-LDL），被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞，形成早期动脉粥样硬化斑块。2动脉粥样硬化：慢性炎症驱动的血管病变2.2斑块不稳定与血栓风险斑块内炎症因子（如IL-1β、MCP-1）促进平滑肌细胞凋亡，纤维帽变薄；斑块破裂后暴露的胶原纤维激活血小板，形成血栓，引发急性冠脉综合征。3心脏重塑：心肌结构与功能的改变3.1糖尿病心肌病的病理特征长期高血糖导致心肌细胞内糖代谢紊乱（山梨醇通路激活、AGEs沉积）、心肌纤维化（TGF-β1过度表达）、线粒体功能障碍，心肌收缩和舒张功能下降。3心脏重塑：心肌结构与功能的改变3.2自主神经功能障碍与心律失常肠道菌群失调可通过“肠-脑轴”影响迷走神经张力，导致心脏自主神经功能紊乱，增加心律失常（如房颤）风险；此外，菌群代谢产物（如TMA）可促进心肌纤维化，加重心功能不全。06肠道菌群调控糖尿病心血管疾病的机制：多维度的互作网络1代谢通路：菌群代谢产物的直接作用1.1短链脂肪酸：丁酸与丙酸的代谢调节丁酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），增加肠道GLP-1和PYY分泌，改善胰岛素敏感性；丁酸还可激活AMPK通路，抑制肝脏糖异生，降低血糖。丙酸通过门静脉入肝，抑制胆固醇合成关键酶（HMG-CoA还原酶），降低血清胆固醇水平；同时激活肠道L细胞GLP-1分泌，改善脂代谢紊乱。1代谢通路：菌群代谢产物的直接作用1.2次级胆汁酸：FXR/TGR5信号对脂代谢的影响次级胆汁酸（如脱氧胆酸）激活肠道FXR，抑制肝脏SREBP-1c表达，减少脂肪酸合成；激活TGR5，促进棕色脂肪组织产热，改善能量代谢。但过量石胆酸可损伤肠道屏障，促进LPS入血，加剧炎症。1代谢通路：菌群代谢产物的直接作用1.3脂多糖（LPS）：TLR4介导的炎症级联反应LPS与LPS结合蛋白（LBP）结合，形成复合物，激活单核/巨噬细胞TLR4/MyD88通路，激活NF-κB，释放IL-6、TNF-α等促炎因子，诱导胰岛素抵抗和内皮功能障碍；LPS还可激活NLRP3炎症小体，促进IL-1β成熟，加剧动脉粥样硬化。2免疫炎症通路：菌群-免疫-血管轴的对话2.1TLR4/NF-κB通路：LPS诱导的全身炎症菌群失调导致的LPS入血是“代谢性内毒素血症”的核心机制。TLR4激活后，通过MyD88依赖途径激活IKKβ，磷酸化IκBα，释放NF-κB入核，促进炎症因子转录；同时激活JNK通路，抑制胰岛素信号转导，形成“炎症-胰岛素抵抗”恶性循环。5.2.2NLRP3炎症小体：菌群失调与IL-1β/IL-18释放菌群失调（如变形菌门增多）产生的ATP、结晶等激活NLRP3炎症小体，促进caspase-1活化，切割IL-1β和IL-18前体，成熟IL-1β可促进内皮细胞黏附分子表达，加速动脉粥样硬化；IL-18促进IFN-γ分泌，加重心肌炎症损伤。2免疫炎症通路：菌群-免疫-血管轴的对话2.3Treg/Th17平衡：菌群对免疫微环境的塑造益生菌（如双歧杆菌）促进调节性T细胞（Treg）分化，分泌IL-10，抑制炎症反应；致病菌（如梭状芽胞杆菌）促进辅助性T细胞17（Th17）分化，分泌IL-17，促进中性粒细胞浸润和血管炎症。T2DM患者常表现为Treg/Th17平衡向Th17偏移，加剧心血管病变。3神经内分泌通路：肠-脑-心轴的调节作用3.1迷走神经：肠道信号的传入与传出肠道菌群产生的SCFAs、色氨酸代谢物等激活肠道迷走神经感觉末梢，信号经孤束核（NTS）传递至下丘脑，调节自主神经功能；迷走神经传出纤维抑制肠道炎症因子释放，形成“胆碱能抗炎通路”，保护心血管系统。3神经内分泌通路：肠-脑-心轴的调节作用3.2HPA轴：应激反应与菌群-神经互作菌群失调可通过激活HPA轴，增加糖皮质激素分泌，升高血糖，加重胰岛素抵抗；反过来，慢性应激（如焦虑、抑郁）通过影响肠道血供和黏液分泌，加剧菌群失调，形成“菌群-应激-代谢紊乱”的恶性循环。3神经内分泌通路：肠-脑-心轴的调节作用3.3肠道激素：GLP-1、PYY对心血管的保护作用GLP-1除促进胰岛素分泌外，还具有心肌保护作用：抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌纤维化、改善内皮功能；PYY可抑制交感神经活性，降低血压、心率，减轻心脏负荷。菌群失调导致GLP-1/PYY分泌减少，削弱心血管保护作用。4肠道屏障功能：“肠漏”与细菌易位的影响4.1肠道通透性增加的机制：紧密连接蛋白破坏高血糖、氧化应激、炎症因子（如TNF-α）可下调紧密连接蛋白（occludin、claudin-1、ZO-1）表达，破坏肠道屏障完整性，导致“肠漏”（intestinalleakiness）。4肠道屏障功能：“肠漏”与细菌易位的影响4.2细菌易位与系统性炎症的启动肠道通透性增加后，细菌（如大肠杆菌）、LPS、DNA等易位入血，激活肝脏库普弗细胞和循环单核细胞，释放炎症因子，引发系统性炎症，加速动脉粥样硬化和心肌损伤。4肠道屏障功能：“肠漏”与细菌易位的影响4.3肠道屏障修复：益生菌与黏膜保护剂的作用益生菌（如乳酸杆菌）可促进黏蛋白（MUC2）分泌，增强黏液层厚度；丁酸可促进紧密连接蛋白表达，修复肠道屏障；黏膜保护剂（如谷氨酰胺）为肠道上皮提供能量，减轻氧化应激，改善屏障功能。6.肠道菌群作为糖尿病心血管疾病的干预靶点：从基础到临床的转化1菌群标志物的诊断价值：早期预警与风险分层1.1菌群特征谱：特定菌属作为生物标志物研究表明，T2DM患者中，罗斯氏菌（Faecalibacterium）、普雷沃菌（Prevotella）等丰度降低，而柯林斯菌（Collinsella）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）等丰度升高，可作为糖尿病风险预测的标志物。例如，柯林斯菌属与空腹血糖、HbA1c呈正相关，是胰岛素抵抗的独立预测因子。1菌群标志物的诊断价值：早期预警与风险分层1.2代谢物标志物：SCFAs、胆汁酸等的检测粪便丁酸水平降低、血清LPS升高、次级胆汁酸/初级胆汁酸比值增加，可作为DCVD风险分层标志物。例如，血清LPS＞50EU/mL提示“代谢性内毒素血症”，心血管事件风险增加2-3倍。1菌群标志物的诊断价值：早期预警与风险分层1.3多组学整合：宏基因组与代谢组学的联合应用通过宏基因组测序分析菌群基因功能，结合代谢组学检测代谢物变化，可构建“菌群-代谢”网络模型，预测DCVD发生风险。例如，结合普拉梭菌丰度和血清丁酸水平，可提高T2DM患者心血管事件预测的准确性（AUC＞0.85）。2益生菌与益生元：调节菌群组成的策略2.1益生菌的选择：乳酸杆菌、双歧杆菌等的临床证据特定益生菌菌株可改善糖尿病心血管代谢紊乱：例如，乳酸杆菌（LactobacilluscaseiShirota）可降低T2DM患者血清TC、LDL-C水平，改善内皮功能；双歧杆菌（Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis420）可增加粪便丁酸含量，降低胰岛素抵抗。一项Meta分析显示，益生菌干预（＞8周）可显著降低T2DM患者HbA1c（-0.46%）和CRP（-0.35mg/L）。2益生菌与益生元：调节菌群组成的策略2.2益生元的作用：膳食纤维的发酵与代谢产物生成益生元（如低聚果糖、抗性淀粉）可促进益生菌增殖，增加SCFAs产生。例如，抗性淀粉（40g/天）可增加粪便丁酸浓度30%，改善T2DM患者胰岛素敏感性；低聚果糖可通过激活肠道FXR，降低血清TG水平。2益生菌与益生元：调节菌群组成的策略2.3合生元：益生菌与益生元的协同效应合生元（如益生菌+低聚果糖）可增强单一干预效果。例如，双歧杆菌+低聚果糖联合干预，可显著增加T2DM患者粪便双歧杆菌丰度（2.1倍）和丁酸水平（45%），同时降低血清LPS（28%）和TNF-α（22%），改善血管内皮功能。3粪菌移植（FMT）：重建菌群平衡的探索3.1FMT在糖尿病动物模型中的效果在db/db糖尿病小鼠中，移植健康供体粪菌可增加普拉梭菌、罗斯氏菌等丰度，降低血清LPS和炎症因子，改善胰岛素敏感性，减少动脉粥样硬化斑块面积（约40%）。3粪菌移植（FMT）：重建菌群平衡的探索3.2临床应用的挑战：供体选择、安全性标准化FMT在T2DM患者中的初步研究显示，单次FMT可改善短期血糖控制（HbA1c降低0.5%-1.0%），但效果持续6-12个月后逐渐减弱。目前面临的主要挑战包括：供体筛选标准不统一、长期安全性未知（如潜在病原体传播）、个体差异大（响应率约50%-60%）。未来需优化FMT方案（如多次移植、菌株组合），以提高疗效和安全性。4饮食干预：菌群调节的基础与核心4.1地中海饮食、DASH饮食的菌群调节机制地中海饮食（富含橄榄油、鱼类、全谷物、蔬菜水果）可增加双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌丰度，降低变形菌门比例，提高SCFAs水平，改善胰岛素抵抗和内皮功能。DASH饮食（富含水果、蔬菜、低脂乳制品）通过高膳食纤维摄入，促进产丁酸菌增殖，降低血压和血脂。4饮食干预：菌群调节的基础与核心4.2限制性饮食：轻断食、生酮饮食的短期效应轻断食（16:8间歇性断食）可增加肠道菌群多样性，促进阿克曼菌（Akkermansiamuciniphila）增殖（该菌可改善肠道屏障和代谢健康）；生酮饮食（高脂、极低碳水）短期内可降低血糖，但长期可能减少膳食纤维摄入，导致菌群多样性降低，需谨慎评估。4饮食干预：菌群调节的基础与核心4.3个性化营养：基于菌群分型的饮食指导通过菌群检测将患者分为“产丁酸优势型”“致病菌过度增殖型”等，制定个性化饮食方案。例如，对“产丁酸优势型”患者增加膳食纤维摄入，对“致病菌过度增殖型”患者限制饱和脂肪酸，可显著改善代谢指标（HbA1c降低0.8%-1.2%）。07研究挑战与未来方向：精准医疗时代的菌群研究1当前研究的局限性1.1因果关系的复杂性：菌群与疾病的双向互作多数研究为观察性研究，难以确定菌群失调是DCVD的“原因”还是“结果”。例如，T2DM患者的高血糖环境可改变菌群组成，而菌群失调又加重代谢紊乱，形成双向因果关系。动物模型（如无菌小鼠）虽可提供因果证据，但与人类生理环境存在差异。1当前研究的局限性1.2个体差异的挑战：遗传背景、环境因素的交织遗传背景（如FTO基因多态性）、生活方式（饮食、运动、睡眠）、用药史（抗生素、降糖药）等因素均可影响菌群组成，导致个体间差异大。例如，相同饮食干预下，不同个体的菌群响应模式可能完全不同，影响治疗效果。1当前研究的局限性1.3机制研究的深度：信号通路的交叉与冗余菌群通过代谢产物、信号分子等多途径调控心血管健康，但各通路间存在交叉（如SCFAs同时激活GPR43和FXR）和冗余（如丁酸和GLP-1均改善胰岛素敏感性），单一机制研究难以全面反映菌群的作用网络。2未来研究的重点方向7.2.1多组学技术的整合：宏基因组、转录组、蛋白组与代谢组通过宏基因组测序分析菌群基因功能，结合转录组（宿主基因表达）、蛋白组（炎症因子、代谢酶）、代谢组（SCFAs、胆汁酸）数据，构建“菌群-宿主”互作网络，揭示DCVD的分子机制。例如，整合宏基因组与代谢组数据，可鉴定出“普拉梭菌-丁酸-GLP-1”轴在改善胰岛素抵抗中的关键作用。2未来研究的重点方向2.2动物模型与临床研究的结合：从机制到转化利用无菌小鼠、基因敲除小鼠（如TLR4⁻/⁻、NLRP3⁻/⁻）等模型，明确特定菌群或代谢产物在DCVD中的因果关系；同时开展大规模、多中心临床研究（如队列研究、随机对照试验），验证