分光光度法测量中药中总黄酮含量的研究

PAGEPAGE1分光光度法测量中药中总黄酮含量的研究摘要：【目的】总黄酮类化合物是许多中药材的重要成分，在抗菌、抗炎以及抗病毒方面具有重要的作用，本研究将对7种中药中总黄酮的含量进行分析和标定。【方法】采用上海精科仪器制造厂生产的UV759/UV759S紫外—可见分光光度计测定中药中总黄酮的含量，通过测量最大波长、绘制标准曲线的方法，对7种中药进行了化学分析，测定其各自的总黄酮含量。【结果】总黄酮标准溶液在(524士2)nm处有最大吸收峰，通过测量总黄酮浓度与吸光度的标准实验曲线，计算出回归方程：A=0.2472C+0.0019，相关系数R2=0.999，溶液的吸光度与吸光度的比值关系良好，证实该方法测定中药总黄酮的含量完全可行。【结论】7种的中药中总黄酮的含量并不相同，其中麻黄的总黄酮含量最高，为0.2433μg/g，其次为桂皮、茯苓以及甘草等。其中当归的含量很低，为0.0056μg/g，白芍和白芷在本次检测中并未检测出总黄酮。关键词：总黄酮；分光光度法；中药；含量；最大吸收波长引言总黄酮类化合物是植物新陈代谢的副产物，广泛存在于自然界的植物当中，其显著特点是三个碳原子连接两个苯环而形成C6-C3-C6的特殊化合物结构。总黄酮类化合物种了很多类具有药用价值，如疏通血管、缓解心绞痛、预防脑溢血、降低血液内的血脂和体内的胆固醇，预防老年人高血压等作用。[1]近年来临床医学发现总黄酮类化合物在抗菌、抗炎以及抗病毒方面具有重要的作用。新冠病毒爆发两年来，中药应用于新冠病毒的预防与救治方面取得的成就是瞩目，总黄酮类化合物被认为中药制剂当中最重要的抗病毒效用成分[2]，因而，复方中药中总黄酮的含量特定便成为人们所关心的话题。目前，测定植物以及中药中总黄酮类化合物的方法很多，如比色法、薄层色谱法、化学滴定法、高压液相色谱法、荧光光度法以及分光光度法等等。比色法具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，但是其专属性较差，测定时易受其他成分干扰，目前很少采用。分光光度法是利用物质对光的某种波长具有选择性等比例吸收的特性，通过测定波长下的该物质的吸光度或发光强度，从而达到对该物质进行含量分析的方法。用于总黄酮含量分析的仪器主要是主要测试仪器是紫外－可见分光光度法，主要实验仪器为紫外－可见分光光度计[4]。紫外－可见分光光度计比较便宜，化学相关研究单位多有配置，仪器使用上比较方面，测试速度快，能满足总黄酮快速测量的要求，检测费用较低[5-7]，因此，本文将采用分光光度法测定几种不同中药中总黄酮的含量。1实验的原理和方法1.1实验原理总黄酮类化合物一般带有多个酚羟基，还含有碱性的氧原子基团，这两类基团能与三价铝离子形成黄色配合配位化合物，黄色配位化合物摘要亚硝酸钠和弱酸性缓冲溶液中呈现鲜红色，这类溶液在分光光度计中波长500-530处达到最大吸收，为典型的显色反应，因而可以被分光法做定量的研究。总黄酮类化合物一般用芦丁溶液作为参比对照，用三价铝离子作为显色剂，在亚硝酸钠和弱酸性缓冲溶液中显色，根据朗伯－比尔定律测出总黄酮的浓度曲线，通过浓度曲线完成对中药中总黄酮含量的测定。1.2标准溶液的配制1.2.1酸性缓冲溶液的配制pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液的配制：称取64.20g醋酸钠加二次蒸馏水300ml溶解，采用pH计在线测量溶液的pH值，加入醋酸调pH值到4.5，后加蒸馏水补充，定容到1000ml，即获得本研究所用的pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液。pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液配制四份，备用，用前需要将四份pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液充分混合后装瓶保存。pH5.0磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液500ml，用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。pH5.2磷酸－磷酸钠缓冲液：取0.3mol/L磷酸钠缓溶液500ml，用1.3mol/L磷酸试液调节pH值至pH5.0，即得。1.2.2标准溶液的配制将芦丁放入40℃的干燥箱中干燥24h后，放入干燥瓶中备用。用分析天平准确称量100.00mg芦丁，用60%乙醇水溶液定容到1000ml容量瓶作为标准溶液，获得0.1mg/ml的芦丁标准溶液。1mg/mL总黄酮标准溶液的配制：将总黄酮在30℃下烘干6.0h，称取1.0000g芦丁，以60%乙醇水溶液作为溶剂，定容到1000mL，即获得本研究所用1mg/mL总黄酮标准溶液，1mg/mL总黄酮标准溶液配制一份，备用。1mmol/mL硝酸铝标准溶液：将硝酸铝在40℃下烘干6.0h，称取3.9200g硫酸亚铁，采用pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液作为溶剂，定容到1000mL，即获得本研究所用1mmol/mL硝酸铝标准溶液，1mol/mL硝酸铝标准溶液配置两份，备用。3mmol/mL亚硝酸钠标准溶液：将亚硝酸钠在40℃下烘干86.0h，称取0.5950g亚硝酸钠，采用pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液作为溶剂，定容到1000ml，即获得本研究所用3mmol/mL亚硝酸钠标准溶液，3mmol/mL亚硝酸钠标准溶液配置一份，备用。空白溶液的配制，用移量管取1mmol/mL硝酸铝标准溶液和50mL，采用pH=4.5醋酸－醋酸钠缓冲液50mL，采用60%乙醇做稀释溶液，用1000mL的容量瓶定容至100mL，制得本实验用的空白溶液，备用。1.3实验步骤1.3.1总黄酮最大吸收波长的确定用移液管准确量取0.1mg/mL芦丁标准溶液2.5mL，加入1mmol/mL硝酸铝标准溶液1ml和3mmol/mL，亚硝酸钠标准溶液1mL，用60%乙醇水溶液定容至100mL，获得的溶液在400-800nm的波长范围内进行全波段扫描，测定样品在不同波长下的吸光度(A)。1.3.2总黄酮溶液标准吸收曲线的绘制用移液管准确量取0.1mg/ml总黄酮标准溶液0ml、0.5ml、1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml以及3.5ml，分别加入1mmol/ml硝酸铝标准溶液1ml，亚硝酸钠标准溶液1ml，分别用60%乙醇水溶液定容至100ml，获得一系列标准溶液0μg/ml，0.5μg/ml，1.0μg/ml，1.5μg/ml，2.0μg/ml，2.5μg/ml，3.0μg/ml以及3.5μg/ml。把0μg/g的样品作为参比样品，在确定的波长524nm，25℃的条件下，测定每个样品的吸光度，每个样品重复3次，然后取3次测量值的平均值，即为该浓度下的吸光度。每次测量均需要对测量池清洗3次。每个样品重复测量吸光度3次得到平均值，再将平均值以浓度C为横轴，以吸光度A为纵轴，实验获得的标准曲线，并计算出线性回归方程。1.3.3缓冲溶液和pH值的影响本研究还采用了pH5.0磷酸盐缓冲液和pH5.2磷酸－磷酸钠缓冲液，实验的方法如最大波长测试过程中的方法一致，所不同地把原缓冲溶液置换成通体积的pH5.0磷酸盐缓冲液和pH5.2磷酸－磷酸钠缓冲液，然后和原样品进行比较，考察缓冲溶液和pH值对吸光度的影响。1.3.4准确度的标定用移液管准确量取0.1mg/ml总黄酮标准溶液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL以及3.5mL，分别加入1mmol/mL硝酸铝标准溶液1mL，3mmol/mL，亚硝酸钠标准溶液1mL，分别用60%乙醇水溶液定容至100mL，再分别加入分析纯的中药10.0000g，则所得到的样品中总黄酮的含量分别为0μg/g，0.5μg/g，1.0μg/g，1.5μg/g，2.0μg/g，3.5μg/g，3.0μg/g以及3.5μg/g，充分搅拌、混合，静置30min。静置完毕后，取部分样品放入离心管中，12000r/min的转速下离心3min，取上清液测量吸光度，取样量为10ml，其中，0μg/g的样品作为参比样品。每个样品测量三次，取平均值，然后比较所测吸光度与标准曲线的差值，进而对本研究的准确度进行考察。1.3.5中药总黄酮含量的测定本实验研究了7种药店常见中药总黄酮的含量，将采集到的样品分别编号为1-7#。样品的制备：用移液管准确量取1mmol/ml硝酸铝标准溶液1ml，3mmol/ml，亚硝酸钠标准溶液1ml，分别用60%乙醇水溶液定容至100ml，再分别加入分购买的中药10.0000g，充分搅拌、混合，静置30min，样品分别编号为1-15#。参比溶液：移液管准确量取1mmol/ml硝酸铝标准溶液1ml，3mmol/ml，亚硝酸钠标准溶液1ml，分别用60%乙醇水溶液定容至100ml，加入10.0000g中药。静置完毕后，取部分样品放入离心管中，12000r/min的转速下离心3min，取上清液测量吸光度，其中，0μg/g的样品作为参比样品。每个样品测量三次，取平均值，通过标准曲线和回归方程获得中药中实际总黄酮的含量。2仪器和材料2.1主要实验仪器本研究主要的实验仪器如表1-1所示。表2-1主要实验仪器仪器型号生产厂家紫外一可见分光光度计TU-1800SPC上海精科仪器比色管石英上海精科仪器电子分析天平ME54E瑞士梅特勒－托利多pH计ST-II北京师范大学光电仪器厂恒温干燥箱YB-2天津盛达三合光学仪器超细粉碎机LHK24-11仪征电子仪表厂超级恒温水浴CJ-501常州市国旺仪器制造有限公司生化培养箱LRH-150B广东省医疗器械厂生产烧杯25-1000ml华东华玻仪器容量瓶25-1000ml蜀牛玻璃仪器2.2主要实验药品本研究的主要实验药品如表1-2所示。表2-2主要实验药品药品规格生产厂家芦丁AR天津大茂化工有限公司磷酸钠AR浙江精细化工有限责任公司醋酸AR广州化学试剂厂亚硝酸钠AR天津大茂化学试剂技有限公司硝酸铝AR天津国药二次蒸馏水 二次蒸馏自制醋酸钠AR广州化学试剂厂无水酒精CP天津大茂化工厂酒精95%AR国药试剂2.3中药材料在药店中购买7种中药材，每种采购200g左右，分别为麻黄、甘草、桂皮、白芷、茯苓、当归、以及白芍。将7中药材用超细粉碎机打成粉末，放在50℃烘箱中干燥72h，放入干燥器中备用。3结果与讨论3.1最大波长的确定测定标准样品溶液在不同波长下的吸光度(A)，得到的数据如图3-1所示。图3-1总黄酮在不同波长下的吸光度如图3-1所示，芦丁的60%乙醇溶液在(524士2)nm处有最大吸收峰。故确定524nm为总黄酮的检测波长，本研究将统一采用524nm作为测量总黄酮浓度的检测波长。3.2标准曲线的绘制标准曲线实验的实验结果如表3-1所示。以浓度C为横轴，以吸光度A为纵轴，实验获得的标准曲线如图3-2所示。表3-1总黄酮标准曲线实验数据浓度Cμg/ml吸光度A测量次数平均1#2#3#0.5030.12050.12010.12060.12031.0060.23830.23870.23790.23821.5080.38720.38670.38650.38642.0140.48190.48230.48170.48192.5110.62980.62950.62920.62953.0010.74350.74310.74260.74303.5060.85880.85910.85930.8591图3-2总黄酮吸光度的标准曲线表3-1中的数据标准曲线，并且计算，计算出回归方程：A=0.2472C+0.0019，相关系数R2=0.999，对相关性系数进行显著性检验，实验结果为：P＜0.01，表明溶液的吸光度与吸光度的比值关系良好，二者之间呈显著正相关的线性关系。因此，实验中，采用0.5-3.5μg/ml浓度范围，超过浓度范围值的浓度经过需经过稀释后进行测量，同理，在进行实验设计时，应尽可能地将实验体系的总黄酮浓度控制在0.5-3.5μg/ml的浓度范围内。3.3pH值的影响分析化学教材以及相关文献中，总黄酮与三价铝离子稳定发色的pH为4.0-5.5范围内，并未具体规定缓冲溶液的种类，因此本实验验证了缓冲溶液种类对实验结果的影响。实验的方法如最大波长测试过程中的方法一致，所不同地把原缓冲溶液置换成通体积的pH5.0磷酸盐缓冲液和pH5.2芦丁－芦丁钠缓冲液，然后和原样品进行比较，实验结果如表3-2所示。表3-2不同缓冲溶液和PH值的吸光度缓冲液的种类pH4.5醋酸－醋酸钠缓冲液pH5.0磷酸盐缓冲液pH5.2芦丁－芦丁钠缓冲液偏差吸光度0.48600.48720.48670.14%通过实验发现，不同的缓冲液体系和pH下吸光度的偏差为0.14%，即在保证pH=4.0-5.5的酸性环境下，不同缓冲液对实验结果没有影响。但为了实验的一致性，本研究的过程中统一采用pH4.5醋酸－醋酸钠缓冲液作为缓冲溶液。3.4准确度的标定本方法建立后，需要对方法的精确度进行标定。得到的结果如表3-3所示。本实验溶出度的计算是通过标准曲线及其回归公式获得，并且通过回归计算，芦丁钙标准溶液吸光度－浓度回归方程的表达式为：A=0.2472C+0.0019，进而获得吸光度转化成对总黄酮浓度关系的方程为：（3-1）将表3-2中的吸光度数据代入公式，得到制备样品的浓度，在测试样品的制备过程中，通过定容的方法定容为100ml，每次取样10ml，所以所以每份样品中通过计算可以求得对总黄酮的含量，即每份总黄酮的含量m=C×10（μg）（3-2）加入中药10.0000g，通过总黄酮含量的计算，可以计算得到总黄酮含量=（μg/g）（3-3）按照公式3-1、3-2以及3-3的换算后，总黄酮测定含量与实际含量的关系如表3-3所示。表3-3总黄酮含量精度的测量编号吸光度测定值（μg/g）实际值（μg/g）偏差(%)10.12050.49600.50000.8020.23831.01301.0000-1.3030.38721.51801.5000-1.2040.48192.00602.0000-0.3050.62982.48502.50000.6060.74353.00133.0000-0.0470.85883.49893.50000.03如图3-2所示，对总黄酮的含量分别为0.5μg/g，1.0μg/g，1.5μg/g，2.0μg/g，3.5μg/g，3.0μg/g以及3.5μg/g的样品进行测试，得到的实际总黄酮的含量分别为0.4960μg/g，1.0130μg/g，1.5180μg/g，2.006μg/g，02.485μg/g，03.0013μg/g以及3.4989μg/g；测量值与实际值的误差分别为：0.80%，-1.30%，-1.20%，-0.30%，0.60%，-0.04%以及0.03%，可见，此法的实验误差不超过±1.5%。3.5中药含量的测定样品的采集：本实验研究了市面上7种中药的总黄酮含量，将制备的中药样品分别编号为1-7#。每个样品测量三次，取平均值，得到的结果如表3-4。按照公式3-1、3-2以及3-3的换算后，市售中药总黄酮含量如表3-4所示。表3-4市售中药总黄酮含量的计算编号中药吸光度A测定值（μg/g）1麻黄0.06100.24332甘草0.02090.08343桂皮0.02410.10744白芷——5茯苓0.02600.10436当归0.00140.00567白芍——如表3-4所示，不同的中药中总黄酮的含量并不相同，其中麻黄的总黄酮含量最高，为0.2433μg/g，其次为桂皮、茯苓以及甘草等。其中当归的含量很低，为0.0056μg/g，而白勺和白芷在本次检测中并未检测出总黄酮，说明总黄酮并不是这两种重要的效力成分。麻黄在中药中具有中药的抗炎作用，其优越的抗炎作用可能与总黄酮含量高有关，但关联性究竟有多大尚不清楚，需要进行进一步的医学研究。以上作品的著作权为本作者所有，仅供参考，严禁抄袭，需要全套资料或者专业辅导请联系作者：QQ：2993571832微信：lxj12345114结论本研究采用上海精科仪器制造厂生产的UV759/UV759S紫外一可见分光光度计测定中药中总黄酮的含量，通过测量最大波长、绘制标准曲线的方法，对不同中药中所含有总黄酮含量进行分析和测定，得到的结论如下：1.总黄酮标准溶液的60%乙醇溶液在(524士2)nm处有最大吸收峰。故确定524nm为总黄酮的检测波长；本研究测量了总黄酮浓度与吸光度的标准实验曲线，计算出回归方程：A=0.2472C+0.0019，相关系数R2=0.999，溶液的吸光度与吸光度的比值关系良好，二者之间呈显著正相关的线性关系。3.本研究缓冲溶液和不同pH值对试验结果的影响，结果表明，本研究在室温条件下，pH=4.0-5.5的范围内的实验误差为0.14%，PH值范围内可以保证实验结果的一致性。5.本研究对市售的7种中药进行总黄酮含量的测量，经研究表明：不同的中药中总黄酮的含量并不相同，其中麻黄的总黄酮含量最高，为0.2433μg/g，其次为桂皮、茯苓以及甘草等。其中当归的含量很低，为0.0056μg/g，其中白芍和白芷在本次检测中并未检测出总黄酮。参考文献[1]王宇翎.白花蛇舌草总黄酮的免疫调节作用[J].中国药理学通报,2015,21(4):4.[2]谢雁鸣，许勇钢，赵晋宁，等.骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨密度和细胞因子IL-6、IL-4、TNFα水平的影响[J].中国中医基础医学杂志，2014,10(1):4.[3]王晓,李林波,马小来,等.酶法提取山楂叶中总黄酮的研究[J].食品工业科技,2002,23(3):3.[4]尉芹,王冬梅,马希汉,等.杜仲叶总黄酮含量测定方法研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版,2021,29(5):5.[5]奚奇辉,李士敏.纤维素酶在竹叶总黄酮提取中的应用[J].中草药,2017,35(002):166-167.[6]刘健伟,陈勇,熊富良,等.骨碎补总黄酮提取和大孔吸附树脂纯化的工艺研究[J].中国药学杂志,2006,24.[7]何书美,刘敬兰.茶叶中总黄酮含量测定方法的研究[J].分析化学,2007(6):12.Abstract:[Objective]totalflavonoidsareimportantcomponentsofmanytraditionalChinesemedicines.Theyplayanimportantroleinantibacterial,anti-inflammatoryandanti-virus.ThisstudyneedstoanalyzeandcalibratethecontentoftotalflavonoidsinseventraditionalChinesemedicines.[Methods]theUV759/UV759SUV-VISspectrophotometerproducedbyShanghaiJingkeinstrumentfactorywasusedtodeterminethecontentoftotalflavonoidsintraditionalChinesemedicine.SeveraltraditionalChinesemedicinescontainedindifferenttraditionalChinesemedicineswereanalyzedbymeasuringthemaximumwavelengthanddrawingthestandardcurve.[results]thestandardsolutionoftotalflavonoidshasthemaximumabsorptionpeakat(524±2)nm.Bymeasuringthestandardexperimentalcurveoft