易错点11 酶切位点的选择

易错点11酶切位点的选择

［名师支招］

1.单酶切和双酶切

（1）单酶切

①过程：先用同一种限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子，获得带有相同

黏性末端或平末端的片段。再通过DNA连接酶连接平末端或相同的黏性末端，

获得重组质粒。

②缺点：单酶切时，目的基因和载体的所有接口都是相同的，所以容易出现目的

基因反接或自身环化，如下图所示。

［单链4起，能互补）/L-Lk

_^=>一应］按（正接

（载体DNA）*'一/

插入DNA

（两端为用与插入DNA相同（…

相同的黏的限制的或用同尾\反接

性末端）醐醐切7------J

正反接问题示意图

单链凸起,能互补

载体DNA

插入DNAJ'

（两端为用与插入DNA相同自身环化的质粒

相同的黏的限制酶或用同尾只含标记基因,

性末端）酶酶切不含目的基因

自身环化示意图

（2）双酶切

①过程：利用两个不同限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体均具有两

个不同的黏性末端，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。

插入DNA（载体DNA）（

（两末端结J

构不同）用与插入DNA相同只按一个

的限制的进行幅切方向连接

②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。

2.酶切位点选择

(1)不破坏目的基因和标记基因：若在目的基因、标记基因或其他重要结构上有

某酶切位点，为避免这些结构被破坏，要避免使用相关的限制酶。

破林目的米因破坏标记泉因

I

甲

(2)根据T—DNA片段选择限制酶：若对Ti质粒进行操作，则酶切位点应位于T

-DNA片段上，才能在农杆菌转化过程中将目的基因导入受体细胞基因组上。

T-DNAT-DNA

目的基因

切割位点不位于T-DNA上

直选择

XbaISacI

丙\

切割位点位于T-DNA上,而且切割位点虽在T-DNA

含Xbal、SacI两种切割位点.上,但缺乏SacI切割

恰与目的基因两端切割位点相同位点

(3)同尾酶的使用：同尾随是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限

制酶。比如限制酶Mbol(lGATC)和BamWI(GIGATCC)就是一对同尾酶,

NotI(GCIGGCCGC)和Bsp\20I(GIGGCCC)也是同尾酶。尽管同尾随切割

的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接，但是由于两端的序列不同，连接后

的产物失去酶切位点，除非特殊情况，一般不会使用。

NotIBsp120I

弓IGGCCGCGI(GGCCC

CGCCGGlfCGCCCGGt^G_

NotI酶切位点Bsp120I酶切位点

GCTGGCCC

CGCCGG)|G

而酶切割的黏性末端连接的结果

［典例赏析］

1.(2022•天津卷，15)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关提酣

基因Pl导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。

引物】“

引物2

SacB

引物3

弓I物1

EcoR1

R;)sL

Hind111

Xho1

，XhoI

RpsL

\hoI

(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有长〃产(卡那霉素抗性基

因)和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物

和，并在引物的(填“5，”或“3，”)端引入X/普I酶识别序列，

进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。

(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物

应包含(填“EcoRI”或“XhoI”)酶识别序列，产物经单

酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4o

⑶将改进的P\基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由

RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采

用含有的平板进行初步筛选。

(4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,

且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为。

A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感

B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感

C.卡那霉素和链霉素都敏感

D.卡那霉素和链霉素都不敏感

⑸可采用技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨

酸产量。

答案(1)145，(2)X/MI(3)卡那霉素(4)B(5)PCR

解析(1)据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制(卡那霉素抗性基因),

需要引物1和4,因此为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物1和4°PCR时，

在引物作用下，DNA聚合酶从引物3,端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向

是从子链的5,端自3,端延伸的，因此在引物的5,端引入X〃ol酶识别序列.⑵

据图可知，载体4中即反（链霉素敏感基因）的两侧具有酶识别序列，载体

3中不含X/wI酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时,

需要的引物应该含有X/wl酶识别序列。（3）基因表达载体中的标记基因有利于目

的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有用sL（链霉素敏感基因）和K劭R（卡

那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由即反突变造成）、卡那霉素敏

感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初

步筛选。（4）据题意可知，载体5导入时的受体菌链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、

卡那霉素敏感，受体菌中P\基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体

5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感,

B正确，A、C、D错误。（5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞

的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA,因此可采用PCR技术鉴定

成功整合PI基因的菌株。

2.（2024.河北邯郸模拟节选）植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，

并与植物建立共生关系的一类微生物。

（1）某酵母菌能分泌一种可高效降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在放

线菌中表达W基因，需以图中质粒为载体。W基因以乙链为转录模板链，转录

时mRNA自身延伸的方向为o

BamHIBoRIMfeIHindIII

注：图中刖佬I与EcoRI切割后产生的黏性末端相同，其余不相同。

①很多启动子具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择

（填字母）。

A.酵母菌启动子B.芽胞杆菌启动子C.放线菌启动子

②应使用限制酶切割图中质粒，使用限制酶切割图中含w基

因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。

(2)利用PCR技术对放线菌是否含有W基因进行水平鉴定，应根据目的

基因(W基因)两端的碱基序列来设计进行扩增。

答案(l)5'f3，①C©MfeI>HindlllEcoRIHindlll(2)分子引物

解析(1)转录时，mRNA自身延伸方向为5，f31①该基因工程是将酵母菌的W

基因导入放线菌，想让W基因在放线菌中成功表达，应当选择放线菌启动子。

②按照选择限制酶的原则综合分析，MfeI与EcoRI切割后产生的黏性末端相

同，但会破坏目的基因，所以质粒使用限制酶顺I、”而dill切割，含W

基因的DNA片段使用限制酶EcoRI、H加dill切割。

(2)PCR技术是DNA分子的体外复制技术，属于分子水平。利用PCR技术扩增，

应根据目的基因两端的碱基序列设计引物，使引物与模板链能特异性结合。

3.(2024•河北邢台模拟)二十碳五烯酸(EPA)能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降

低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物

中提取了EPA合成途径的关键基因/次8,并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发

酵生产EPA。图1和图2分别是转基因过程中使用的含目的基因的DNA片段和

质粒。回答下列问题：

EcoRISina1EcoRI

引物I］引物2I5lg3J引物4

""iiiimii—■jj二

引曲弓法6目的基目引拓7|弓法8

⑴根据图1分析，利用PCR扩增破8基因时，所选用的引物是________0在

PCR仪中进行〃次循环，需要消耗个引物。

⑵构建基因表达载体时，应选择这两种限制旃分别切割含目的

基因的DNA和质粒，采用双酶切方法进行切割的目的是

⑶据图2分析，将基因表达载体导入酵母菌后，可用添加了的培

养基对目的基因成功导入并表达的酵母菌进行筛选。

⑷采用PCR等技术可检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产

物一般通过_____________来鉴定，DNA分子的迁移速率与

有关。

答案⑴引物5和引物42〃"-2(2)而〃HI和4〃d山避免目的基因和质

粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接(3)氨茉青霉素(4)琼脂糖凝狡电

泳凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等

解析(1)利用PCR扩增目的基因时，子链的延伸方向是5,端一3,端，扩增产物

应该包含酶切位点序列，所以选用的引物为引物5和引物4。一个DNA分子经

过〃次复制形成2〃个DNA,共含有条链，除两条亲代的模板链外，剩下的

每一条链的形成都需要消耗引物，所以需要消耗2个引物。

(2)图示分析:

箧切位点位于目的基因内部，会破坏目的基因。

/'\j11)

EcoRISma1EcoRI

引物11引物2I引物3［引物4

■跚蛔唧顺BH

*I斯|弓鬲寸而基而7弓77|扁8’

Bam\AI\JHindIII

目的基因两侧均有该障的碑切位点，若用它切割，会导致

目的基因两侧产生相同的粘性末端，不利干目的基因和质

粒的高效连接。

结合图示分析可知，应选择限制酶及加HI和HindHI分别切割含目的基因的

DNA和质粒。采用双幅切的方法对含目的基因的DNA和质粒进行切割，可以避

免目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因与质粒的反向连接。

(3)由图2可知，四环素抗性基因会被限制酶破坏，因此筛选目的基因成功导入

并表达的酵母菌时，可用添加氨芾青霉素的培养基培养酵母菌。

(4)采用PCR等技术检测〃自8基因是否插入酵母菌染色体中时，得到的PCR产

物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA

分子的大小和构象等有关。

4.(2021•山东等级考试，25)人类丫基因启动子上游的调控序列中含有BCLUA蛋

白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，y基因的表达被抑制。通过改变该结

合位点的序列，解除对丫基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。

科研人员扩增了Y基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进

行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图

所示。

注：F1-F7.R：弓I物

P:雌海家诱导卜发挥

作阳的启动了

班;见别序列及切

割位点：

I

MunIiCAATTG

XhoI：ACGAG

EcoRI：G\ATTC

SalI：GTCGAC

NhrI：GVTAGC

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加

限制酶识别序列。据图可知，在F1〜F7末端添加的序列所对应的限制酶是

，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________o本实验中，从产

物扩增到载体构建完成的整个过程共需要种酶。

(2)将构建的载体导入除去8CZJ/A基因的受体细胞，成功转化后，含F1〜F6与

R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体

细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是

(3)向培养液中添加适量的雌激素，含FI-F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧

光，而含F5〜F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若y基因上游调控序列上

与引物序列所对应的位置不含有BCLI1A蛋白的结合位点序列，据此结果可推

测BCL11A蛋白结合位点位于_________________________________________

__________________________________________________________________,

理由是____________________________________________________________

答案(1)SRIEcoRI6

(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达

(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判

断F1〜F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序

列的下游(右侧)；F5〜F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5

所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所

对应序列之间的区段上

解析（1）从题干中给的几种限制酶识别的序列和切割位点来看，可以发现

MunI和EcoRI产生的末端相同，可以用DNA连接酶连接起来，X/w1和SR1

产生的末端相同，可以用DNA连接酶连接起来。因为需要将扩增产物定向插入

到载体，指导荧光蛋白的表达，而荧光蛋白基因要表达必须在其上游（右侧）有启

动子，这样才能从右向左转录，直到终止子。而启动子可能存在于扩增产物中，

因为启动子在Y基因的上游（左侧），它调控的转录是从左向右的，调控两个基因

表达的启动子方向相反，需将扩增产物左右反转后接入载体中。而要将扩增产物

插入到荧光蛋白基因的右侧，其右侧有EcoRI和的切割位点，

但由于EcoRI还有一个切割位点在荧光蛋白基因内部，会将该基因破坏，所以

在构建基因表达载体时，不能选择EcoRI。因为需要在扩增产物两端加上相应

的限制酶识别序列，而在y基因上游的调控序列和启动子部分有I和I

的识别序列，为防止任意切割，所以在处理扩增