专题01发酵工程（期中复习课件）高二生物下学期苏教版

选必三发酵工程章末复习考点一

传统发酵技术的应用考点三

微生物的选择培养和计数考点二

微生物的基本培养技术考点四

发酵工程及其应用课标要求1.举例说明日常生活中的哪些食品是运用传统发酵技术生产的2.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定生命活动，工业化生产人类所需产品3.举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值

课标要求1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法

一、传统发酵技术的应用1.发酵与传统发酵技术①概念：②原理：③类型：指人们利用微生物，在适宜条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力需氧发酵厌氧发酵如：醋酸发酵、谷氨酸发酵如：酒精发酵、乳酸发酵(1)发酵根据氧气需求情况根据生成产物种类醋酸发酵酒精发酵乳酸发酵生产条件不易控制，易受杂菌污染，生产效率较低，产物不单一等果酒、果醋、泡菜、酱油等的制作①概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。②类型：混合菌种的半固体发酵⑤应用：④缺点：(2)传统发酵技术混合菌种的固体发酵③实质：有氧或无氧条件下的物质氧化分解一、传统发酵技术的应用1.发酵与传统发酵技术(1)腐乳制作2.传统发酵食品的制作②菌种：酵母，曲霉和毛霉等，主要是毛霉（真核）①原理：蛋白质小分子的肽+氨基酸脂肪甘油+脂肪酸一、传统发酵技术的应用蛋白酶脂肪酶曲霉毛霉乳酸菌酵母菌醋酸菌代谢特点最适温度代谢产物日常制品阅读P5—7，完成下表厌氧型兼性厌氧型好氧细菌370C280C30-350C乳酸酒精醋酸乳制品、泡菜酿酒、馒头、面包醋2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用(2)泡菜的制作2.传统发酵食品的制作①菌种：②发酵原理：在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量酶植物体表面天然的乳酸菌(常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌)一、传统发酵技术的应用

乳酸链球菌（球状）

乳酸杆菌（杆状）⑩向坛盖边缘的水槽中注满水目的:⑪腌制过程会出现溶液量增多现象，原因？配制盐水用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水→盐水煮沸→冷却待用原料处理、蔬菜装坛新鲜蔬菜洗净→切条块、混匀→晾干;装至半坛→加调味料→继续加菜至八成满调味；抑制其他微生物生长a.杀灭盐水中的微生物b.去除水中的溶解氧a.防止其他微生物发酵产生CO2使发酵液溢出坛外(发酵初期，酵母菌、大肠杆菌等较为活跃，发酵产物中有较多CO2)b.防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料腐烂变质加盐水封坛发酵将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，盐水没过全部菜料→盖好坛盖向坛盖边缘的水槽中注满水→发酵过程中经常向水槽中补充水根据室内温度控制发酵时间抑菌、无氧环境防止高温杀死菜料表面的乳酸菌增加乳酸菌的含量,

使其在短时间内形成菌种优势保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境⑤选用新鲜蔬菜的原因:⑥调味料、香辛料作用:⑦装八成满原因:新鲜蔬菜亚硝酸盐含量少,营养物质丰富外界溶液浓度高，使蔬菜渗透失水过高:乳酸发酵将受抑制；过低:杂菌易繁殖，导致泡菜变质①盐的作用:②盐水浓度适宜:③盐水煮沸的目的:④盐水冷却的目的:调味、抑菌⑧盐水没过全部菜料的原因:⑨可加少许的陈泡菜水的目的:③泡菜制作步骤：

泡菜在腌制过程中会有亚硝酸盐产生；

膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，但如果人体摄入过量，会发生中毒，甚至死亡；

膳食中的绝大部分亚硝酸盐随尿排出，但在适宜的pH、温度和一定的微生物作用下会转变成致癌物质亚硝胺(霉变的食品亚硝胺可增至数十倍至数百倍)。亚硝酸盐亚硝胺具有致癌作用，对动物具有致畸和致突变作用④泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化发酵时期乳酸菌乳酸亚硝酸盐发酵初期发酵中期发酵后期变化曲线少(有O2，乳酸菌活动受抑制)最多(乳酸抑制其它菌活动)减少(乳酸继续积累,pH继续下降,抑制自身活动)少增多、pH下降继续增多，pH继续下降,直至稳定达到最多后开始下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)增加(硝酸盐还原菌的作用)②泡菜制作过程中乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量的变化应该在11天后食用比较合适；因为这时亚硝酸盐含量已经降到较低的水平；泡菜制作中，哪些操作制造的“无氧环境”？a.选择的泡菜坛要有很好的气密性；

b.盐水煮沸后冷却待用；c.加入蔬菜后要注入盐水并没过全部菜料；

d.盖上坛盖，并用水密封泡菜坛。泡菜发酵初期，泡菜坛的水槽内会有间歇性的气泡冒出，试分析产生气泡的原因？酵母菌等微生物进行细胞呼吸产生CO2白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧菌，泡菜发酵液营养丰富，表面O2含量丰富，适合酵母菌繁殖。泡菜坛内有时会长一层白膜，白膜的形成原因？(2)泡菜的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用一方面发酵时间过长，可能产生其他有害物质；另一方面发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。食盐过多(或温度过低)抑制了乳酸菌的发酵制出的泡菜“咸而不酸”，最可能原因泡菜发酵时间是否越长越好？不是泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素哪些？温度过高、食盐的用量过低、腌制的时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加(2)泡菜的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用(3)果酒和果醋的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用项目制作果酒制作果醋菌种代谢异养

型异养

型发酵过程条件检测兼性厌氧需氧①原理和条件有氧条件酵母菌有氧呼吸大量繁殖无氧条件酵母菌进行酒精发酵C6H12O6+6O2+6H2O6CO2+12H2O+能量酶C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量酶当氧气、糖源充足时：当缺少糖源时：酶C2H5OH＋O2

CH3COOH＋H2OC6H12O6＋2O22CH3COOH＋2CO2＋2H2O酶前期需氧后期不需氧(18～30℃)一直需氧(30～35℃)闻气味、品尝、酸性条件下的重铬酸钾(橙色→灰绿色)酸碱指示剂(pH试纸)、闻气味、品尝酵母菌醋酸菌器具消毒将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用冲洗葡萄取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干榨汁装瓶用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶(注意:要留有大约1/3的空间)，盖好瓶盖①冲洗的目的:②冲洗1-2次即可,能否连续冲洗,为什么？③为什么去梗前冲洗:去除表面灰尘、污物不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会④葡萄汁装入发酵瓶时，为何要留有1/3的空间？a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵；b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。②果酒和果醋的制作步骤及目的(3)果酒和果醋的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用酒精发酵将温度控制在18～30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点(注意:不是打开瓶盖)，此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10～12d。果酒检测可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测打开瓶盖，盖上纱布果醋检测当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30～35℃，时间为7～8d。⑤每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的:⑥拧松但不打开的目的:防止杂菌污染排出气体CO2,防止发酵瓶爆裂a.嗅味、品尝b.重铬酸钾c.镜检酵母菌数量⑦此时酵母菌是否会继续发酵?不会。随醋酸发酵进行，发酵液PH、发酵温度均不利于酵母菌生长繁殖，酵母菌活性很低。⑧发酵完成后，在发酵液的液面上会出现一层菌膜，这是

菌膜a.观察液面白色菌膜;嗅味、品尝b.检测醋酸发酵前后PHC.镜检醋酸菌数量醋酸②果酒和果醋的制作步骤及目的(3)果酒和果醋的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用(1)葡萄酒呈现深红色的原因是___________________________。(2)为提高果酒的品质,并能更好地抑制其他微生物的生长,一般工厂生产时采取的措施是直接在果汁中加入___________的酵母菌。(3)检测果汁发酵后是否有酒精产生,通常用_____________来检验。在酸性条件下,发酵液呈现_________。红葡萄皮的色素进入发酵液人工培养酸性重铬酸钾灰绿色(4)防止发酵液被污染的方法①榨汁机要清洗干净并晾干。②发酵瓶要洗净并用体积分数为70%酒精消毒,或用洗洁精洗涤。③装入葡萄汁后要封闭充气口。④定期放气,拧松瓶盖,但不打开。⑤发酵瓶排气管用曲颈管而不能用直管。产品菌种微生物微生物来源微生物类型发酵原理腐

乳泡菜酿酒醋毛霉（主要）乳酸菌酵母菌醋酸菌好氧真菌厌氧细菌兼性厌氧真菌好氧细菌有氧呼吸利于繁殖；无氧呼吸产生酒精。空气中植物表面果皮表面空气中蛋白质小分子肽+氨基酸蛋白酶C6H12O6

酶

2C3H6O3(乳酸)+能量C6H12O6＋2O2→2CH3OOH＋

2H2O+2CO2＋能量酶C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O＋能量酶传统发酵菌种比较(3)果酒和果醋的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用通用发酵装置充气口排气口出料口装置的使用：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气。排出酒精发酵时产生的CO2排气口通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染长而弯曲用来取样,及时监测发酵进行的情況发酵前期充气口打开，输入无菌空气让酵母茵增殖，后期关闭充气口，进行酒精发酵；在醋酸发酵时连接充气泵进行充气③果酒和果醋发酵改进装置及其分析(3)果酒和果醋的制作2.传统发酵食品的制作一、传统发酵技术的应用【检测】下面是果酒和果醋制作的实验流程以及某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。请据图回答下列问题：（1）图1中方框内的实验流程是___________。（2）冲洗的主要目的是________________，冲洗时应特别注意不能_________________，以防菌种的流失。（3）图2所示装置中的充气口在_________时关闭，在____________时连接充气泵，并连续不断地向内____________________。（4）排气口在果酒制作时排出的气体是由_________(填生物名称)产生的________。醋酸发酵去除表面灰尘、污物反复冲洗酒精发酵醋酸发酵泵入无菌空气(或氧气)酵母菌CO2二、微生物的基本培养技术1.培养基的配制(1)培养基的概念、用途和类型

培养基↓(加入

，如琼脂)

培养基液体凝固剂固体概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。种类：按物理性质分按功能用途分选择培养基鉴别培养基[易错提醒]是否含有凝固剂(如琼脂)是区分固体培养基与液体培养基的唯一标准，含凝固剂的为固体培养基。NH4＋、NO3-、NH3等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质Zn、Cu、Mn、Co、Mo等Ca、K、Mg等（自养微生物）（异养微生物）（异养微生物）（自养微生物）①碳源无机碳源：有机碳源：②氮源CO2、CO32-、HCO3-。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。无机氮源：有机氮源：③无机盐大量元素：微量元素：牛肉膏、蛋白胨：④水成分：1.培养基的配制(2)基本成分：水、碳源、氮源、无机盐。二、微生物的基本培养技术(3)特殊需求:1.培养基的配制二、微生物的基本培养技术满足微生物对________________________的需求。④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；③培养细菌时，需要将培养基调至_____________；维生素酸性中性或弱碱性无氧pH、特殊营养物质、氧气（1）无菌技术的概念:（2）手段:主要包括______和______。防止杂菌污染消毒灭菌泛指在培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法。获得纯净的微生物培养物的关键

。①消毒:

指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。②灭菌:

指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。P10“相关信息”:生物消毒法是指利用生物或其

除去环境中的部分微生物的方法。代谢物2.无菌技术二、微生物的基本培养技术类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物(不包括芽孢、孢子)强烈的理化方法，杀死所有微生物(包括芽孢、孢子)煮沸消毒法日常生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min（3）消毒与灭菌的比较接种室、接种箱，超净工作台①对实验操作的_____、操作者的__________，进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的_____、_________和_______等进行灭菌。空间衣着和手器皿接种用具培养基（4）消毒和灭菌工作的两个方面:注意:避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。

无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？还能有效避免操作者被微生物感染。2.无菌技术二、微生物的基本培养技术（1）培养物、纯培养物、纯培养的概念:①培养物:在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物；②纯培养物:由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。③纯培养:获得纯培养物的过程就是纯培养。分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。（2）菌落的概念:（3）特征:（4）功能:鉴定菌种的重要依据大小、形状、颜色、隆起程度等。3.微生物的纯培养二、微生物的基本培养技术培养基灭菌:

;培养皿灭菌:

;(5)酵母菌纯培养的操作步骤：配制培养基：灭菌：倒平板：制备培养基湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法干热灭菌去皮马铃薯200g,切成块加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂用纱布过滤用蒸馏水定容至1000ml加入20g葡萄糖15-20g琼脂待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。等待平板冷却凝固后才能进行3.微生物的纯培养二、微生物的基本培养技术[易错提醒]

(1)培养基要冷却至50℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，温度过低培养基会凝固。(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(5)取菌种、划线操作都要在酒精灯火焰旁的无菌区域进行。平板划线法方法：原理：接种和分离(3)酵母菌纯培养的操作步骤：对照组：实验组：培养酵母菌未接种平板倒置培养接种平板倒置培养单个细胞微生物群单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖结果分析①在未接种的培养基表面是否有菌落生长②在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，③如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。一、微生物的基本培养技术3.微生物的纯培养下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：(1)平板划线操作的正确步骤是：

。⑥⑤①②④③⑦①③②④⑤⑥⑦1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。4.平板划线法二、微生物的基本培养技术(2)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上原有微生物。杀死上次划线残留菌种,使下次划线菌种直接来自上次划线末端杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。4.平板划线法二、微生物的基本培养技术⑤在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线以免接种环温度太高，杀死菌种。第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌12345①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次(3)平板划线法在划线时注意哪些问题？④划线后,培养皿倒置培养②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灼烧灭菌，待冷却后再开始画线4.平板划线法二、微生物的基本培养技术4.平板划线法(4)第二次及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。二、微生物的基本培养技术4.平板划线法(5)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。二、微生物的基本培养技术【检测】自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：(1)对培养基进行灭菌时，多采取

法，而对接种环或涂布器灭菌时则用

法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧

次。平板划线在做第二次及其以后的划线操作时，要从上次划线的

开始划线，最后一次划的线不能与第一次划的线

。湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)灼烧灭菌6末端相连(2)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中____培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了

。倒置作为对照组，检验培养基是否被杂菌污染【检测】请回答下列与大肠杆菌有关的问题：(1)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。成分蛋白胨乳糖蔗糖K2HPO4显色剂琼脂含量10.0g5.0g5.0g2.0g0.2g12.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL该培养基属于

(填“固体”或“液体”)培养基，该培养基中的氮源是

。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行

(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需要进行清洗和

。固体蛋白胨灭菌消毒(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管扎成一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入

中灭菌，温度为121℃，时间为15～30min。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到大气压时，将试管取出。(4)从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯__________________(填“火焰的不充分燃烧层”或“火焰的充分燃烧层”)灭菌，并且待接种环

后蘸取菌种。高压蒸汽灭菌锅火焰的充分燃烧层冷却三、微生物的选择培养和计数1.选择培养基(1)概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基不加氮源自养微生物酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)固氮微生物加入青霉素加高浓度食盐金黄色葡萄球菌石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物不加碳源(2)举例：加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落选择培养基培养基+氨苄青霉素培养基

没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?影印法接种怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置完全培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照，若完全培养基中生长的菌落数均多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性；三、微生物的选择培养和计数1.选择培养基编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml(1)上表培养基可培养的微生物类型是

。(2)若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

。(注:加高浓度食盐可培养金黄色葡萄球菌)自养型微生物

含碳有机物

【检测】下表是某微生物培养基成分，请据此回答:(3)若除去成分②，加入(CH2O)，该培养基可用于培养

。固氮微生物

1mL1×1061×1079mL无菌水在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。2.微生物的选择培养通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。(1)系列稀释操作：1×101mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×10590mL无菌水10g①铲取土壤，将样品装入纸袋中三、微生物的选择培养和计数③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。微量移液器(2)稀释涂布平板法操作2.微生物的选择培养三、微生物的选择培养和计数待涂布的菌液被培养基吸收将平板倒置30～37℃恒温培养1～2d后进行计数培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养为什么？培养未接种的培养基的作用是对照。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照(2)稀释涂布平板法操作2.微生物的选择培养三、微生物的选择培养和计数平板划线法和稀释涂布平板法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法纯化原理通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞主要步骤平板划线操作系列稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器(1)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)3.微生物数量的测定①原理：②计数原则:三、微生物的选择培养和计数当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。一般选择菌落数为30～300的平板进行计数；在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值。适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；原因:当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(缺点)(1)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)3.微生物数量的测定三、微生物的选择培养和计数③原理：用稀释涂布平板法计数微生物时,为了使结果接近真实值,应设置三个或以上的平板,计算菌落平均数。另外,要求选择菌落数在30~300的平板进行计数。解题时注意以下情况:(1)只得到1个菌落数在30~300的平板是错误的,原因是不符合实验的重复原则,易受到偶然因素的影响。(2)得到3个或3个以上菌落数在30~300的平板,也不一定正确。①不同平板间差异较大,如得到3个平板,菌落数分别为230、34、240,虽然菌落数均在“30~300”之间,但是“34”与“230”“240”差距太大,所以应找出原因,重新实验。②不同平板之间差异不大,是符合要求的,用其平均值作为估算的最终结果。由此可见,并不是只要得到3个或3个以上“菌落数在30~300的平板”即可,而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30~300的平板”且无较大差异,说明实验操作合格,才能按照计算公式进行计算。稀释涂布平板法计数微生物的注意事项3.微生物数量的测定原理：方法：缺点：(2)显微镜直接计数法三、微生物的选择培养和计数利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。细菌计数板计数法血细胞计数板计数法统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。③为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。④某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)，那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是

个/mL，稀释倍数为10的锥形瓶中细菌的浓度为

个/mL，所以每克样品中的细菌数是

个。2.34×1032.34×1082.34×109每g样品中菌落数＝M代表稀释倍数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)⑤计算公式:3.微生物数量的测定三、微生物的选择培养和计数4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)实验原理①士壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶；②配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）提供无机盐；调节pH②制备牛肉膏蛋白胨培养基(2)培养基的制备三、微生物的选择培养和计数CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2(3)实验流程土壤取样样品稀释涂布平板观察培养菌落计数三、微生物的选择培养和计数①取样地点要求:酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。②取样过程:铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。③注意事项:

取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。测细菌数：一般用104、105、106稀释液。测放线菌：一般用103、104、105稀释液。测真菌数：一般用102、103、104稀释液。样品稀释涂布平板观察培养菌落计数土壤取样(3)实验流程三、微生物的选择培养和计数不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。

在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。土壤取样样品稀释涂布平板观察培养菌落计数①每个浓度至少设置4个平板选择培养基（平行重复）牛肉膏蛋白胨培养基②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。接种：稀释液涂布平板法(3)实验流程

微生物的分离与计数实验中两种对照组的设置及作用(1)判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。(2)判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。三、微生物的选择培养和计数(3)实验流程通用型培养基上所有菌种都生长选择培养基上部分菌种才能生长土壤取样样品稀释涂布平板观察培养菌落计数不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基判断选择培养基是否具有筛选作用③设置两个空白对照：以验证培养基中是否含有杂菌三、微生物的选择培养和计数土壤取样样品稀释涂布平板观察培养菌落计数(3)实验流程三、微生物的选择培养和计数①培养条件:不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。②观察:每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。土壤取样样品稀释涂布平板观察培养菌落计数稀释度104105106107123平均值123平均值123平均值123平均值菌落数/平板当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数:(3)实验流程三、微生物的选择培养和计数放入37℃恒温箱中培养1～2d稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照恒温培养箱土壤取样样品稀释涂布平板观察培养菌落计数(3)实验流程三、微生物的选择培养和计数(4)结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染选择培养基中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养基中混入其他氮源选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近三、微生物的选择培养和计数

拓展——分解尿素细菌的进一步鉴定1.原理

细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。2.方法

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：(1)液体培养基可以直接看液体的变色情况；(2)固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的(1)分离方法与原理5.分解纤维素的微生物的分离鉴定原理：纤维素刚果红红色复合物纤维素酶红色消失现透明圈纤维素分解菌红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。三、微生物的选择培养和计数纤维素分解菌的筛选与鉴定方法:这种方法通过颜色反应直接对微生物进行筛选与鉴定。刚果红染色法我们就可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

挑取产生明显透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。5.分解纤维素的微生物的分离三、微生物的选择培养和计数C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染【检测】(2021•山东卷)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是()半固体培养基A.乙菌的运动能力比甲菌强B.为不影响菌的运动需选用液体培养基B由图可知，甲菌和乙菌的试管中均有黑色沉淀，即均产生了硫化氢，虽然甲菌产生的沉淀颜色更深，但乙菌发生了扩散，沉淀分布不集中，不能直接仅凭颜色深浅比较出两种菌产生硫化氢的量【检测】某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用

的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是

。甲、乙培养基均属于

培养基。湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)琼脂选择(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释

倍。104(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是

(答出1点即可)。S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：____________________________

_________________________________。取淤泥加入无菌水进行梯度稀释,涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即

。水、碳源、氮源和无机盐1.发酵工程的概念发酵工程是指利用

的特定功能，通过

，规模化生产对人类有用的产品。微生物现代工程技术四、发酵工程及其应用接种灭菌发酵罐内发酵分离提纯产物获得产品选育菌种扩大培养配制培养基中心环节2.发酵工程基本环节灭菌选育菌种扩大培养配制培养基2.发酵工程基本环节接种发酵罐内发酵分离提纯产物获得产品获得更多的菌种①从

中筛选②通过

，

获得自然界诱变育种或基因工程育种在菌种确定后选择原料，反复实验确定培养基配方培养基和发酵设备都必须严格灭菌无菌条件①了解发酵进程:随时检测培养液中的__________

等②及时添加必需的营养组分③严格控制

等发酵条件微生物数量、产物浓度温度、pH和溶解氧①发酵产品是微生物细胞本身：在发酵结束之后，采用

等方法将菌体分离和干燥②发酵产品是代谢物：根据产物的性质采取适当的提取、

措施来获得产品过滤、沉淀分离和纯化选择发酵工程用的菌种时，需要考虑的因素有？

在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；产量高；发酵条件易控制；菌种不易变异、退化等四、发酵工程及其应用培养物或营养物质的加入口观察孔取样管电动机排气管pH计冷却水排出口冷却夹层发酵液搅拌叶轮生物传感器装置空气入口温度传感器和控制装置冷却水进入口阀门放料管编号主要用途A区B区C区D区控制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程。取样器也可以通过取样判断发酵状态和程度。通过控制冷水流速调节罐温电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热。调节罐压发酵罐示意图及功能介绍四、发酵工程及其应用发酵7消毒8终止大麦种子发芽，释放淀粉酶。加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。淀粉水解形成糖浆。产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。酵母菌将糖转化为酒精和CO2杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。过滤、调节、分装啤酒进行出售。发芽12焙烤3碾磨4糖化蒸煮5主发酵后发酵63.啤酒的工业化生产流程四、发酵工程及其应用（1）发酵工程的特点①生产条件温和:温度、压力都不高。②原料来源丰富且价格低廉:微生物种类多,易分离。③___________:可直接生产某种物质。④废弃物对环境的污染小且容易处理:废料是各种代谢产物,只要灭菌后,一般对环境不造成污染。产物专一4.发酵工程的应用四、发酵工程及其应用4.发酵工程的应用四、发酵工程及其应用(1)在食品工业上的应用a.生产传统的___________。①下图为啤酒的工业化生产释放淀粉酶糖浆酒精和二氧化碳低温、密闭②利用黑曲霉发酵生产酱油、利用酿酒酵母生产各种酒类淀粉酶失活

终止酶的进一步作用大多数微生物发酵的温度和发酵的时间随啤酒品种和口味要求不同有所差异。b.生产各种各样的_____________。c.生