教案第11章生物芯片

1、 长 沙 医 学 院 教 案课程名称生物信息学授课题目（章节或主题）第11章 生物芯片授课教师唐亮所属系（部）基础系所属教研室生技教研室职称助教授课时间 年 月 日第 周星期 第 节第 次课授课时数2学时授课班级 生物技术专业（本科 专科） 2010 级 1 班教学课型 理论课 实验课 见习课 习题课 讨论课 其它教材名称、作者、出版社及出版时间生物信息学概论，罗静初等译，北京大学出版社教学目的要求：对生物芯片作了简要介绍，从生物芯片的分类、基本原理几个角度学习生物芯片有关的基本知识重点与难点：重点：芯片基本原理难点：芯片操作技术 教学方法（请打选择）：讲授法 讨论法 启发式 自学辅导法 练习

2、法(习题或操作) 读书指导法 （以问题为中心的教学法） 其他教学手段（请打选择）：板书 实物 标本 挂图 模型 投影 幻灯 录像 CAI（计算机辅助教学）教学过程设计和教学内容：生物芯片(Biochip) 又称微阵列(microarray)。这一名词是20世纪80年代初提出来的，把有机功能分子或生物活性分子进行组装，构建微功能单元，实现信息的获取、储存、处理和传输功能。真正的生物芯片出现于20世纪90年代，DNA微阵列技术自1995年诞生之时，就被预言为具有划时代意义的技术，将从根本上改变生物科技的面貌。生物芯片将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程（如样品制备、化学反应和分析测试），利用微

3、电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之集成化、微型化。生物芯片主要是指采用光导原位合成或微量点样等技术，将大量生物分子如核酸片断、多肽片断、组织切片、细胞等有序地固定于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺、尼龙膜等）的表面，组成密集、有序的二维分子阵列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。微阵列的主要应用在于对基因表达问题的研究，特别是从全基因组水平定量或定性检测转录产物mRNA。通过对该数据矩阵的分析，可以回答一系

4、列的生物学问题：基因的功能是什么？在不同条件或不同细胞类型中，哪些基因的表达存在差异？在特定条件下，哪些基因的表达发生了显著变化，这些基因受到哪些基因的调节，或控制哪些基因的表达？微阵列广泛应用的另一个重要原因是为了理解基因网络（network）或通路（pathway）。微阵列可以在单一芯片上同时监测整个基因组的变化，因而可以同时理解成千上万个基因之间的相互作用，对整个表达谱有一全面理解。生物芯片会对21世纪的生命科学和医学的发展产生巨大的影响，可以大大促进后基因组计划的各项研究。通过比较不同个体或物种之间以及同一个体在不同生长发育阶段，正常和疾病状态下基因转录及其表达的差异，寻找和发现新基因

5、，研究它们在生物体发育、遗传、进化等过程中的功能。生物芯片还将在研究人类重大疾病如癌症、心血管病等相关基因及其相互作用机理方面发挥重要作用。在预防医学方面，生物芯片可以使人们尽早认识自身潜在的疾病，并实施有效的防治生物芯片的分类1、根据支持介质划分2、根据制备方法划分3、根据芯片上固定的探针划分几种常见的生物芯片1、基因芯片基因芯片称DNA芯片（DNA Chip）或DNA微阵列（DNA microarray）。基因芯片这一技术方法是1991年首次提出的，该技术将成千上万的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交等技术复杂、自动化

6、程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列（array），还可以用于序列分析，称为杂交测序（SBH）。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快速、准确的分析基因的能力，在基因功能研究、基因诊断及药物筛选等方面显示了巨大的威力，被称为是基因功能研究领域的最伟大发明之一。基因芯片以其高通量、并行检测等特点适应了分析人类基因组计划对海量生物信息提取、分析的需要。深入研究基因突变和基因表达的有效方法的需求是基因芯片发展的动力。由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点，诞生以后就受到科学界的广泛关注。2、蛋白质芯片蛋白质芯片，又称蛋白质微阵列（protein micr

7、oarray）是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列，是在一个基因芯片大小的载体上，按使用目的的不同，点布相同或不同种类的蛋白质，然后再用标记了荧光染料的蛋白质结合，扫描仪上读出荧光强弱，计算机分析出样本结果。从理论上讲，蛋白质芯片可以对各种蛋白质进行检测，弥补基因芯片检测的不足，不仅适合于抗原、抗体的筛选，同样也可用于受体配体的相互作用的研究，具有一次性检测样本巨大、相对低消耗、计算机自动分析结果以及快速、准确等特点。许多功能蛋白质还有翻译后修饰和加工，如磷酸化、羰基化、乙酰化、蛋白质水解等修饰，直接进行蛋白质分析是蛋白质组研究领域的重要内容。3、组织芯片组织芯片是将多种组织切片代替核酸或

8、蛋白质，按照一定顺序固定在玻片上。其优点在于可以原位检测信号发生的位置，缺点是切片较大，因而不能在一张片子上大规模固定多个样品。同时，由于组织切片的样品来源很不稳定，每张玻片之间都不相同，重复性和稳定性一直是一主要问题。不过，将芯片概念引入免疫组化和原位杂交中确实是一概念和技术上的突破。基因芯片的基本原理基因芯片基本原理和基本流程基因芯片的基本原理包括两种模式：一是将靶DNA固定于支持物上，适合于同一探针对不同靶DNA的分析；二是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。基因芯片的基本流程基因芯片技术包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测和结果

9、分析。首先提出基因芯片所要解决的问题，确定研究目标，例如，研究基因的SNP。检测或分析DNA的变异或者进行基因差异表达的研究。根据所要解决的问题，选择一组特定的基因对象。其次，根据所选择的基因序列，设计探针序列以及探针在芯片上的分布。然后根据设计结果制备基因芯片，制备方法大致分为在片合成法和点样法。接下来就是对靶基因即待测样品进行扩增和标记，然后进行杂交实验，并对基因芯片的杂交结果进行检测，最后根据获得的荧光图谱，进行数据处理分析，报告检测结果，并将相应的数据存入数据库。生物芯片的应用生物芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它是集微电子学、生物学、物理学、化学、计算

10、机科学为一体高度交叉的高薪技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于使用该技术可以将大量的探针同时固定于支持物上，所以可以对大量生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。使用该技术有多种不同的应用价值，如测序、基因表达谱测定、基因诊断、药物筛选等。为后基因组计划时代基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具，将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，为人类社会带来巨大变革。测序采用生物芯片测序方法有芯片毛细血管电泳测序和寡核苷酸微阵列杂交测序两种。1999年，加利福

11、尼亚大学伯克利分校Mathies小组首先报道芯片毛细血管电泳测序结果。他们在10分钟内完成了对433个碱基对序列的测定工作。用芯片测序的另一种方法是寡核苷酸微阵列测序法，又称杂交测序法（Sequencing by hybridization，SBH）。所谓SBH，就是利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱从而排列出待测DNA的序列顺序。SBH的原理可以通过下面的例子来说明，设有DNA片段AGCCTAGCTGAA，探针为所有的8核苷酸（48=65536种）。将待测DNA和探针按一定比例在适宜温度下混合杂交，完全匹配的序列有5种，TCGGATCG，CGGATCGA，GGATCGAC，GATC

12、GACT和ATCGACTT。这些探针只相差一个核苷酸，由它们可得到待测DNA的互补序列为TCGGATCGACTT，待测DNA序列为AGCCTAGCTGAA。最初SBH法是在液相中进行的，因此杂交信号的读取非常困难，而且限制了序列分析的速度。采用DNA探针阵列方法有较大优越性。把一组寡核苷酸探针有序地排列在硅、玻璃等基片表面，组成一二维阵列。在这一阵列中，每一探针都有确定的坐标位置，只要确定了位置就确定了探针，探针与待测DNA杂交，冲洗去非特异性DNA，检测在哪些位点上有杂交信号。再通过一定的计算就可以得到待测DNA的序列。Mark Chee等用含个寡核苷酸探针的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BR

13、CA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，揭示了二者有高度相似性。目前SBH还存在若干问题，有待进一步改进。比如，由于众多寡核苷酸组成各不相同，很难找到最佳杂交条件。错配问题，特别是G-T和G-A，难于检测。SBH不适合于重复序列和简单序列单元DNA的测序等。基因表达分析由于DNA芯片技术可直接检测mRNA的种类及丰度，因而成为研究基因表达的有力工具。检测基因差异表达的操作流程见图8-1。cDNA微阵列是在1995年由斯坦福大学率先研制成功并应用于基因表达分析的。首先将细胞内的mRNA逆转录成cDNA并分离，然后将分离得到的所有

14、或部分cDNA（其长度通常大于200bp)作为探针，用机器手按照阵列的形式点到玻璃片上。玻璃片上的每一个点只包含一种cDNA分子，这样就制成了cDNA微阵列。一般，探针的序列是已知的。在使用cDNA微阵列时，首先提取组织或细胞系中的mRNA样本，逆转录成cDNA并用荧光素标记；然后把标记混合物加到cDNA微阵列上，与探针杂交，杂交过程完成后，清洗微阵列；最后用激光扫描仪扫描并获取荧光图像，对图像进行分析，得到cDNA芯片上每一个点的荧光强度值。荧光强度值定量地反映了样本中存在的与探针互补的mRNA丰度，也就是反映了探针所对应基因的表达水平。基因诊断基因芯片目前最主要的应用之一就是疾病诊断。从正

15、常人的细胞中分离出mRNA后与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的细胞中分离出mRNA后与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过分析比较这两种图谱，就可以得出病变的mRNA表达的信息，即DNA突变发生在何部位，属于什么样的序列突变。药物筛选如何分离和鉴定药的有效成分是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大问题，基因芯片是解决这一问题的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再以cDNA表达文库得到的肽库来制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。利用RNA、单链DNA

16、有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利于与靶分子相结合的特点，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白结合，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此，芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中有广泛应用。数据处理和分析数据处理丢失数据和极端值的处理丢失数据（missing data）和极端值（outlier）是微阵列实验中数据质量控制（quality control )的两个基本问题。数据丢失的原因很多，包括分辨率不够、图像失败或只是由于芯片上的灰尘或划痕所引起。数据丢失还可能由于自动化方法中的系统误差产生。cDNA微阵列中数据丢失的含义是由

17、于空点（empty spot），其荧光强度为零，或者由于其背景强度高于样品点。最简单的数据替换方法是根据同一芯片上其他点的情况进行统计分析而得到一个预计值。对于双色cDNA微阵列，如果某个基因有重复点，这些点的平均值可用来代替丢失数据。如果没有重复点，可用统计方法预测丢失数据（如EM算）。一种简易方法是计算该样品点用不同染料标记时在整个芯片强度的分布位置，并以此为参照，推算出相应位置上的丢失值而加以替换。极端数据是指那些偏离群体的数据。微阵列实验中，极端值的出现和消除可在不同水平。极端值可在一块芯片上出现，但重复片子上不出现；也可以是同一片子上某个基因的重复点，而不管这些重复点邻近与否；还可以

18、是同一片子上任意点所产生的偏离近与否；还可以是同一片子上任意点所产生的偏离。现有微阵列技术中，多种因素可导致不同芯片间的变异性。已有不同方法减少这些芯片间的变异和系统误差（如下文将要叙述的正态化）。同一类型的芯片中，那些变异性大的片子应当去除，这种片子又称极端片子（outlier slide）。片间变异可能由于点样浓度和体积、加到芯片上的标记靶分子数目、杂交条件和其他因素等所引起。最简单的去除极端片子的方法是靠视觉观察图像。一种简单而有效的消除方法是通过提高实验自动化程度而消除。另一种去除极端片子的方法是如前面实验设计中讨论的那样，进行重复性实验，并用统计方法评估片间变异。重复片子上对应的基因可得到相关系数。这种方法中，至少需要3 次重复才能评估芯片质量和剔除极端片子。所用的方法是计算两两配对（pairwise）相关系数。这时，需要设置一个相关系数界值，依实验设计而定，但通常必须大于0.9。通过两两配对，分别得到各相关系数值。通常情况下，相关系数都比较高且差别不大。如果两个相关系数值远远低于另外一个，常表明存在极端片子。如果所有相关系数都很低，表示微阵列的质量差，这不是极端值的范畴，而需要重新设计和制作芯片。用课件讲授；用多媒体教学。背景基本概念主要应用广泛应用的主要原因展望学习几种常见生物芯片的基本概念、主要应用图示演示图示基本流程举例流程图演示重点讲述时间分配10min1