提取RNA原理及其常遇到的问题

1、RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下

2、DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。0 i2 O) 7 e1 S& P4 K8 l$ ?4 |实验步骤： 破碎组织分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA。 Q8 E+ S9 a+ v1 m7 i+ / SV1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入-ME可以抑制RNA酶活性。2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）

3、或异丙醇。; o: T, R7 d7 E4 ?& e. 5 d6 u4、 洗涤RNA使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。8 f+ V4 g# V% ?0 c7 g* u5、 融解RNA一般使用TE。5 , O6 L7 w) C2 L- ?) 5 r6、 保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保

4、存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000g离心5分钟。3 f: E# T6 Co9 j9 G* i% g5 氯化锂法提取总RNA：( x; L/ z+ 9 R/ _4 j1 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快

5、速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。试验试剂： 1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】试验步骤：, E0 y8 , ? W1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入510ml氯化锂尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。2、 匀桨液在04放置4小时后，12000g离心

6、30分钟。3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液，重复步骤2。4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置1530分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。% K+ / m/ a3 F8 f* 5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，20放置1小时，5000g离心。) h9 y, V4 a4 V0 i8 q: K+ k4 X( c6、 70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 % h, j/ D! z; W( R# 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于70保存。9 K2 J+ j3 M1 植物RN

7、A提取过程中难点的相应对策酚类化合物的干扰及对策：许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的

8、酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。防止酚类化合物被氧化的方法：9 r3 W. Z3 J) T6 h5 a1、 还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是

9、一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。# A& B5 x4 Q. V) n( 2、 螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CON基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低11。当原花色素类物质量较大时，单

10、独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。& l4 k- j8 ( * B7 M, R- _4 V# h3、 Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lpez-Gmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（0.2M）则会影响RNA的回收率。4、 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提

11、高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。5、 丙酮法：Schneiderbauer等用-70的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。酚类化合物的去除 ：通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50 2-丁氧

12、乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。! w- P$ 6 P! W. i9 o1 i多糖的干扰及对策：+ t; r- l8 Q/ v- z3 ? b: |) |多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污

13、染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度1030，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取R

14、NA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时

15、，是将上述两种方法结合使用。如Lpez-Gmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。- I) r& z9 _7 g7 c9

16、b+ A. q蛋白杂质的影响及对策：7 v+ w) p# Y& O蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，

17、因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。次级代谢产物的影响及对策：nU* N1 F- F. S+ L2 Z* L& X1 x从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwi

18、n的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料

19、RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法多酚类植物的RNA提取：8 F2 a+ f2 B+ i 苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。实验试剂：- U2 t+ J $ |5 H) V4 b) l7 提取buffer 200ml：NaCl 1.1688g 100mMTris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0) EDTA 5.8450g 10mM SDS

20、2.0000g 1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.7 Y( / X3 0 r; aa% k8 p4 A试验步骤：/ Q* 9 O2 P3 c& Z5 ev1、 1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。2、 4度12000rpm离心15min, 上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。3、 取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.4、 12000rpm离心10min。5、 沉淀用70度乙醇洗。2 R ?+ j& R- V& R7 E6、 8000rpm 5m

21、in。7、 沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。& HP# w5 l- m银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而Shujun Chang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。试验试剂：1、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用浓盐酸调至Ph8

22、 .0，定容至lOO mL.用灭菌的DEPC水溶解。2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA H 2O加入80m L水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。0 U I3 e1 f g3、 10 mol/LLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL水溶解即可。- l& bc2 d* * u9 s4、 提取缓冲液(DEPC水处理):2% CTAB（蛋白质变性剂）.2% PVPK 30（去除多酚类物质）10 0m M Tris-HCL (Ph8.0)25 m M EDTA（金属鳌合剂）2.0 M NaCL（去除多糖和CTAB）配法:2 g CTAB, 2 g

23、PVP, 10 mL 1 mol/L tris, 5mL 500 mM EDTA, 11.7gNaCL,定容到100mL。5、 亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）- V* H) Y5 |& ?, u* q6、 4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）7、 氯仿异戊醇(24: 1)（抽提蛋白质）! m/ w: |# ( h P7 U7 l8、 10 MLiCL（沉淀大分子RNA）9、 SSTE（溶解RNA）1.0 M NaCL0. 5%SDS1m MEDTA(PH8.0)10 m MTrisHCL(pH8 ）配法:2.9 g NaCL, 0.25 g SDS, 0.5 mL 1 M

24、tris, 100 u L 500 mM EDTA, pH8.0,定容至50 mL。试验准备：1、 研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200以上向温烘烤2小时以上，或180*C 高温烘烤4小时。; w1 n q( G- F L9 B2、 塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121C高压灭菌，灭菌40 min，或连续两次121C高压灭菌，每次灭菌20 min，然后用烘箱烘千。3、 所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPC uJ浓度为0.1%, 37过夜，1211C高压灭菌40 min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。)- e; ! t;

25、 U2 R DG w试验步骤： W; E Y* X8 i2 T【根据文献(Shujun Chang, 1993) CTAB法，稍作改进。】M z5 S6 a) a, I6 m$ Q3 x1、 将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。2、 用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6 o7 H! zV+ D1 C/ E% x3、 65，水域1 min后冷却至室温。( 8 / * Y# . e% 4、 加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X1

26、7 (2=L: 1)，混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。& V# j. c+ S/ K/ a$ N7 5、 小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24: 1),混匀，10000rpm, 40C,离心10 min。+ k3 & o1 H0 N6、 吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4沉淀过夜，然后10000rpm离心20 min。2 L. j7 q- f5 e! s/ s7、 用枪吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，转到1.5m L离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。4 6 ) y8 M$ * s# k0

27、 M8 G8、 离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。9、 12000rpm, 40C,离心20 min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。10、 用40 u LDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。( d- o$ P9 Y O8 K11、 除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70冰箱保存备用。7 T( 3 ?( V+ X& |6 Y) T9 m9 R改良Krapp提取法：) b: 8 0 _9 d& Q6 T- . m# T, Y试验试剂：- O7 J. G7 L4 j b) ?3 R1、 RNA抽提掖：母液：4mol 异硫氰酸

28、胍 20mmol EDTA20mmol MES pH 7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4条件下备用。! # k, v1 s# o6 w1 Y2、 RNA重悬液：2mol LiCl10mmol NaAc调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4条件下备用。试验步骤：1、 取新鲜植物材料0.51g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。9 k% P1 |, |, g! e6 Q2、 4条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4条件下8000rpm离心10

29、min。3、 上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4条件下8000rpm离心10min.）。 T7 gu: K4 DJ% * d6 S, P% o! |4、 小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80条件下沉淀2小时。5 / s3 W; E1 w M6 c5、 在4条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4条件下1小时。. T u0 G$ o* E6、 4条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理

30、水中。检测后分装，置于-70条件下保存。一些特殊组织的RNA提取) H- G3 B8 O7 $ e) F s1、 纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，单位重量的组织RNA的含量就少，建议用尽可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纤维组织终RNA，由于纤维组织终RNA含量较少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中将组织彻底磨碎，同时适当减少溶解RNA的溶液体积。9 t3 |5 q t9 Tm) 4 K$ d% S2、 蛋白/脂肪含量高的组织：X* j& c$ e; $ S% y动物的脑和某些特殊的植物组织中，脂肪或者蛋白

31、的含量很高，可以采用TRNzol来提取此类样品中的RNA。在该提取过程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮状物，必须用氯仿再次对上清进行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的组织中RNA时，使用氯仿抽提后会分成油滴、水相（含RNA）、DNA中间层、有机相四层，应用移液管小心吸取水相液体，避免吸到油滴层和DNA层。; L6 u; z* i6 p3、 核酸/RNase含量高的组织：& - p- 7 F6 r2 p( ( B脾、胸腺、胰脏等组织的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨组织，再快速匀浆。如果裂解液太粘稠（因为核酸含量高的缘故），酚/氯仿抽提不能有效分层，可以加入更多裂解液以解决此类问题。

32、如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成则表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。4 z/ u& G! m3 R8 4、 植物组织和真菌组织：/ W/ _* O/ L1 g% E植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，因此为了避免出现内源酶作用使 RNA降解的现象，一般选择在液氮条件下对植物或者真菌材料进行碾磨。如果降解问题不能解决，基本上是由于样品中的内含杂质导致。许多植物和真菌中的内含杂质如多糖、多酚等都会残留，因为这些杂质分子与RNA有一些相似性，可以与RNA同时沉淀或者吸附，因此在植物和真菌组织的RNA提取过程中，需要用一些特别的步骤或者特别的试剂（RNApla

33、nt）来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。RNA纯化& h- ?H* J7 M& L& B试验步骤：& 7 U B S( d, d0 g/ M用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚，先加入酚后加入氯仿。1、 核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿（如有20ul样品，则加入10ul酚10ul氯仿）。$ U0 S & b( 2、 旋涡混匀管内容物，使呈乳状。3、 12000g室温离心15秒。4、 水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。5、 重复步骤14步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止4 d, + RM2 j$ k(

34、 Y/ x6、 按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。 M d2 t8 hO7、 28度，离心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）。$ n+ X0 I1 r/ b, F8 V t8、 上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次（用200ul枪加小心），室温静置10min。( lL, t0 b 9、2-8度离心，10500rmp/min,10min,弃上清。; I; b. D9 h0 |10、 RNA洗涤：75酒精（这次用的100。未影响）1ml沉淀，轻轻弹其底部（直接放入70度冰箱可以长期保存，静置几秒钟。11、

35、 28度离心，8500rpm/min,5min ,弃上清。12、 取出滤纸，将EP管敞开放在滤纸上，管口向酒精灯（不要完全干燥，不好溶解）。13、 ?DEPC水溶解（30ul,可变），分装,2ul电泳，2ul比色，其余5ul分装至于手套中冻于20度中。植物组织mRNA提取) u0 : |8 A# U6 B% Y由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。8 ?6 M- k; m$ 4 D

36、实验步骤：* H2 s. U/ o b* n. A1、 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 ! n h) Y5 U1 y1 C+ f2、 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 0 X. H2 a% w9 _; B3、 用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、 将提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积

37、的1x层析柱加样溶液。5、 测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。6、 测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。* O7 a) u0 F6 J9 D s+ E7、 加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -2030分钟。8、 4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4下12000g离心5分钟。* 4 w5 X7 Z& a2 G4 9、 小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。/ FE9 r) f) B10、 用少量水

38、溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70）。注意事项：9 K L8 4 e, w& C7 L. iz1、 mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。2、 oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。mRNA纯化& ?5 H8 U3 G5 K6 MmRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素

39、柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。( O- Y. HD1 e: T/ W2 t寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA：试剂试剂：) w& l! i/ h! y8 p& L1、 3M醋酸钠（pH 5.2）2、 0.1M NaOH3、 1上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母

40、液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65时，加入经65温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。/ Sz( V% a4 l* x4、 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5、 无水乙醇、70%乙醇6、 DEPC试验步骤：0 w! q3 f; O& M* G8 O- E1 y1、 将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。9 l6 p9 l) Z% X7 X& 2、 用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的

41、DEPC H2O洗柱。# f- i9 A- O: A S$ e7 2 U- v3、 使用1上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。3 N4 L4 k! f, _- C4 o/ C e% J* g4、 将RNA溶解于DEPC H2O中，在65中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5、 将所有流出液于65加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。 g# C r$ | n M6、 用5-10倍柱床体积的1上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管

42、中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。 F4 m2 z_ a. $ z7、 用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。) D% B2 D p4 H# 8、 OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20放置30min。) L. y& s! $ l( ?( t# H9、 4离心，10000g15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。注意：此时P

43、oly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4离心，10000g5min，弃上清，室温晾干。10、 用适量的DEPC H2O溶解RNA。 U- W1 x2 p. Q) M, t2 V$ q# n y0 q注意事项：|# W$ # Z, N& k! R% : C6 w1、 整个实验过程必须防止Rnase的污染。, L$ t5 h1 t7 V! A1 2、 步骤4中将RNA溶液置65中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的

44、结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3、 十二烷基肌氨酸钠盐在18以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18最好用LiCl替代NaCl。8 D: 5 h# b( r( T g4、 寡聚（dT）-纤维素柱可在4贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5、 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。RNA提取注意事项一些RNA提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。1、 在核酸提取时，为了增加细胞

45、的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。2、 有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到5060，并将反应时间缩短到1525min，但酶用量必须提高1020倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。/ K* t6 Y8 o, W8 T3、 许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚

46、类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。4、 许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。 克服多糖污染可采用以下一些办法1) CTAB多次抽提。2) 在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。! Af9 . y% M# 3) 在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异

47、丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。5、 在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。6、 在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。% d4

48、h8 * y7 a: _p4 Q7、 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。% u d8 h. G* A8、 在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，70下30min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的

49、更易降解。10、 核酸提取后可通过PCR 、RTPCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。11、 在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。防止RNA酶污染的措施：4 O7 m2 N- S% S: L1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。/ Gu. r2 C6 + L, b/ |4 M% F d2、 塑料器皿可用0.1

50、% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。; : y# S% a. a# r6 r6 4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6、 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。7、 DEPC能与胺和巯基

51、反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理8、 加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。6 E0 K8 u2 R$ M% V9、 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。 b) P Z- % f/ y2 t0 O/ X% P常用的RNA酶抑制剂：1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻

52、底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。3 l4 l$ k, ?. x% t2、 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3、氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。5 N1 4 X+ q& w/ v+ M. y. 3 4、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以

53、和多种RNA酶结合，使其失活。5、其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。附确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：3 Z |6 _) l! T% T按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中,保温1 h

54、。另一份放置在-20冰箱中保存1 h。取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。RNA提取常见问题分析) k& ( A. Z E3 V# U5 g用Trizol 抽提的RNA，用琼脂糖凝胶电泳，出现许多条带(至少四条以上)，是哪些原因导致的？参考见解： i2 Y6 R( t8 Y1 |7 j+ K1、 是从组织里抽的还是细胞抽的？组织的RNA电泳不理想，但目的条带仍能跑出来。细胞的电泳相当漂亮，但有时逆转录效果反而

55、不好。组织经常出现这种情况，组织抽提的RNA不纯，而且多多少少有降解。不过下一步可以接着做逆转录，可能对后面的实验影响不会很大。7 t% i% V- w |2、 是mRNA的话，这样的效果挺不错的。如果是总RNA，那是降解了。不过细胞的RNA应该不容易降解，可以上样少点再跑胶。3、 可以试试在70度加热5分钟,然后再跑跑电泳可能有意想不到的结果.- : Q0 6 ( V8 x, N; M4、 建再进行RNA精致的过程,也就是Trizol后,加氯仿,吸取上清尽量少吸,然后将其再按规程离心一次吸取上清后加入异丙醇,然后再用70%冰乙醇洗两次可见RNA,如果还是不行的话最好用柱式吸附柱将上清与70%

56、冰乙醇混合后过柱怀疑这种属于基因组DNA污染在操作过和的preeogress降解.所以一定要按规程进行抽提.6 - ) l# e; Y / B所有的准备工作如干烤、DEPC浸泡等均按分子克隆上说的处理了，可是就是提取不出RNA来。异丙醇沉淀后在管底也有乳白色的东西，用DEPC水溶解却溶解不了，很粘稠。电泳什么也看不见。用的组织是小鼠的肺和脾脏，TRIZOL用的是GIBCOL的。组织和TRIZOL的比例为每50mg用1ml TRIZOL。为什么？参考见解：乳白色的东西有可能就是RNA,一定要溶解,实在不行就在70%乙醇洗过后迅速空气干燥一下,加DEPC水,还溶解不了就65度加热10分钟.好象10

57、0mg组织加1mlTRIZOL足够了。在没有液氮的条件下，直接研磨组织成粉末再加入TRizol中，对RNA提取的质量会不会影响很大？或者在研磨过程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，这样可不可取？+ V& o4 o5 . q参考见解：在没有液氮的条件下，直接研磨组织成粉末再加入TRizol中，这样RNA早就没有了。- s+ k0 ?. Z+ M+ P: m; p要是在研磨过程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，可以观察组织,看研磨得什么样子了,磨的差不多时加trizol,可试一下,镜下观察然后确定加入trizol试剂。t1 _1 n* ? D$ n# 3 V用Tiangen的TRNzol提的月见草（柳叶菜科）叶片RNA，跑电泳结果发现RNA已经降解了。后换了烟草的叶片，同样的提取，出现18s,和28s的