分子生物学常用技术及其应用

1、第十二章,分子生物学常用技术 及其应用,序言,21世纪是生命科学的世纪！,生物技术是当今发展最快、最活跃、 对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。,世界各国政府高度重视生物技术,我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。,生物技术正在改变人们的生活和观念,随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的开展，借助计算机处理复杂信息的强大能力，21世纪的生物技术将会有更大发展，有些领域甚至可能有重大突破。,第一节 自然界的基因转移和重组,一、接合,二、转化,三、转导,四、转座,质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞,通

2、过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞获得新的遗传表型,病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞， 使后者获得新的遗传表型,DNA片段从染色体的某处移位到另一处。,重组的类型： 位点特异性重组 (site-specific recombination) 2. 同源重组 （homologous recombination）,四、基因重组(recombinant),不同DNA分子间发生的共价连接,同源区,机制,1. 同源重组（homologous recombination）,功能,1. 在减数分裂过程中，同源染色体之间 进行交换，形成生物个（群）体的多样性。,2. 是DNA损伤修复的重要机制之一。,

3、2. 位点特异性的基因重组 由整合酶催化，重组仅在特定的基因片段和位点上进行。 是免疫球蛋白多样性的分子机制。,第二节,基因工程的工具工具酶和载体,一、 常用的工具酶,(一)限制性内切酶(restriction endonuclease) -切基因工程的手术刀,功能：,识别双链DNA中特异序列，该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构，并在识别序列内或附近特异切割DNA，产生粘性末端或平末端。,根据需要在特定的位点精确切割 双链DNA分子,没有限制性内切酶的发现和应用，就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。,作用模式图：,1. 产生5突出粘性末端(sticky end),EcoR I,作用

4、模式图：,2. 产生3突出粘性末端,Pst I,作用模式图：,3. 产生平末端(blunt end),Alu I,限制性内切酶用途：,基因重组过程中切割DNA以获取目的基 因片段，切割载体形成切口，使目的基因能插入载体中。,2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms, RFLP)分析：遗传病的诊断，法医 DNA指纹分析等。,3.构建DNA的物理图谱，基因定位，DNA的 同源性分析等等。,(二)DNA连接酶(DNA ligase) 基因工程的缝纫针,将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组。,功能：,催化两条双链DNA

5、分子的互补粘性末端或平末端的5磷酸基团与3羟基形成磷酸酯键。,也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA，但效率很低。,如需连接单链DNA或RNA，则需用RNA连接酶。,DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。,DNA连接酶,EcoR I,DNA连接酶,作用模式图：,1. 连接粘性末端,作用模式图： 2. 连接平末端,Alu I,DNA连接酶,(三) 反转录酶(Reverse Transcriptase),功能：,以RNA为模板，以带3-OH末端的DNA片段为引物， 沿5至3方向合成DNA链。,3AAAAAAUCUGUCCUA5,dNTP Mg2+

6、,反转录酶,3AAAAAAUCUGUCCUA5,5TTTTTTTOH 3,AGACAGGAT3,1. RNA指导的DNA聚合酶活性：,5TTTTTTT,2. DNA指导的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H活性；DNA解旋酶活性等。,用途：,1. 反转录酶的最主要作用是以mRNA 为模板合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。,2. 以单链DNA或RNA为模板制备探针。,功能：,(四) 核酸酶S1,功能：,水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。,核酸酶S1,核酸酶S1,+,核酸酶S1,(四)核酸酶S1,用途：,1. 除去双链DNA的粘性末端以产生 平末端；

7、,2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构；,3. 分析RNA的茎环结构以及DNA- RNA分子的杂交情况等。,功能：,催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3-OH末端上。,底物是单链DNA或有3突出末端的 双链 DNA。,OH,5,3,Mg2+,dNTP,5,3,(A、G、C、T)n,nppi,5,3,OH,Mg2+,dNTP,nppi,5,3,(A、G、C、T)n,2.底物是平端或3 凹端的双链DNA。,5,3,Co2+,dNTP,5,3,(A、G、C、T)n,nppi,5,3,Co2+,dNTP,nppi,5,3,OH,OH,(A、G、C、T)n,用途：,1. 主要作用是在载体或

8、目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。,2. DNA 3末端的同位素标记。,(六) 核糖核酸酶H,水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。,RNA,DNA,核糖核酸酶H,DNA,用途：,功能：,用核糖核酸酶H部分水解mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，使未被水解的mRNA作为引物合成cDNA的第二链。,二、载体(vector),目的基因进入原核或真核细胞并高效复制 和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。,作为基因工程载体所需具备的基本条件：,1. 能自我复制，并具一定的拷贝数。,2. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定。,4. 带有强启动子，驱动目的基因在宿主 细胞内

9、高效表达。,3. 在适当的位置有单酶切位点，便于重 组操作。,1. 细菌质粒：最常用的用于目的基因克隆或 表达的载体。,2. 噬菌体： 主要用于构建基因组DNA或 cDNA文库。,3. M13噬菌体：专用于Sanger双脱氧DNA 测序,4. 粘粒：用于克隆大片段DNA。,5. 酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白。,6. 病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白。,基因工程载体的种类和用途：,(一) 质粒(plasmid),细菌培养,质粒扩增并表达蛋白质,大肠杆菌,染色质,质粒,定义:细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。,Am

10、pr,ORI,Tetr,pBR322质粒：一种克隆质粒,ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。,结构：,Ampr, Tetr：,两个抗性基因用于 筛选阳性克隆。,Pst I, BamH I：,两个单酶切位点用于插入目的基因,Ampr,LacZ,MCS,pfxBlue: 克隆质粒,MCS：Multiple Clonning Site,提供多个单酶切位点用于克隆操作,LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆,P(LacZ),MCS,Ampr,LacZ,pRS426：原核细胞表达质粒,P(LacZ)： LacZ启动子,用于在原核细胞驱动目的基因的表达。,pcDNA3：真核细胞表达质粒,Pcmv：,CMV增

11、强子/启动子,驱动目的基因在真核细胞内表达,BGH pA：加尾信号,目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。,(二) 噬菌体(phage),1. 噬菌体(phage),2. 粘粒(cosmid),3. M13噬菌体,1. 噬菌体,A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR,重组区,cos位点,cos 位点,A,R,A,R,EcoRI,目的基因,EcoRI,EcoRI,插入型,置换型,筛选标记： 蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬 菌体 分子量大小的75%至105%之间。,用途：,b.用于构建基因组或cDNA文库。,c.用于抗体

12、库或随机肽库的构建。,a.用作一般的克隆载体。,2. 粘粒(cosmid),组成：,2. 抗性基因；,1. 质粒复制的起始位点(ORI)；,3. 用于插入目的基因的单个酶切位点；,4. 噬菌体的cos位点。,可见，cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。,特点：,可插入长达2741kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。,加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将 粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。,粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体 的功能，而表现质粒的特性。,3. M13噬菌体,噬菌体 正链,复制,复制型 DNA,经pII蛋白 造缺口,3,5,经pII 蛋白 剪切

13、,释出单链DNA(正链),进入下 一循环,5,3,3,5,滚环复制,在细菌内的复制模式图,M13噬菌体几个重要特点：,1. M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降 低宿主细胞的生长速度。,2. M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。,3. 克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。,M13噬菌体用途：,1. DNA序列测定；,2. 制备单链DNA探针；,3. 用于定点突变的研究。,第三节,基因工程的步骤,基因工程的基本步骤,1.基因工程的上游技术：基因重组,+,+,连接,转化、筛选和鉴定阳性克隆,含重组子的阳性克隆,载体,目的基因,分、切、

14、接、转、筛,2. 基因工程的下游技术：,(1) 发酵工程,(2) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定,发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。,基因工程的基本步骤,一、 目的基因的制备分,(一) 人工合成法(也即化学合成法),本方法适用于分子量较小的目的基因 (100bp以内)。,缺点：,2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序 列推测，难于保证与天然基因序列一 致，往往导致表达效率大大降低。,1. 只能合成较小片段的DNA(100bp以内)。,(二)反转录法,本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。,(二)反转录法：

15、,方案：,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,重复上述步骤,扩增出大量的产物,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR),(三)直接从染色体DNA中分离,本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为：,1. 真核细胞染色体DNA有丰富的内含 子，在原核细胞中转录后不能剪接。,2. 真核细胞的基因多数为单拷贝，难 于分离到足够的目的基因。,根据染色体DNA的限制性

16、内切酶图谱，用合适的限制性内切酶切割染色体DNA，分离目的基因。,(四) 从基因文库(gene library)中获取,基因组文库：G-文库,cDNA文库： c-文库 (常用),方法：,基因文库,用目的基因上的一段 DNA做成探针与文库中的 DNA作核酸杂交，从基因 文库中“钓出”有目的基 因的克隆。,(一)粘性末端连接,用同一种或两种 限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,二、构建DNA重组体-接,本法适用于在质粒和目的基 因上有相同单或双酶切位点,(二)平末端连接,质粒,产生平末端的 内切酶,DNA连接酶,产生粘性末端 的内切酶,核酸酶S1,目的基因,重组质粒,产生粘性

17、末端 的内切酶,核酸酶S1,本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！,(三)用接头连接,用同一种 限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,+,+,DNA连接酶,接头(linker),本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！,(四)尾接法,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,内切酶,末端转移酶 +dGTP,末端转移酶 +dCTP,本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点,三、将重组体(子)导入宿主细胞-转,1. 重组质粒的导入方法,大肠杆菌,CaCl2,04,感受态细胞,重组质粒,转化 transformation,含重组质粒的大肠杆菌,三

18、、将重组体导入宿主细胞,2. 重组病毒或重组噬菌体的导入方法,重组病毒,重组噬菌体,加入病毒的 某些蛋白组分,具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,真核细胞,原核细胞,转染(transfection),四、重组体的筛选与鉴定-筛,Ampr,Terr,1. 插入失活: 例1 在Tetr中插入目的基因,在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。,Amp,Tet,1 2 3,4 5 6,3和5 是阳性克隆,1 2 3,4 5 6,例1：,四、重组体的筛选与鉴定,Apmr,MCS,LacZ,1. 插入失活： 例2 在Laz中插入目的基因,X-gal,蓝色化合物,-半乳糖苷酶,Lac

19、-Z基因,例2：蓝白斑筛选,2. 菌落原位杂交,覆盖 滤膜,取下沾 有菌落 的滤膜,裂解、 变性、 固定等,与探针 杂交,放射性 自显影,1 2 3,4 5 6,3和5是阳性克隆,五、基因工程的下游技术,(一) 细菌发酵,(二) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定,发酵条件(生物反应器的结构、细菌 培养的温度、空气的通量、pH及培养基 成分等)的优化组合。,六、基因工程中几个棘手的问题,1. 原核细胞的RNA聚合酶不能识别 真核细胞的启动子。,2. 原核细胞不能剪接真核细胞 带内含子的mRNA。,3. 原核细胞表达出的真核细胞蛋白质 往往无活性。,4. 用真核细胞表达系统虽然可以表达有活性的蛋白质，

20、但其产量太低，成本太高。,第四节 基因工程在医学上的应用,现代医学越来越重视活性蛋白质在预防 和治疗疾病中的作用。,基因工程可大量生产天然稀有存在的 重要的肽或蛋白质。,基因工程可根据人的意愿设计生产出 天然不存在的有重要生物活性的肽或 蛋白质。,人类基因组计划及后基因组计划的成果 将为基因工程提供难于估量的广阔发展 空间。,一、基因工程生产的药品,1.基因工程疫苗,乙肝，丙肝，爱滋病，流行性感冒，出血热，人乳头瘤病毒，巨细胞病毒等。,结核，麻风，霍乱，痢疾，肺炎等。,血吸虫，疟疾等。,各种肿瘤疫苗。,2. 人体活性因子,干扰素(IFN)：,白细胞介素(IL)：,生长因子：,集落刺激 因子(CSF)：,IFN-，IFN-，IFN-。,IL-1，2，313。,神经生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子等。,干细胞-CSF，粒细胞-CSF，粒细胞-巨噬细胞-CSF。,2. 人体活性因子,红细胞生成素(EPO)，超氧化物歧化酶(SOD)，组织纤溶酶原激活物(tPA)等。,激素,治疗心血管及血液病的活性肽,胰岛素，生长激素，生长抑制激素等。,主要发展趋势,完善现有的原核和真核细胞表达体系,建立新的表达体系,改进和发展大规模动、植物细胞培养技术,应用转基因动、植物作为生物反应器高产量、高质量、低成本生产名贵生物药物。,二、 基因诊断,基因诊断的概念,基因诊