赛拓实时荧光定量PCR讲座版.ppt

1、1,2020/7/10,实时荧光定量PCR,张立岩 哈尔滨赛拓生物科技有限公司 电话13936502242 Email：,2020/7/10,2,内容简介,实时荧光定量PCR基本原理及应用 实时荧光定量PCR定量基础 实时荧光定量PCR实验要素 实时荧光定量PCR数据处理 常见问题及解答,2020/7/10,3,实时荧光定量PCR基本原理及应用,2020/7/10,4,实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中引入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。是一种指数增长期定量的方法。,什么是实时荧光定量

2、PCR？,2020/7/10,5,为什么要选择指数增长期定量？,同一个模板96个重复,梯度稀释的五个样品,2020/7/10,6,PCR分期,2020/7/10,7,实时荧光定量PCR两种常用方法,染料法 SYBR Green染料最常用。 基本原理: 染料分子跟双链DNA特异性结 合，染料分子与双链DNA结合前后 荧光强度会发生10-100倍的改变。 优点：价格便宜，使用方便。 缺点：特异性低。,探针法 TaqMan探针和TaqMan MGB探针最成熟,另外还有LNA探针、分子信标、双杂交探针等等。 TaqMan基本原理: 普通PCR加探针（5端连荧光基 团，3端连淬灭基团），Taq酶水解 探

3、针，通过荧光信号积累检测PCR过程。 优点：灵敏度高，特异性好。 缺点：需要探针，价格相对较贵。,2020/7/10,8,MGB 探针,更好的淬灭效果 背景荧光低,提高Tm值 探针更短 适于SNP分型,2020/7/10,9,TaqMan反应过程变性,3,5,5,3,没有分子杂交,2020/7/10,10,TaqMan反应过程退火,3,3,5,5,模板和探针及引物杂交,2020/7/10,11,TaqMan反应过程延伸,Taq酶将探针从5-3水解，开始产生荧光。,2020/7/10,12,实时荧光定量PCR的应用,1.传染性疾病的定量分析 病毒、细菌、衣原体、支原体定量检测 病情评估和药物疗效

4、的观察和指导 2.微小残留病变的检测 3.基因表达定量分析 不同组织基因表达的差异 处理（用药等）前后基因表达的改变 转基因表达分析 细胞因子的表达分析 肿瘤耐药基因表达的研究 4.SNP检测,2020/7/10,13,荧光定量PCR定量基础,2020/7/10,14,PCR理论方程,2020/7/10,15,荧光PCR信号方程,2020/7/10,16,CT值与模板浓度的关系,2020/7/10,17,Log(x) vs CT,CT值跟起始模板浓度对数成反比,2020/7/10,18,CT值由阈值确定,CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内

5、的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,2020/7/10,19,阈值由基线确定,阈值(threshold) 缺省值设定为基线（baseline）范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。,2020/7/10,20,典型扩增曲线,21,2020/7/10,实时荧光定量PCR实验要素,2020/7/10,22,定量PCR实验要素,未知样品 检测目的基因 标准品 制作标准曲线 阳性对照 监控试剂、系统 阴性对照 监控试剂污染 内对照（IPC） 数据之间可比性 阳性参比荧光（ROX） 校正操作误差 重复样品 提高实验数据准确性,2020/7/10,23,阳性内对照（ IPC）的作用,实验一般以L为单位

6、取样，由于DNA或RNA抽提效 率不同和操作误差，同样体积的DNA或RNA并不来源于 同样数目的细胞。所以，copy/L要校正成copy/cell 或copy/基因组才有比较意义。 选用管家基因作IPC，因为其在细胞中的表达量或在 基因组中的拷贝数是相对恒定的，正比于细胞数或基因组 数量，所以，其数量可以代表细胞数或基因组数量。 CopySmpl / CopyIPC 相当于 CopySmpl/ cell 或CopySmpl/ 基因组，或者用CT = CT Smpl-CT IPC来表 示。,2020/7/10,24,阳性参比荧光,以固定的浓度存在于PCR Master Mix中，不参与扩增，信号

7、强度只与取用多少有关。 校正方式：Rn = RReporter/ RROX 作用：消除用枪操作误差、管盖厚度等光学误差，减少孔间、批间差异，提高数据重现性和精确度。,2020/7/10,25,TaqMan数据的ROX校正效果,2020/7/10,26,实时定量PCR数据处理,2020/7/10,27,绝对定量和相对定量的定义,绝对定量 目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。 相对定量 不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方

8、法是通过稀释目的基因的PCR产物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。,2020/7/10,28,绝对定量数据处理举例,2020/7/10,29,标准曲线法相对定量举例,2020/7/10,30,标准曲线法相对定量举例,2020/7/10,31,CT法相对定量举例,CT的定义 CT=（CT未知样品- CT未知样品内参）-（ CT基准样品- CT基准内参）,2020/7/10,32,比值与CT的关系,引入内参校正后 平均相对含量=2-平均CT,2020/7/10,33,CT法举例,2020/7/10,34,常见问题及解决方法,2020/7/10,35,问题一：定量PCR无扩增

9、曲线,可能原因一：DNA模板质量不好，含有抑制剂。 解决办法：DMSO，SDS和甲酰胺等有机试剂会抑制Taq酶的活性。如果怀疑模板含有抑制剂，需要进一步纯化DNA，提高模板质量。 可能原因二：引物探针设计较差。 解决办法：按照引物探针设计原则，重新设计并合成引物探针，对 探针序列进行blast比对，确保其特异性。 可能原因三：引物探针合成质量较差。 解决办法：用普通电泳法，观察是否有目的条带出现。确保探针荧 光报告基团和荧光淬灭基团的存在，可以用DNase处理TaqMan 探针，检测荧光是否增强。必要的话重新合成引物探针。 可能原因四：模板浓度太低。 解决办法：浓缩模板，使模板浓度在104个拷

10、贝左右，以便在25到 30个循环中获得CT值。,2020/7/10,36,问题一：定量PCR无扩增曲线,可能原因五：镁离子浓度太低。 解决办法：从3mM到10mM，进行一系列镁离子梯度反应，确定对于 每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。 可能原因六：引物浓度太低。 解决办法：为了精确测定引物浓度，测量OD260的数值，通过公式计算 浓度。最佳引物浓度一般在0.1M和1.0M之间。 可能原因七：退火温度太高。 解决办法：利用软件估算Tm值，降低退火温度，最好是进行退火温度 梯度实验，寻找最佳的退火温度。 可能原因八：反应体系中有不明物干扰。 解决办法：对任何实验样品和试剂，应采用无菌无酶的离心管进行分 装、保存和使用。,2020/7/10,37,问题二：阳性对照无扩增曲线,1. 确认对照 观察未知样品是否有扩增曲线，来判断是对照的问题还是体系的问题；有扩增曲线，说明是对照问题，否则，可能是体系问题。 2. 确认体系 参考问题一的解决办法。,2020/7/10,38,问题三：阴性对照有扩增曲线,可能原因一：模板被污染 解决办法：隔离污染来源，更换试剂。使用UNG酶/dUTP防污染系统。使用专用的精致移液器。在无DNA区准备反应，使用抗气溶胶的枪头。 可能原因二：体系有问题