病毒宏基因组研究方法和鼠类肠道病毒宏基因组研究进展论文

1、旦逝监遣酋髦基型堕墅生三旦笠望羔鲞勇卫塑 ! ! ! ! 里生! ! 堂! ! 翌尘堕! i 翌! ! 赶：! 尘：! q ! ! ：! ! ! ：! ! ：盟! ：! 病毒宏基因组研究方法和鼠类肠道病毒宏 基因组研究进展 曹婧张海林张云智 【关键词】 病毒宏基因组；鼠类肠道病毒宏基因组；新病毒 传统病毒学研究方法基于组织病理、病毒培养， 这使得一些需要培养的病毒难以被发现。据估计， 通过传统方法认识的病毒可能还不到自然界存在病 毒的l 。分子生物学技术的发展，尤其是高通 量测序技术为人们从基因组的角度发现和认识新病 毒提供了可能。宏基因组学( m e t a g e n o m i c s

2、) 是近年 来新兴的从基因组角度高通量分析在特定环境中所 有微生物遗传组成的科学。在短短几年内，宏基因 组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、人体 e l 腔及胃肠道等。2 “o 。在近岸海洋水环境中，检测 到的病毒序列有6 5 是未知序列，基因型可达到 5 0 0 0 种拉j 。在马粪便样品中测到的病毒序列有 6 8 是未知序列，基因型可达1 0 0 0 种1j 。在人粪便 样品中检测到多达1 2 0 0 种基因型的病毒基因组序 列，并发现一些罕见新病毒或新基因型肠道病毒是 主要的致病因子2 卧1 0 j 。而鼠类与人类的关系十分 密切，只要有人生产、生活的地方，无论是农村或是 城市，就

3、可能有啮齿动物在参与活动。鼠类作为病 原体的宿主动物，可传播6 0 多种人类疾病j 。许 多感染人的病毒可以感染鼠类，反过来，许多以鼠类 为宿主动物的病毒，由于人直接或间接与鼠类接触， 也可以感染人而引起疾病的暴发流行。人们常常将 啮齿动物作为动物模型研究病毒的感染性2 。1 引，从 而间接的了解病毒在人体内的感染过程。故了解和 掌握啮齿动物的病毒谱很有必要，特别是对于一些 鼠源新病毒的发现尤其重要，因为这些病毒谱提供 给当地部门，可为相关疾病的预防控制提供科学指 d o i ：1 0 3 7 6 0 c m a j i s s n 1 6 7 3 - 4 0 9 2 2 0 1 6 0 1

4、0 2 l 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 8 1 0 6 0 1 3 2 、8 1 2 6 0 4 3 7 ) ； 传染病预防控制国家重点实验室科研课题资助项目( 2 0 1 3 s k l i d 3 0 2 ) 作者单位：6 7 1 0 0 0 云南大理大理学院公共卫生学院( 曹婧) ； 云南省地方病防治e 衫云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室 云南省病毒立克次体研究中心( 张海林、张云智) 通讯作者：张云智，e m a i l ：z h a n k y u n z h i l 8 1 8 1 6 3 c o m 综述 导。因此，将病毒宏基因组的方法应用于鼠类病毒 的研究，为我

5、们开拓了新的视野。 1 病毒宏基因组学概述 将宏基因组学的方法应用于病毒学的研究领域 就形成了病毒宏基因组学( v i r a lm e t a g e n o m i c s ) 。 2 0 0 2 年，美国学者b r e i t b a r t 等1 刮对海水中病毒群 ( v i r o m e ) 进行研究，首次阐明海水中病毒群以噬菌 体为主，标志着病毒宏基因组学的初步形成。一般 说来，病毒宏基因组就是通过过滤、消化和高速离心 等技术，去除某一环境中微生物种群中的非病毒成 分，获得该环境中的所有病毒种类，并建立病毒基因 组文库，通过高通量测序技术对该病毒文库进行 d n a 测序，再通过

6、生物信息学手段，对获得的病毒 序列进行核酸或氨基酸序列比对，从而获得该环境 中所有病毒种类的构成。环境中所有病毒基因组在 一起就形成了该环境的病毒宏基因组文库，这里的 环境可以是海洋、土壤等无机环境，也可以是各种生 物体的组织器官，如人、马、蝙蝠、鼠等的消化道等有 机环境。病毒宏基因组能够探知整个生物圈中病毒 生物群体的基因多样性，并且能够消除传统病毒鉴 定方法的局限性，例如特异引物的p c r 或基因芯 片。与传统的病毒培养，即当细胞发生细胞病变，分 离到病毒后，才能获得病毒基因组的方法不同，应用 病毒宏基因组的方法，可以像其他微生物用核糖体 r n a 进行种类鉴定一样( 而病毒没有核糖体

7、 r n a ) ，进行某一环境中病毒种类的快速鉴定、掌握 了解病毒群体的构成，并且能发现新的基因和新病 毒类型。 2 病毒宏基因组研究的主要技术路线 理论上，任何种类的样品都可以用病毒宏基因 组学进行研究分析，包括海水5 。、血液16 i 、马粪l 1 7j 、 茎株u8 | 、海洋沉积物19 i 、珊瑚组织2 2 1 1 以及温 泉j 等。因为病毒基因组的长度相对较短，平均大 约5 0 k b 旧2 7j ，提取病毒核酸时，经常会被环境中的 细菌或真核生物和宿主的核酸干扰，因此去除非病 万方数据 国匿痘耋堂盘查! ! ! ! 生! 旦筮垫鲞筮! 塑 ! ! ! ! 里尘! ! ! ! !

8、! 里生旦! 业虹儿些塑堕i 堕堡世 6 7 毒核酸是非常必要的 23 i 。为了浓缩样本中的病毒 颗粒，要将样品进行混合、过滤、超速离心等步骤。 病毒宏基因组研究的主要技术路线如图1 所示，以 下为具体的操作过程： 2 1 病毒的浓缩 同一地区相同物种采集的样品如鼠粪便混合为 一大管( p 0 0 1 ) ，进行研磨，用于病毒宏基因组研究。 样品经充分研磨后，按照1 ：1 0 比例，用含青霉素 ( i o o u m l ) 和链霉素( o 1 m l ) 的p b s 缓冲液稀 释，溶液先经纱布过滤，然后1 50 0 0 g ，4 。c 超速离 心2 0 r a i n ，上清液经0 。4

9、 5 z m 滤膜( m i l l i p o r e ) 过滤， 除去细菌或比细菌大的颗粒成分，过滤液中即含病 毒颗粒24 i 。 2 2 病毒核酸的提取 病毒过滤液先用d n a 酶和r n a 酶消化处理，除 去非病毒蛋白质外壳保护的外源性核酸( 主要为病毒 宿主组织细胞核酸) ，然后用病毒核酸抽提试剂盒 ( q i a g e n ) 提取样品中的病毒核酸( d n a 和r n a ) ，提 取的病毒核酸溶解在病毒核酸洗脱缓冲液中，一 8 0 保存备用2 “。 2 3 病毒第一链c d n a 的合成 按参考文献进行m 26 。，将r n a 病毒和d n a 加 r n a 病毒

10、分为两组分别进行c d n a 合成。对于 r n a 病毒的c d n a 合成，先将提取的病毒r n a 用 d n a 酶( a m b o i n ) 消化处理，再与1 0 0 p m o l z l 的5 端含2 0 个锚定核苷酸、3 端含8 个随机核苷酸的锚 定随机引物混合( 锚定随机引物k 一8 n 2 7 ：为：5 g a cc a tc t ag c ga c ct c ca c nn n nn n nn 3 ) ，加入1 0 m md n t p ，7 5 0 c5 r a i n ，冰上迅速冷却 5 r a i n ，然后，与4 0 u 比lr n a 酶抑制剂，2 0

11、0 u 的s u p p e r s c r i p t ( i n v i t r o g e n 含m m l v 反转录酶) ，1x 反 转录酶b u f f e r 混合，先2 5 c cl o m i n ，后3 7 延伸1 h 。 对于d n a 加r n a 病毒的d n a 合成，除不加d n a 酶消化处理外，与r n a 病毒的c d n a 合成相同。 2 4 第二链c d n a 合成 将病毒( r n a 病毒和d n a 加r n a 病毒2 个组 分) 第一链c d n a 反应液于沸水中煮2 r a i n ，冰上迅 速冷却3 r a i n ，与3 5 u 仙

12、lk l e n o w 活性的d n a 聚合 酶( n e we n g l a n db i o l a b s ) ，2 0 p m o l z l 锚定随机引物 k 一8 n 和1 k l e n o wb u f f e r 混合，2 5 5 m i n ，3 7 3 0 m i n ，合成第二链c d n a 。 2 5 d n a 和r n a 病毒的随机p c r 扩增 用k o d p l u s d n a 聚合酶( t o y o b o ) 进行 病毒核酸随机p c r 扩增。扩增以合成的第二链c d n a 为模板，与l o p m o l x l 锚定引物( 锚定

13、引物k 2 7 1 为5 g a cc a tc t ag c ga c ct c ca c 3 ) ，1 k o db u f i e r 2 m md n t p s ，2 5 r a mm g s 0 4 ，k o d p l u s d n a 聚合酶( t o y o b o ) 充分混合进行p c r 扩增； 反应条件：9 4 5 m i n ，5 9 。c 退火l m i n ，6 8 。( 2 延伸 3 m i n ，3 5 个循环，最后6 8 延伸1 0 m i n 。 2 6 随机p c r 产物的克隆和测序 上述获得的随机p c r 产物先经琼脂糖电泳分 析，从琼脂糖中回

14、收5 0 0 b p 以上大小的d n a 片段， 克隆到p g e m t 载体( i n v i t r o g e n ) 上。挑取5 0 一 1 0 0 个克隆进行测序。随机p c r 只是对样品进行初 步检测，判断以上的实验步骤是否正确，以及样品中 是否存在病毒核酸片段，对样品进行高通量测序是 否有价值。 2 7 病毒宏基因组文库的建立和高通量测序 为了增加样本中病毒核酸的拷贝数口5 i ，对两个 组分别进行重复的随机p c r 扩增，一组以r n a 病 毒合成的c d n a 为模板进行扩增( 2 个重复) ，另一 组以r n a 病毒和d n a 病毒合成的c d n a 为模

15、板进 行扩增( 2 个重复) ，然后将4 个p c r 产物混合，用 q i a q u i c k 纯化试剂盒( q i a g e n ) 进行纯化，用核酸测 定仪测量d n a 的纯度。这样，同一地区相同物种的 样品就建立起6 个病毒宏基因组文库。p c r 产物先 经琼脂糖电泳分析，从琼脂糖中回收5 0 0 b p 以上的 d n a 片段，再用q i a q u i c k 胶回收试剂盒( q i a g e n ) 回 收病毒d n a ，回收产物用t 4 多聚核苷酸激酶处理， 再与r o c h e 4 5 4 锚定点( a d a p t o r s ) 相连接，上述获 得的随

16、机p c r 产物进行高通量测序( h i g h t h r o u g h p u ts e q u e n c i n g ) 或称深度测序( d e e ps e q u e n c i n g ) 。现阶段深度测序有4 种平台业8 i ：4 5 4 m ( 4 5 4 l i f es c i e n c e s r o c h e ，b r a n f o r d ，c t ) 12 9 ，i l l u m i n a l ( i l l u m i n a ，i n c ，s a nd i e g o ，c a ) 30 i ，1 0 nt o n e n t m ( i o

17、nt o r r e n t l i f et e c h n o l o g i e s ，s o u t hs a nf r a n c i s c o ， c a ) 3 1 和p a c b i o l ( p a c i f i cb i o s c i e n c e s ，m e n l op a r k c a ) 3 2 1 。病毒序列一般采用4 5 4 或i l l u m i n a s 0 1 e x a 进行高通量测序。4 5 4 能获得4 0 0 b p 一7 0 0 b p 左右 的d n a 序列，而i l l u m i n a s o l e x a 只能获

18、得1 2 5 b p 一 2 5 0 b p 的d n a 序列。要对有价值的病毒进行全长 基因组测序，还需要引物合成、p c r 、克隆、测序和 d n a 片段拼接等步骤。 2 8 生物信息学分析 用网上免费软件( b l a s t n ，b l a s t x ) 分析获得的 序列( 4 0 0 b p 左右) 与g e n b a n k 中已知的病毒基因组 和蛋白质序列的相似性；根据b l a s t 的比对结果，e 值 1 0 ，认为该序列是不可分类 的26 。通过生物信息学分析建立样品的病毒宏基 因组文库。 黼蝴 一l 鬻翟f l 繁| 一l 袭篓筹| u 一一丁 f 鬻h 黼

19、蝴序卜i 僦1 - 徽l 图1病毒宏基因组研究的主要技术路线 3 鼠类病毒宏基因组研究 从鼠类体内发现病毒的历史可以追溯到2 0 世 纪6 0 年代。迄今为止，人们从鼠类体内相继发现了 1 0 0 多种病毒，可以说鼠类是病毒的天然储藏库，鼠 携带病毒种类包括了痘病毒科( p o x v i r i d a e ) 、疱疹病 毒科( h e r p e s v i r i d a e ) 、腺病毒科( a d e n o v i r i d a e ) 、多瘤 病毒科( p o l y o m a v i r i d a e ) 、细小病毒科( p a r v o v i r i d a e )

20、 、反转录病毒科( r e t r o v i r i d a e ) 、嗜肝d n a 病毒 科( h e p a d n a v i r i d a e ) 、副粘病毒科( p a r a m y x o v i r i d a e ) 、 沙粒病毒科( a r e n a v i r i d a e ) 、黄病毒科( f l a v a v i r i d a e ) 、 布尼亚病毒科( b u n y a v i r i d a e ) 、星状病毒科( a s t r o v i r i d e e ) 、小r n a 病毒科( p i c o r n a v i r i d a e

21、) 和冠状病毒科 ( c o r o n a v i r i d a e ) 等1 0 多个病毒科旧卜川。如可感染 人的汉坦病毒( h a n t a v i r u s ) ，世界范围内有近4 0 多 个基因型，可引起人类流行于亚洲和欧洲的肾综合 征出血热( h e m o r r h a g i cf e v e rw i t hr e n a ls y n d r o m e ) 和 流行于北美洲和南美洲的汉坦肺综合征( h a n t a v i r u s p u l m o n a r ys y n d r o m e ) ，啮齿动物为其自然宿主 5 | 。 拉沙病毒( l a s

22、 s av i r u s ) 可引起人类高死亡率的拉沙 热( l a s s af e v e r ) ”6 | ，该病毒的自然宿主也为鼠 类 37 | 。拉沙病毒属于沙粒病毒科，该科病毒只有拉 沙病毒属一个属，共有2 3 种，根据其抗原性的不同， 可分为2 组：旧大陆沙粒病毒组( o l dw o r l da r e n a v i r - u s e s ) 和新大陆沙粒病毒组( n e ww o a da r e n a v i r u s e s ) 口8 | 。该属的代表病毒为淋巴细胞性脉络丛脑炎 病毒( l y m p h o c y t i cc h o r i o m e

23、n i n g i t i sv i r u s ，l m c v ) ，为 全球性分布，主要因为l m c v 的宿主动物小家鼠 ( m u s m u s c u l u s ) 是世界性分布的9 | 。因此鼠类携带 许多烈性病毒，日益引起人们的关注。 p h a n 等1 最近用宏基因组学的方法，对美国 捕获的1 0 5 只鼠类标本进行了肠道病毒研究，共获 得2 6 ，8 4 6 条病毒序列( l o o b p ) ，包括圆环病毒科 ( c i r c o v i r i d a e ) 、双生病毒科( g e m i n i v i r i d a e ) 、矮缩病 毒科( n a

24、n o v i r i d a e ) 、浓核症病毒科( d e n s o v i r i a d e ) 、细 小病毒科( p a r v o v i r i d a e ) 、拟态病毒科( m i m i v i r i d a e ) 、 乳头瘤病毒科( p a p i l l o m a v i r i d a e ) 、星状病毒科( 山。 t r o v i r i d a e ) 、虹彩病毒科( i r i d o v i r i a d e ) 、多分体d n a 病毒科( p o l y d n a v i r i d a e ) 、杆状病毒科( b a c u l o v

25、i r i 。 d a e ) 、双组分r n a 病毒科( p a r t i t i v i r i d a e ) 、小r n a 病毒科( p i c o r n a v i r i d a e ) 、双顺反子病毒科( d i c i s t r o v i r i d a e ) 、传染性软腐病病毒( i f l a v i r u s ) 、腺病毒科( a d - e n o v i r i d a e ) 、星状病毒科( a s t r o v i r i d a e ) 、野田村病毒 科( n o d a v i r i d a e ) 、n o r a 病毒、冠状病毒科( c

26、 o r o n a v i r i d a e ) 等2 0 多科的病毒，其中还发现新的鼠乳头瘤病 毒、圆环病毒、博卡病毒( k o b u v i r u s ) 、小核糖核酸病 毒( p i c o b i m a v i r u s e s ) 、s a p e l o v i m s 、星状病毒、腺病毒 和腺联病毒( a d e n a s s o c i a t e dv i r u s ) 等，由此可见， 用病毒宏基因组的方法，仅在美国的局部地区就发 现了许多用组织培养等方法不能发现的未知病毒， 为疾病的预防控制开拓了新的视野。 4 结语 由于携带病毒的鼠类等宿主动物大多数并不显

27、 示任何临床症状，而是作为病原体的储藏源存在于 自然界中，因此人们很容易忽视这些在自然界存在 的病原体对人畜的潜在威胁。自然环境的破坏、气 候的改变、农业集约化养殖、西部大开发如水电站、 公路的修建等因素，使人类与各种野生动物如鼠类、 蝙蝠等接触越来越多，从而使野生动物携带的病毒 增加了跨种传播的机会，如s a r s 和h i v 的全球性 暴发流行就是典型的例子。加之国际贸易、人口膨 胀和旅行等因素，使一些局部流行的疾病能在短时 间内形成全球范围的传播。如拉沙病毒原来主要存 在南非，由于旅游等原因，现在美洲也出现病例1 。 因此加强野生动物病原学研究、了解自然界存在的 病毒及其流行状况，对

28、预防和控制一些可能发生的 新发病毒性疾病的流行和暴发，具有重要的科学意 义。充分应用当代病毒宏基因组的方法，可以从实 验室的角度让我们迅速掌握某一环境样品中病原体 的种类组成，为相关疾病的暴发流行的快速评定和 预防控制，提供必要的参考价值。 参考文献 1 e d w a r d sr a ，r o h w e rf v i r a lm e t a g e n o m i c s j n a tr e vm i - c r o b i o l ，2 0 0 5 ，3 ( 6 ) ：5 0 4 5 1 0 2 w o r m n a e ki c e ，r a v e lj ，h i l lr

29、t ，e la 1 p o p u l a t i o nd y n a m i c so f c h e s a p e a k eb a yv i r i o p l a n k t o n ：t o t a l c o m m u n i t ya n a l y s i sb y p u l s e d f i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s j a p p le n v i r o nm i c r o b i o l ， 1 9 9 9 ，6 5 ( 1 ) ：2 3 1 2 4 0 3 b r e i t b a r tm ，h e

30、 w s o ni ，f e l t sb ，e ta 1 m e t a g e n o m i ca n a l y s e so f u n c u h u r e dv i r a lc o m m u n i t yf r o mh u m a nf e c e s j jb a c t e r i o l ， 2 0 0 3 1 8 5 ( 2 0 ) ：6 2 2 0 6 2 2 3 万方数据 国匿疸壹堂盘查! q ! ! 生! 旦箜垫鲞筮! 翅! ! ! ! 里堕i ! 趔! 婴堂型! 巫些盟j 塑l 垫堑丛堕- 生盟 4 c a n na j ，f a n d r i e h

31、s e ，h e a p h ys a n a l y s i so ft h ev i r u sp o p u l a t i o nd r e s e n ti ne q u i n ef a e c e si n d i c a t e st h ep r e s e n c eo fh u n d r e d so f u n c h a r a c t e f i z e dv i r u sg e n o m e s j v i r u sg e n e s ，2 0 0 5 ，3 0 ( 2 ) ： 1 5 1 一1 5 6 5 d e l w a r te l v i r a

32、 lm e t a g e n o m i c s j r e vm e dv i r o l ，2 0 0 7 ，1 7 ( 2 ) ：1 1 5 1 3 1 f61 s e h o e n f e l dt ，p a t t e r s o nm ，r i c h a r d s o np m ，e ta l ，a s s e m b l yo f v i r a lm e t a g e n o m e sf r o my e n o w s t o n eh o ts p r i n g s j a p p le n v i - r o bm i e r o b i o l ，2 0

33、0 8 ，7 4 ( 1 3 ) ：4 1 6 4 4 1 7 4 7 v i c t o r i aj g ，k a p o o ra ，d u p u i sk ，e ta 1 r a p i di d e n t i f i c a t i o no f k n o w na n dn e wr n av i r u s e sf r o ma n i m a lt i s s u e s j ，p l o s p a t h o g ，2 0 0 8 ，4 ( 9 ) ：e 1 0 0 0 1 6 3 8 n gt f ，m a n i r ec ，b o r r o w m a nk

34、 ，e ta 1 d i s c o v e r yo fa n o v e ls i n g l e s t r a n d e dd n av i r u sf r o ma s e at u r t l ef i b r o p a p i l l o m ab yu s i n g v i r a lm e t a g e n o m i e s j jv i r o l ，2 0 0 9 ，8 3 ( 6 ) ：2 5 0 0 2 5 0 9 9 k a p o o ra ，v i c t o r i aj ，s i m m o n d sp ，e ta 1 ah i g h l y

35、p r e v a l e n ta n d g e n e t i c a l l yd i v e r s i f i e dp i c o r u a v i r i d a eg e n u si ns o u t ha s i a nc h i l d r e n j p r o cn a t la c a ds c iu s a ，2 0 0 8 ，1 0 5 ( 5 1 ) ：2 0 4 8 2 2 0 4 8 7 1 0 b l i n k o v ao ，k a p o o ra ，v i c t o r i aj ，e ta 1 c a r d i o v i r u s

36、e sa r eg e - n e t i e a l t yd i v e r s ea n dc o n l i u o ne n t e r i ci n f e c t i o n si ns o u t ha s i a n c h i l d r e n j jv i r u l ，2 0 0 9 ，8 3 ( 9 ) ：4 6 3 1 4 6 4 1 1 1 m e e r b u r gb g ，s i n g l e t o ng r ，k i j l s t r aa r o d e n t b o r n ed i s e a - s e sa n dt h e i rr

37、 i s k sf o rp u b h eh e a l t h j c r i tr e vm i e m b i o l ， 2 0 0 9 ，3 5 ( 3 ) ：2 2 1 2 7 0 1 2 w e i d i n g e rg m e a s l e sv i r u s s p e c i f i ct c e l li m m u n i t yi nr o d e n t m o d e l s j v i r a li i i q 1 n u n o l ，2 0 0 2 ，1 5 ( 3 ) ：4 2 9 4 3 4 1 3 m a n e e r a ty ，c l

38、a y s o net ，m y i n tk s ，e ta 1 e x p e r i m e n t a li n f e c f i n no ft h el a b o r a t o r yr a tw i t ht h eh e p a t i t i sev i r u s j jm e d v i m l ，1 9 9 6 ，4 8 ( 2 ) ：1 2 1 1 2 8 1 4 b r e i t b a r tm ，s a l a m o np ，a n d r e s e nb 。e ta 1 g e n o m i ca n a l y s i so f u n c u

39、 l t u r e dm a r i n ev i r a lc o m m u n i t i e s j p r o cn a i la c a ds c i u s a ，2 0 0 2 ，9 9 ( 2 2 ) ：1 4 2 5 0 1 4 2 5 5 ( 1 5 a n g l yf e ，f e l t sb ，b r e i t b a r tm ，e ta 1 砀em a r i n ev i r u m e so f f o u ro c e a n i cr e g i o n s j p l o sb i o l ，2 0 0 6 ，4 ( 1 1 ) ：2 1 2 1

40、 2 1 3 1 ， 1 6 b r e i t b a r tm ，r o h w e rf m e t h o df o rd i s c o v e r i n gn o v e ld n av i r u s e si nb l o o du s i n gv i r a lp a r t i c l es e l e c t i o na n ds h o t g u ns e q u e n c i n g j b i o t e c h n i q u e s ，2 0 0 5 ，3 9 ( 5 ) ：7 2 9 7 3 6 1 7 c a r ma j ，f a n d r i

41、 e hs e ，h e a p h ys a n a l y s i so ft h ev i r u sp o p u l a t i o np r e s e n ti ne q u i n ef a e c e si n d i c a t e st h ep r e s e n c eo fh u n d r e d so f u n e h a r a e t e r i z e dv i r u sg e n o m e s j v i r u sg e n e s ，2 0 0 5 ，3 0 ( 2 ) ： 1 5 1 1 5 6 1 8 z h a n gt ，b r e i

42、 t b a r tm ，l e ew h ，e ta 1 r n av i r a lc o m m u n i t yi n h u m a nf e c e s ：p r e v a l e n c eo fp l a n tp a t h o g e n i cv i r u s e s j p l o s b i o l ，2 0 0 6 ，4 ( 1 ) ：1 0 8 一1 1 8 1 9 b r e i t b a r tm ，f e l t sb ，k e l l e ys ，e ta 1 d i v e r s i t ya n dp o p u l a t i o n s

43、t r u c t u r eo fan e a r s h o r em a r l f i e s e d i m e n tv i r a lc o m m u n i t y j p r o cb i o ls c i ，2 0 0 4 ，2 7 1 ( 1 5 3 9 ) ：5 6 5 5 7 4 2 0 m a r h a v e rk l ，e d w a r d sr a ，r o h w e rf v i r a lc o m m u n i t i e sa s s o c i a t e dw i t hh e a l t h ya n db l e a c h i n

44、gc o r a l s j e n v i r o nm i e r o b i o l ， 2 0 0 8 ，1 0 ( 9 ) ：2 2 7 7 2 2 8 6 2 1 v e g at r ，w i u n e rh d ，r o d r i g u e zm b ，e ta 1 m e t a g e n o m i ea n a l y s i so fs t r e s s e dc o r a lh o l o b i o n t s j e n v i r o nm i c m b i o l ，2 0 0 9 ， 1 l ( 8 ) ：2 1 4 8 2 1 6 3 2 2

45、 s t e w a r dg ，m o n t i e lj ，a z a mf g e n o m es i z ed i s t r i b u t i o n si n d i c a r ev a r i a b i l i t ya n ds i m i l a r i t i e sa m o n gm a r i n ev i r a la s s e m b l a g e s 6 9 f r o md i v e r s ee n v i r o n m e n t s j l i m n o lo e e a n o g r ，2 0 0 0 ，4 5 ( 8 ) ：1

46、6 9 7 1 7 0 6 f2 31 t h u r b e rr v ，h a y n e sm ，b r e i t b a n tm ，e ta 1 l a b o r a t o r yp r o c e d u r e st og e n e r a t ev i r a lm e t a g e n o m e s j n a tp r o t o e ，2 0 0 9 ，4 ( 4 ) ：4 7 0 4 8 3 2 4 v i c t o i i aj g ，k a p o o ra ，l il ，e ta 1 m e t a g e n o m i ca n a l y s

47、e so fv i 。 i l l s e si ns t o o ls a m p l e sf r o mc h i l d r e nw i t ha c u t ef l a c c i dp a r a l y s i s j 1 jv i r o l ，2 0 0 9 ，8 3 ( 9 ) ：4 6 4 2 4 6 5 1 2 5 p h a nt g ，k a p u s i n s z k yb ，w a n gc ，e ta 1 t h ef e c a lv i r a lf l o r ao f w i l dr o d e n t s j p l o sp a t h

48、o g ，2 0 1 1 ，7 ( 9 ) ：e 1 0 0 2 2 1 8 2 6 v i c t o r i aj g ，k a p o o ra ，d u p u i sk ，e ta 1 r a p i di d e n t i f i c a t i o no f k n o w na n dn e wr n av i r u s e sf r o ma n i m a lt i s s u e s j p l o s p a t h o g ，2 0 0 8 ，4 ( 9 ) ：e 1 0 0 0 1 6 3 2 7 s t a n ga ，k o r uk ，w i l d n

49、e ro ，e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fv i r u si - s o l a t e sb yp a r t i c l e a s s o c i a t e dn u c l e i ca c i dp c r j jc l i nm i c r o b i o l ，2 0 0 5 ，4 3 ( 2 ) ：7 1 6 7 2 0 2 8 q u i n o n e sm e ，a v i l as ，r e y e sg ，e ta 1 d e e ps e q u e n c i n g ：b e - c o m i n gac

50、 r i t i c a l t o o l i nc l i n i c a lv i r o l o g y j jc l i nv i r o l ， 2 0 1 4 ，6 l ( 1 ) ：9 1 9 2 9 m a r g u l i e sm ，e g h o l mm ，a h m a nw e ，e ta 1 g e n o m es e q u e n - c i n gi nm i c r o f a b r i c a t e dh j i s h d e n s i t yp i c o l i t r er e a c t o r s j n a t a r e ，2

51、 0 0 5 ，4 3 7 ( 7 0 5 7 ) ：3 7 6 3 8 0 3 0 b e n n e t ts s o l e x al t d j ，p h a r m a c o g e n o m i c s ，2 0 0 4 ，5 ( 4 ) ： 4 3 3 4 3 8 3 1 r o t h b e r gj m ，h i n zw ，r e a r i c kt m ，e ta 1 a ni n t e g r a t e ds e m i - c o n d u c t o rd e v i c ee n a b l i n gn o n o p t i c a lg e n

52、 o m es e q u e n c i n g j n a t u r e ，2 0 1 l ，4 7 5 ( 7 3 5 6 ) ：3 4 8 3 5 2 3 2 e i dj ，f e h ra ，g r a yj ，e ta 1 r e a l t i m ed n as e q u e n c i n gf r o m s i n g l ep o l y m e r a s em o l e c u l e s j s c i e n c e ，2 0 0 9 ，3 2 3 ( 5 9 1 0 ) ： 1 3 3 1 3 8 3 3 b h a t tp n ，p e r c yd h ，j n n a sa m c h a r a c t e r i z a t i o n