阔叶十大功劳叶中生物碱的紫外诱导及相关蛋白质组学分析

1、 论文作 者签 名 ： ： 浙江 大学 研 究 生学 位论文独 创性 声明或 撰 写 过 的 研 究 成 果 ，也不 包 含 为 获得堑 塑 太 堂或 其 他 教 育 机 构 的 学 位或 证 书而 使 用 过 的 材料 。 与 我一 同工 作 的 同志对 本 研 究 所 做 的 任 何 贡 献 均 已在论文中 作了 明 确的 说 明 并 表 示 谢 意。学 位论文作 者签 名学 位论文版权使 用授 权书 艿 难 宦 畚脑诮 饷 芎 笫视帽 臼谌 。虽 然 化学 合 成 和植 物细胞 培 养 可以 生产这 些代 谢 物，但 由 于多数 次 生代 谢产物结构 复杂 ，化学 合 成 的 收 率 较

2、 低 ，成 本 很 高，植 物细胞 培 养 ，虽 然 有 一 定 的可行 性 ，但 成 本 控 制仍 是其 发 展的 瓶颈。 而 利用 非 生物胁 迫 ，提 高在体 或 离体 植物组 织 中 次 生代 谢 产物的 含 量，具 有 成 本 低 ，无污染 ，简单 快 速 的 优 点，越 来 越受到产业界 和学 术 界 的 重 视，其 中 紫 外光 是一 种 重 要 的 诱 导 因子 。 十 大功 劳 是一 种 常绿 灌木，属于小 檗 科十 大功 劳 属，是一 种 重 要 的 药物植 物。现 代 药理 学 研 究 表 明 它 具 有 很 好 的 药理 活 性 ，如 抑 菌 消炎 、 降血糖 ，抗 氧

3、化以 及抗 癌 等 多种 生物活 性 。 关于十 大功 劳 活 性 成 分研 究 ，已很 透彻 。 生物碱 是其 主 要的 生物活 性 物质 ，而 含 量较 高的 主 要 是小 檗 碱 ，药根 碱 ，非 洲 防己碱 和巴 马 汀等。传 统 上 十 大功 劳 以 根 入 药，大量 的 采集 ，必 然 会 引 起植 物资 源的 匮 乏，也严重 破坏 生态 环 境 。双 向电 泳 得到了 个差 异点，利用 组 合 肽 配 体 库 技 术 后，检测 到了 个新 蛋 白阔 叶 十 大功 劳 次 生代 谢 生物碱 双 向电 泳 组 合 肽 配 体 库 紫 瑄 痵 瓵 ， 甈 琾 瑃 ， 甌 ， ， 瑃 海

4、 琣 琷 琧 瓾 籧 籷 ； 產 甃 瓺 甆 紫 外诱 导 处理 及叶 片 蛋 白 的 提 取 未经组 合 肽 配 体 库 处理 的 十 大功 劳 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 一 笛 椴僮 鳌 分析 与 讨论 研 究 背景近 年 来 ，随着人民 生活 水 平的 不 断 提 高，对 健 康及 其 相 关产业的 需 求 不 断 增强 ，国 务 院 于 年 月 发 布 了 关于促 进健 康服务 业发 展的 若 干 意见 ，提 出全 面 发 展中 医 药医 疗保 健 服务 产业，中 医 药事 业面 临 着大发 展的 良好 契 机 。然 而 ，中 药资 源，尤 其 是野 生药用 植 物资 源有 限

5、 ，随着近 年 来 滥采滥挖 和良种 退 化，中药产业的 可持 续 发 展阻 碍 很 大。 如 何 提 高药材品质 ，合 理 使 用 中 草 药资 源，对 于中 医 药行 业的 发 展具 有 重 要 意义。 众 所 周 知，中 药材的 效 果 依 赖 于其 体 内 蕴 藏 的活 性 成 分，而 这 些活 性 成 分大部 分归属于次 生代 谢 产物，提 高这 些次 生代 谢 产物的 含 量能显 著 提 高中 药材的 质 量。 我们利用 紫 外诱 导 技 术 ，显 著 提 高了 余 种 药用 植 物活 性 性 成 分的 含 量。 因此 ，利用 紫 外诱 导 技 术 提 高中 药活 性 成 分的 含

6、 量，具 有 很 好 的 发 展前 景 。阔 叶 十 大功 劳 第 一 章绪 论 叶 片 经高强 度 的 辐 射后 ，黄 酮 类 化合 浙江 大学 硕 士学 位论文 的 重 点。 天然 药物主 要 来 源于植 物，而 植 物的 次 级代 谢 物是其 主 要 的 药效 活 性 成 表 示 。 它 是的 密 码 子 就 越 少 ，所 以 低 丰 度 蛋 白 的 系汀 。 在繁 杂 的 生物体 中 ，高、 低 丰度 蛋 白 的 范 围可高达 陨 希 矣 捎诘 鞍 撞 痪哂蠨 的 特 性 ，不 能被 大量 扩增，所 以 在大规模 的 蛋 白 检测 中 ，很 难鉴定 到低 丰 度 的 蛋 白 ，而 这

7、些蛋 白 可能对细胞 功 能有 重 大的 影响 ，所 以 如 何 分离、 富集 这 些低 丰 度 蛋 白 是科研 工 作 者面 临的 一 个难题 。 第 一 章绪 论辅 酶 等 等 ，它 们间 的 这 种 特 异性 结合 称 为 亲 和力。 根 据 这 种 原 理 建 立 的 色 谱法 即为 亲 和色 谱法 ，不 是任 何 生物分子 都 有 特 定 的 配 基，而 且 不 同的 分离对 象 ，需 要配 备 专 一 的 配 基，选 择特 定 的 色 谱柱 ，这 种 高成 本 的 特 点制约 了 其 广 泛 应用 。 亚细胞 器 分离方 法 主 要 是在进行 蛋 白 提 取 时 ，根 据 线粒体

8、，细胞 核 和细胞 膜 等 亚 细胞 器 来 分离，经过 简化复杂 蛋 白 质 系统 对 蛋 白 进行 细胞 定 位，目前 主 要 有 免 疫 磁珠纯 化分离和密 度 梯度 离心 两种 方 法 。 液相 等 电 聚 焦也是一 种 常用 的 预 分离方 法 ，其 原 理 与 固相 等 电 聚 焦一 致，是根 据 蛋 白 的 等 电 点不 同来 分离蛋 白 ，其 最 火 的 优点是使 上 样量 提 高了 倍，是一 种 制备 型 的 仪 器 。 利用 这 种 方 法 对 鼠脑蛋 白 进行不 管是富集 低 丰 度 蛋 白 还 是去 除 高丰 度 蛋 白 ，目标 都 是为 了 使 生物体 中 与 研究

9、课题 相 关的 蛋 白 得到展示 与 检测 。 从 目前 的 情 况来 看，通 过 预 处理 和分离方 法优 化样本 ，在生物体 中 的 低 丰 度 蛋 白 可以 有 效 地 被 富集 、 检测 与 识 别 ，然 而 ，有太 多技 术 问题 有 待 于进一 步 优 化，低 丰 度 蛋 白 的 总 体 展示 才有 可能实现 ，从 而 为不 同生物体 的 研 究 提 供条 件。 紫 外光 对 植 物基因表 达 的 影响 本 课题 的 研 究 目的 、 意义及 内容本 课题 研 究 的 目的 是揭示 紫 外诱 导 及 不 同暗培 养 时 间 对 阔 叶 十 大功 劳 叶 巾 活性 天然 产物的 影响

10、 ，采用 技 术 分析 诱 导 前 后指纹图 谱的 变 化，得到最 优 诱 导条 件。 利用 差 异蛋 白 质 组 学 、 低 丰 度 蛋 白 富集 技 术 楹 想呐涮 蹇 釩 及 等 技 术 ，对 诱 导 前 后活 性 成 分变 化的 机 理 进行 研 究 ，从 蛋 白 质 和基因水 平揭示 紫外诱 导 提 高活 性 天然 产物的 机 制。 径 中 若 干 个关 键 基因进行 相 对 定 量，在基因水 平上 阐 释 其 生物合 成 机 理 。 第 二 章紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 间 后阔 叶 十 大功 劳 叶 指纹图 第 二 章紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 间 后阔 叶 十

11、大功 劳 叶 指纹图 谱的 建 立 流 动 相 选 择 为 撼 逡 表 程 序十 大功劳 叶 片 中 主 要 生物碱 鉴定对 比 分析 ，并 对 诱 导 条 件进行 筛 选。紫 外诱 导 的 实验 流 程 见 图 。 浙江 大学 硕 士学 位论文气。觥觥觥鯻图 阔 叶 十 大功 劳 总 提 物指纹图 谱 诱 导 前 后及不 同培 养 时 间 后指纹图 谱的 对 比 及条 件筛 选 诱 导 组 和不 同培 养 时 间 与 对 照 组 和不 同培 养 时 间 的 指纹图 谱对 比 见 图 第 二 章紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 间 后阔 叶 十 大功 劳 叶 指纹图 谱的 建 立 第 二 章

12、紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 间 后阔 叶 十 大功 劳 叶 指纹图 谱的 建 立 第 二 章紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 问后阔 叶 十 大功 劳 叶 指纹图 谱的 建 立标 准 品指纹图 谱 母 鲋 饕 锛 畹 幕 峁 谷 缤 。图 浙江 大学 硕 士学 位论文第 二 章紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 间 后阔 叶 十 大功 劳 叶 指纹图 谱的 建 立 浙江 大学 硕 士学 位论文 ， 其 鳬 嗡色 疆 。 表 阔 叶 十 大功 劳 叶 片 中 小 檗 碱 含 量 测 定 浙江 大学 硕 士学 位论文第 二 章紫 外诱 导 及 不 同培 养 时 间 后阔 叶 十 大功 劳

13、 叶 指纹图 谱的 建 立 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究劳 生理 及代谢 的 影响 做 有 益的 探 索。 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究二 钠 、 学 纯 贾 莼 约 劣 邢薰 。过 饱 和硫 酸 铵 一 甲 醇 溶 液配 制： 称 取硫 酸 铵 夜，置 冰箱 保 存 备 用。光 酶 诱 导 仪 诙 ； 冰箱 ；紫 外诱 导 处理 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 取 上 清液，加入 相 同体 积 的 鞍 滋崛海 行 沟

14、 羯 锨 澹 迷 涞膌 甲 醇 清洗 沉 淀 ；紫 外诱 导 后叶 片 提 取 物的 分析 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究图 诱 导 组 与 对 照 组 指纹图 谱 紫 外诱 导 前 后十 大功 劳 叶 差 异蛋 白 质 组 学 研 究为 中 提 取得到的 蛋 白 粉 。考 马 斯 亮 蓝 螂 、 ， 甲 叉 、 乙 酸 、 硫 酸 铵 、 甲 醇 、 离心 管、 量筒 、 茁 四 匏 掖 肌姿 帷 酥 健 约 廖 幢 曜 呶 7 治龃 炕蚧 上 海 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研

15、究最 终浓度 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究配 方 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究表 平衡缓冲液配 方毫 克 诙 纹胶馐 泵 杭 毫 克碘 乙 酰胺 。 超 纯 水 ，混 合 摇匀， 乙 酸 ，加甲 醇 缓蠹 型 超 声波 清洗 机 匠 瞧 饔 邢薰 ；脱色 摇床 虾 芤 瞧 饔 邢薰 ； 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 冰箱 ； 枰 溶 液测 定 吸 光 值并 绘 制标 准 曲线：表 标 准

16、曲线梯度 显 色 液 虏 舛 庵 担 舛 炭 刂圃 之内 。 绘 制标 准 曲线，计算蛋 白 样一 向等 电 聚 焦 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究覆 盖 胶条 ，其 余 胶条 槽 内 加适 量的 矿 物油 防止 聚 焦过 程 中 矿 物油 耗干 。 最 后，盖上 盖 子 ，启 动 等 电 聚 焦仪 椅 驴 刂圃 。 具 体 等 电 聚 焦程 序如 表 所 示 表 示 立 刻上 升至 设定 电 压并 保 持 ， 硎局 鸾 仙 辽 瓒 缪 表 等 电 聚 焦程 序最 大电 流胶条 平衡 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后

17、的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究应用 ； 将 匹配 率 最 高的 一 块胶然 后再加入 后离心 ，将 上 清转 移 到一 个新的 管中 。 在原 管中 再加入 ，超 声 后离心 ，合 并 上 清液。 然 后将 合 并 的 上 清液真 空 干 燥 。两次 ，再用 芤 浩 胶 危 蝗缓蠼 玓 伸入 样品溶 液中 反复吸 进 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 大于 的 视为 鉴定 成 功。图 法 标 准 曲线 浙江 大学 硕

18、 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究效 蛋 白 点。 质 谱鉴定 个差 异点 倍或 ，如 图 所 示 ： 。 。一 鼋 岫差 异蛋 白 的 鉴定 结果率点 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 颿 氯化还 原 篲 阱 协 迫 相 关 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 氮 代 谢为 中 提 取 得到的 蛋 白 粉 。 悸 硭 沽 晾 禛

19、 集 团 化学 试剂 有 限 公 司 螂 、 尿 素 騁 、 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究电 泳 恒温 系统 型 超 声波 清洗 机 匠 瞧 饔 邢薰 ；脱色 摇床 虾 芤 瞧 饔 邢薰 ； 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 取 干 燥 后蛋 白 粉 胄墓 苣冢 尤 雔 六氟 异丙 醇 及 三 氟 柱 子 上 样 移 去 柱 子 底端的 帽 子 ，离心 芤 旱街 又 校 竦 胄 ，去 除 废 液； 赐岩 见 实验 试剂 及 耗材 林 又 校 竦 ，离心 蛋 白 定 量一 向等 电

20、 聚 焦 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究差 异点的 胶内 酶 解 及质 谱鉴蛋 白 定 量结果 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究溪 辴 僦溢“。；哪 尽 邸 猳 茹 盆 举 鞫 礴 辫嘞鞠 簟粤 尊哟舅 譬 。 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 编 号种 晨来 源点彤 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究西 咿 外潭性

21、物质 生物降解明 胆 目醇 代 谢 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 嗍 呻 ， 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 簂： 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 画 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 ， 黯 圜 四吡略 台成 塑 垩奎 兰 堡 圭 兰 垡 论文差 异点分析 结果 啪 争 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外

22、诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究画 蛋 白 数 量图 新 差 异蛋 白 功 能分类 及 其 变 化情 况 阔 叶 十 大功 劳 差 异蛋 白 质 组 学 综 合 分析 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究蛋 白种 来 源 痮 胆 回醇 代 谢 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 激 素代 谢 氯化还 原 蛋 白 相 关 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究植 物体 内 扮 演 着重 要 的 角

23、色 ，是各 种 生物合 成 过 程 的 甲 基供体 如 琑 ，蛋 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究合 物如 生物碱 的 合 成 。 热休 克蛋 白 在植 物体 内 是一 类 典 型 的 协 迫 反应蛋白 的 正 常功 能，包 括一 些涉及 到生物碱 生物合 成 的 关键 酶 。 第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 浙江 大学 硕 士学 位论文第 三 章十 大功 劳 叶 片 紫 外诱 导 前 后的 差 异蛋 白 质 组 学 研 究 谆 谝 黼垮 第 四章阔 叶 十 大功 劳 叶 片 差 异表 达 基因研 究第四章阔 叶 十 大功 劳 叶 片 差 异表 达 基因研 究 第 四章阔 叶 十 大功 劳 叶 片 差 异表 达 基因研 究 确拢 约 廖 幢 曜 呔 7 治龃 杭 州 化学 试剂 有 限快 速 混 匀器 莅 幕 R瞧 饔 邢薰 ；水 平电 泳 槽 止 ； 浙江 大学 硕 士学 位论文第 四章阔 叶 十 大功 劳 叶 片 差 异表 达 基因研 究混匀； 粗 海 ，室 温 ， ，弃 穿 透液，重 复一 遍。 往 离心 吸 附 柱 中 加 甋 的 去 酶 液，混 匀数 次 ； 第