《蛋白酶活力测定》PPT课件.ppt

1、蛋白酶活力测定,一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作手续 五、计算 六、注意事项,一、概述,1什么是酶？ 2影响酶催化反应的因素 3什么是酶的活力? 4测定意义 5. 测定方法,生物催化剂 特殊催化功能的蛋白质,酶的特性:,（1）作用有专一性、选择性 （2）催化速度快 （3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质,一种酶只作用一种底物： 淀粉酶：只能催化淀粉水解 糊精、低聚糖； 蛋白酶：只能催化蛋白质水解 氨基酸、肽；,在激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用下，它的二、三结构会发生改变。而变性，失去催化能力这种现象叫做酶的失活,底物浓度 pH 温度 时间,V Vmax 底物

2、浓度C C0 饱和浓度,底物浓度,OD pH pH最适,溶液pH的影响,酶的分类,酸性蛋白酶 3350 pH最适=24； 7401 pH最适=3.0 中性蛋白酶 1398 pH最适=77.5； 166 pH最适=78 碱性蛋白酶 2709 pH最适=911； 209 pH最适=9.511,OD T（） T最适,温度的影响,3350：T最适 ：45-47 40以下稳定 1398：T最适 ：30-37（pH：6.0-6.5 ） T最适 ：40-50（pH：7.0-7.5 ） 2709：T最适 ：45-55 40以下稳定。,Q（反应物的消耗量或生成物的生成量) t0 t,作用时间的影响,o,A,dQ

3、 dt,K,dQ dt,v,结 论,酶催化反应 在反应初速度时间内 最适温度 最适pH 饱合底物浓度 在最大活力处比较,在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。 表示为：单位/g或单位/ml。通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为5万单位，即：50000g/g =0.05g酪氨酸/1g酶粉。,蛋白酶的活力定义：,测定意义,生皮蛋白质,胶原蛋白（80%-85%）,非胶原蛋白,弹性蛋白 网硬蛋白 间质蛋白,酶的活力会下降 酶的催化能力强,测定方法,乙醇滴定法、甲醛滴定法等 Folin-酚法，紫外分光光度法，残氮量测定

4、法等等。 Gross法、明胶粘度下降法、凝乳作用法 酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋白酶原激活作用的大小来表示。,福林试剂，在碱性情况下极不稳定。可被酚类化合物还原，而呈蓝色反应。由于蛋白质或水解产物中含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)也呈这个反应，因此可以利用这个原理来测定蛋白酶活性的强弱。,二、测定原理,1酶催化反应,酪蛋白,酶催化,条件,酪氨酸,白色至黄色粉沫，无臭无味，溶于稀碱、浓酸，在弱酸中沉淀，几乎不溶于水，有吸湿性，干燥时稳定，潮湿时迅速变质。,条件： 底物浓度 温度 pH 时间 选择： C0 T最适 pH最适 t0 措施： C C0 恒温水浴 缓冲溶液 t= t0 例子： 53

5、7 0.5%酪蛋白 40 3.0 10min 例子： 1398 0.5%酪蛋白 40 7.5 10min 例子： 2709 0.5%酪蛋白 40 10 10min,2.显色反应,福林试剂 + 酪氨酸 OH- HO CH2CHCOOH 还原性 NH2,钼蓝+钨蓝,蓝色物质,显色剂,Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 福林试剂 HCL Li2SO4 Br2,显色剂,亮金黄色,3朗伯-比尔定律及其应用,E 吸光度 A 消光值 OD 光密度 E = KL = lg（I0/I） = K C 透光率 T = I I0,入射光强度I0,透过光强度I,有色真溶液,C,L,朗伯-比尔定律的应用,X

6、 RX OD,被测组分的浓度与光密度OD成直线关系,X OD,OD=KCRX,OD= KCX,选择max,注 意:,max =680nm,OD值的范围,OD=0.20.6 OD=0.43,4制作标准曲线,酪氨酸浓度C OD C1 OD1 C2 OD2 C3 OD3 Cn ODn,福林酚法测定蛋白酶活力 方法要点,配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定条件下（T、pH、t）与福林试剂显色后，测定光密度OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入

7、福林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较，计算出被测酶制剂的活力。,三、试剂,10 CL3CCOOH 水溶液 0.55mol/L碳酸钠溶液 缓冲溶液 福林试剂 显色剂 一种杂多酸,磷钼酸 H3P（Mo3O10）4 磷钨酸 H3P（W3O10）4,福林试剂的配制,Na2WO42H2O 100g Na2MoO42H2o 25g Li2 SO4 50g H2O 100ml 10hr + 85H3PO4 50ml H2O 50ml 浓HCL 100ml 混匀 + 溴水 15 冷却 黄色 过滤,回流,金黄色溶液,(1)柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液pH=3.0,A液：0.1mol/L柠檬酸 21.01g C6

8、H8O7H2O 1000ml CH2COOH HOC COOH CH2COOH B液：0.1mol/L柠檬酸纳 29.4g Na3C6H5O72H2O 1000ml 用时：AB=18.61.4混合,柠檬酸柠檬酸钠溶液的pH计算,弱酸弱酸盐缓冲体系 pH = pka1+lg（C酸/C盐） = 3.13+ lg（C酸/C盐） 柠檬酸: pKa1 = 3.13 pKa2 = 4.76 pKa3 = 6.40,（2）0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液,A液：0.2mol/L NaH2PO4溶液 31.2g NaH2PO42H2O 1000ml,B液：0.2mol/L Na2HPO4溶液 71.7g N

9、a2HPO412H2O 1000ml, pH=7.2的磷酸盐缓冲溶液,A液 28ml B液 72ml,H2O,1000ml, pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液,A液16ml B液84ml,H2O,1000ml,磷酸盐缓冲溶液pH计算,pH = pKa + lg（C酸/C盐） H2PO4- = 7.21+lg HPO4= Ka2 = 6.1710-8,（3）硼砂氢氧化纳缓冲溶液 pH=10,A液：0.055mol/L Na2B4O7 8 H2O 19g Na2B4O7 8 H2O 1000ml B液：0.2 mol/L NaOH 8g NaOH 1000ml A液50ml B液43ml,H2O,20

10、0ml,硼砂氢氧化纳缓冲溶液的pH计算,弱酸弱酸盐缓冲体系 Na2B4O7 + 7H2O NaOH + 4H3BO3 H3BO3 + H2O B(OH)4- + H+ 一元弱酸Ka=5.610-10 pH=pka1-lg（C酸/C盐） =9.24- lg（C酸/C盐）,四、操作手续,（一）制作标准曲线 1配制100g/ml酪氨酸标准溶液 2配制系列浓度的酪氨酸标准溶液 3. 与福林试剂反应显色，测OD值 4. 绘制标准曲线 （二）测定蛋白酶活力实测 1缓冲溶液的配制 2底物配制 3待测酶液配制 4测定,（一）制作标准曲线,1配制100g/mL酪氨酸标准溶液,0.1000g酪氨酸 0.1mol/

11、LHCL 100ml容量瓶 1mg/ml=1000g/ml 再移取10ml 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶 0.1mg/ml=100g/ml,思考题,为什么酪氨酸要干燥至恒重？ 为什么酪氨酸要称准至0.1000g？ 为什么酪氨酸用盐酸溶解？ 为什么要先配成1000ug/ml，再配成100ug/ml？,2配制系列浓度的酪氨酸标准溶液,3系列浓度的酪氨酸显色并测OD值,酪氨酸标准溶液1ml 摇匀 10分钟 蓝色 冷却 1cm比色皿 680nm波长,5ml0.55mol/L Na2CO3,40水浴,0号调零，测OD值,福林试剂1ml,说明,（1）各试剂均用刻度移液管移取 （2）显色后需冷却

12、到室温 （3）每一点测两份，OD0.01 共3618支干试管,4数据处理,（1）画图求直线斜率的倒数K （2）计算K （3）直接查取 （4）计算机处理，回归曲线：C=K.OD,（1）画图求直线斜率的倒数K,C K = OD （g/ml OD）,OD,C,C（g/ml）,C,OD,（2）计算K,Kn = K1+K2+K3+K4+K5 K=,Cn,ODn,5,（3）直接查取,（4）计算机处理，回归曲线：C=KOD,（二）测定蛋白酶活力实测,1缓冲溶液的配制 2底物配制 3待测酶液配制 4测定,1缓冲溶液的配制,酸性蛋白酶。如：537 pH最适=3.0 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液 pH=3.0 中性蛋白

13、酶。如：1398 pH最适 =77.5； 0.02mol/L的磷酸缓冲溶液 pH=7.5 碱性蛋白酶。如：2709 pH最适 = 9 11； 硼砂氢氧化纳缓冲溶液 pH=10,2底物配制,中性、碱性蛋白酶 0.5或2酪素 饱合浓度,0.5酪素溶液的配制,0.5g酪素 润涨 透明 调pH =pH最适 冷却 100ml,0.5mol/L的NaOH,0.1mol/L的HCL,沸水浴,pH=pH最适的缓冲溶液,3配制待测酶液,0.5g酶粉 研磨 5 研磨 5 搅拌 沉降 转移清液 研磨 反复3-4次 200ml 8层干沙布 过滤 吸取 10ml滤液 100ml容量瓶,缓冲溶液,配制酶液的关键,稀释倍数与称量质量的原则 光密度OD=0.4（或0.2-0.6） 研磨时间,酪蛋白 酪氨酸 酪氨酸 + 福林试剂 蓝色溶液,3测定,酶催化,条件,操作手续（一）,操作手续 (二),测定OD 值,测定温度：室温 比色皿厚=1cm max=680nm “0”号调零，测1、2平行管 OD0.01