川芎总酚酸提取工艺研究

学校代码：10661 中图分类号：R9专业代码：100801 学生学号 0711140104遵义医学院本科毕业论文（设计）论 文 题 目： 川芎总酚酸提取工艺研究 部 系： 药学院 专 业： 药物制剂 年 级： 2007 级 指 导 教 师： 张茂生 遵义医学院教务处制2011 年 4 月 10 日遵义医学院本科学士论文第 II 页 共 29 页目 录摘 要 .IAbstract .II前言 .11. 材料与方法 .11.1 仪器 .11.2 材料 .21.3 提取方法 .21.4 紫外分光光度法测定酚酸含量 .21.4.1 对 照 品 溶 液 配 制 .21.4.2 供试品溶液配 制 .21.4.3 最大波长选择 .21.4.4 标 准 曲 线 绘 制 .41.4.5 精 密 度 试 验 .51.4.6 稳 定 性 试 验 .51.4.7 重 复 性 试 验 .51.4.8 加 样 回 收 试 验 .61.4.9 样 品 测 定 .62. 结果 .62.1 均匀设计优化提取工艺 .62.2 因素水平设置 .62.3 实验安排及结果 .72.4 工艺筛选 .82.5 优选工艺条件验证试验 .83. 结论 .94. 讨论 .9参考文献 .10译 文 原 文 .11致 谢 .24遵义医学院本科学士论文第 I 页 共 29 页川芎总酚酸提取工艺研究摘 要目的：寻找川芎总酚酸提取优化方法。方法：选用 L9(34)进行均匀设计实验对阿魏酸和总酚酸提取工艺进行优选，以阿魏酸含量和总酚酸含量为指标，考察乙醇浓度、液固比、提取时间及提取次数对总酚酸和阿魏酸提取的影响。结果：采用 80%乙醇、液固比为 12 倍量、提取时间为 2h、提取 3 次，川芎中的阿魏酸及总酚酸，可以获得较高的提取效率。结论：均匀设计法是优化多因素与多水平实验的有效方法，该优化工艺阿魏酸和总酚酸得率较高，稳定性好，适合于工业生产。关键词：川芎；总酚酸；均匀设计；紫外分光光度法遵义医学院本科学士论文第 II 页 共 29 页Optimization of Extracting Technology of total phenolic acid of Ligusticum Chuanxiong Hort. Abstract Objective: To optimize an extraction method of total phenolic acid of Ligusticum Chuanxiong HortMethods: The extracting conditions was optimized bg using L9(34) homogeneous design. With the content of ferulic acid and total phenolic acid as the observation index. The effects of ethanol concentration, liquid-solid ratio, extrac- tiontime and extraction times were investigated. Results: The more effective way to extract phenolic acid from Ligustlcum chuanxiong Hort was extracting with the liquid solid ratio for 12 times amount of 80% alcohol for two hours, refluxing and extrac- tion for 3 times. Conclusion: The extraction method showed greater effects than others on the extraction efficiency of ferulic acid and total phenolic aci content. It is available for industrial productionKey words: Ligusticum chuanxiong Hort.; Total phenolic acid; Homogeneous design; UV spectrophotometric method遵义医学院本科学士论文第 1 页 共 29 页前 言川芎为伞形科植物川芎(L igusticum chuanxiong Hort.)的干燥根茎，气 浓 香 ， 味 苦 、 辛 ， 是常 用 中 药 ， 始 载 于 神 农 本 草 经 ， 列 为 中 品 ， 被 誉 为 “血 中 气 药 ”。 川 芎 及 川 芎 为 主 的制 剂 对 冠 心 病 心 绞 痛 有 很 好 的 疗 效 ， 通 过 配 伍 ， 可 用 于 坐 骨 神 经 痛 、 末 梢 神 经 炎 、 缺 血 性 脑病 等 疾 病 的 治 疗 。 另 外 ， 川 芎 可 代 茶 饮 美 容 、 制 成 耳 枕 能 辅 助 治 疗 高 血 压 。川 芎 含 生 物 碱 、 酚 类 、 内 酯 类 以 及 中 性 油 类 等 多 种 成 分 1。 由 于 化 学 成 分 复 杂 ， 有 效成 分 药理活性表现出多种作用，主要为：抑 制 血 小 板 激 活 ， 防治脑缺血，保护血脑屏障，改善血液流变性，抗脂氧化作用，对心血管系统作用，清除氧自由基、防治再灌注损伤作用，抗过敏、抗血管炎症作用，减轻肺水肿，防治急性呼吸窘迫综合征和急性肺损伤，抗炎和抗肿瘤等活性，同时对心、肝、肺、肾、血液系统均无损害 2，临 床 主 要 用 于 治 疗 脑 血 管 疾 病 、 肺 心 病 、慢 性 肾 病 与 肝 病 、 神 经 性 疼 痛 等 。 川 芎 对 呼 吸 系 统 、 骨 髓 造 血 、 泌 尿 和 消 化 系 统 、 心 脑 血管 系 统 、 胃 功 能 有 一 定 的 作 用 和 影 响 ， 并 具 有 解 痉 、 抑 制 血 小 板 凝 集 、 抗 癌 、 抗 自 由 基 作 用1,3-6。 阿 魏 酸 、 咖 啡 酸 、 原 儿 茶 酸 、 亚 油 酸 、 瑟 丹 酸 、 大 黄 酚 、 川 芎 酚 、 香 草 酸 及 对 羟 基苯 甲 酸 等 酚 酸 类 成 分 具 有 抗 血 栓 、 降 血 脂 、 防 治 冠 心 病 等 药 理 活 性 7。 目 前 国 内 外 关 于 川芎 的 研 究 较 为 广 泛 和 深 入 ， 一 些 以 川 芎 有 效 成 分 为 原 料 制 成 的 药 物 在 临 床 上 具 有 显 著 的 疗 效 。川 芎 价 格 低 廉 ， 作 用 广 泛 ， 对 川 芎 酚 酸 生 物 活 性 、 中 药 配 伍 、 结 构 改 造 等 方 面 的 研 究 ， 为 总酚 酸 提 供 广 泛 的 应 用 前 景 ； 阿魏酸和总酚酸的含量和稳定性，是研究酚酸类药理活性的前提。因 此 ， 我 们 对 总 酚 酸 的 提取方法进行了较为深 入 的 研 究 。均 匀 设 计 是 一 种 以 少 量 实 验 处 理 多 因 素 多 水 平 的 方 法 ， 近 来 得 到 广 泛 的 应 用 。 该种设计具有方便、迅速、准确、减少实验次数、节省实验时间和费用等优点。刘旭等用正交试验比较了热浸法、超声法、渗漉法、热回流法四种提取工艺，以阿 魏酸含量为考察指标，得出热浸法是比较好的方案 8。本实验采用均匀设计法安排实验，选取乙醇浓度、回流时间、乙醇倍量和提取次数4个因素，各取3个水平，采用热回流法，优选出川 芎 总 酚 酸 较为合理的提取工艺，并对其结论进行验证，该研究为川芎总酚酸的提取分离纯化奠定基础，为生产工艺参数的选择提供一定的科学数据。1. 材料与方法1.1 仪器14 目 标 准 筛 ， 孔 径 1.43 mm（ 浙 江 上 海 市 道 墟 张 兴 纱 筛 厂 ） ； SHZ- III 型 循 环 水 真 空 泵（ 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ） ； BUCHI Rotavapor R-200 旋 转 蒸 发 仪 （ 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ） ；DK-98-I 电 子 恒 温 水 浴 锅 （ 天 津 泰 斯 特 ） ； DZF-2 型 真 空 干 燥 箱 （ 北 京 市 永 光 明 医 疗 仪 器 厂 ）遵义医学院本科学士论文第 2 页 共 29 页； SG5200HPT 超 声 波 （ 上 海 冠 特 超 声 仪 器 有 限 公 司 ） ； SZ-93 自 动 双 重 纯 水 蒸 馏 器 （ 上 海亚 荣 生 化 仪 器 厂 ） ； TU1901 型 双 光 束 紫 外 -可 见 分 光 光 度 计 （ 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公司 ） ； HZT-B100 电 子 天 平 （ d=0.1， 福 州 华 志 科 学 仪 器 有 限 公 司 ） ； FA1004N 电 子 天 平（ d=0.0001， 上 海 精 密 科 学 仪 器 有 限 公 司 天 平 仪 器 厂 ） 。1.2 材料甲 醇 （ 分 析 纯 AR， 上 海 振 兴 化 工 一 厂 ） ； 十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ 化 学 纯 CP， 湖 南 湘 中 化 学试 剂 开 发 中 心 出 品 ） ； 六 水 三 氯 化 铁 （ 分 析 纯 AR， 天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂 ） ； 铁 氰 化 钾（ 分 析 纯 AR， 天 津 致 远 化 学 试 剂 有 限 公 司 ） ； 盐 酸 （ 分 析 纯 AR， 成 都 市 科 龙 化 工 试 剂 厂 ）； 阿 魏 酸 对 照 品 （ 99.6%， 批 号 ： 110773-201012， 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ） ； 川 芎 购 于（ 芝 林 大 药 房 ） ， 经 遵 义 医 学 院 药 学 院 生 药 学 教 研 室 杨 建 文 副 教 授 鉴 定 为 ： 伞形科植物川芎的干燥根茎。1.3 提取方法 取 干 燥 粉 碎 并 过 14 目 筛 川 芎 ， 精 密 称 取 2.0 g 川 芎 于 25 mL 圆 底 烧 瓶 中 ， 按 均 匀 设 计所 设 计 的 各 实 验 条 件 加 入 一 定 浓 度 、 一 定 体 积 的 乙 醇 ， 浸 泡 1 h； 回 流 提 取 按 设 计 （ 见 因素水平设置表 9）的 次 数 和 时 间 ， 趁 热 抽 滤 、 合 并 滤 液 、 减 压 回 收 乙 醇 至 膏 状 、 真 空 干 燥 、 计算 得 膏 率 ； 以 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 阿 魏 酸 及 总 酚 酸 的 含 量 。1.4 紫外分光光度法测定酚酸含量目前国内关于总酚酸含量的测定报道，主要采用铁氰化钾-三氯化铁等试剂显色，再以紫外分光光度法进行酚酸含量测定，如李文兰等 9就 通过该方法 对川 芎 总 酚酸含量进行了测定。1.4.1 对 照 品 溶 液 配 制 精 密 称 取 阿 魏 酸 对 照 品 2.3 mg， 置 于 25 mL 容 量 瓶 中 ， 加 甲 醇 溶 解 并 定 容 ， 即 得 阿 魏酸 0.092 mgmL1 阿 魏 酸 溶 液 。1.4.2 供试品溶液配 制取 川 芎 浓 缩 干 燥 恒 重 膏 体 适 量 ， 精 密 称 定 ， 置 于 25 mL 容 量 瓶 中 ， 用 少 许 甲 醇 超 声 溶 解 ，定 容 至 刻 度 。 摇 匀 ， 作 为 样 品 液 。1.4.3 最大波长选择A. 阿 魏 酸 最 大 波 长 选 择 分 别 精 密 移 取 对 照 品 溶 液 、 供 试 品 溶 液 1 mL 于 10 mL 容 量瓶 中 ， 用 甲 醇 定 容 。 以 甲 醇 为 空 白 ， 用 紫 外 分 光 光 度 法 ， 在 200-800 nm 之 间 扫 描 ， 结 果 表明 ： 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 在 314 nm 处 有 较 大 吸 收 ， 故 选 择 314 nm 为 测 定 波 长 （ 见 图1、 2） 。遵义医学院本科学士论文第 3 页 共 29 页图 1 对照品溶液光谱扫描Fig.1 Spectral scanning control solution图 2 供试品溶液光谱扫描Fig.2 Spectral scanning the test solutionB. 总 酚 酸 最 大 波 长 选 择 分 别 精 密 移 取 对 照 品 溶 液 、 供 试 品 溶 液 1 mL 于 10 mL 容 量瓶 中 ， 分 别 加 甲 醇 1 mL， 0.3%十 二 烷 基 硫 酸 钠 0.8 mL， 0.6%六 水 三 氯 化 铁 -0.9%铁 氰 化 钾（ 体 积 比 为 1 : 0.9） 的 混 合 液 0.4 mL， 混 匀 ， 在 暗 室 放 置 5 min， 加 0.1 mol/L 盐 酸 定 容 ，置 于 暗 室 20 min， 以 不 加 供 试 品 溶 液 为 空 白 ， 用 紫 外 分 光 光 度 法 ， 在 200-900 nm 之 间 扫 描 ，结 果 表 明 ： 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 均 在 734 nm 处 有 最 大 吸 收 （ 见 图 3） ， 故 选 择 734 nm为 测 定 波 长 。图 3 标 准 品样 品对照品溶液和供试品溶液最大波长扫描遵义医学院本科学士论文第 4 页 共 29 页Fig.3 Control solution and the test solution maximum wavelength scanning1.4.4 标 准 曲 线 绘 制A. 阿 魏 酸 标 准 曲 线 精 密 吸 取 阿 魏 酸 对 照 品 溶 液 （ 0.0092 mg/mL）0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL， 注 入 10 mL 容 量 瓶 中 ， 加 甲 醇 定 容 ， 摇 匀 。 以 甲 醇 为 空白 ， 在 314 nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 。 以 阿 魏 酸 质 量 体 积 浓 度 为 横 坐 标 ， 吸 光 度 为 纵 坐 标 ， 得回 归 方 程 为 Y=88.594X+0.0126， R2=0.9994， 结 果 见 表 1、 图 4。表 1 阿魏酸浓度与吸光度Table 1 Consistency and absorbency of ferulic acid 浓 度C（mg/mL ）0.00092 0.00184 0.00368 0.00552 0.00736 0.0092吸 光 度 A 0.096 0.183 0.343 0.509 0.662 0.822图 4 阿魏酸标准曲线Fig.4 Ferulic acid standard curveB. 总 酚 酸 标 准 曲 线 精 密 吸 取 阿 魏 酸 对 照 品 溶 液 （ 0.0092 mg/mL）0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL， 注 入 10 mL 容 量 瓶 中 ， 加 甲 醇 至 2 mL， 加 0.3%十 二 烷基 硫 酸 钠 0.8 mL， 0.6%三 氯 化 铁 -0.9%铁 氰 化 钾 （ 体 积 比 为 1 : 0.9） 的 混 合 液 0.4 mL， 混 匀 ，在 暗 处 放 置 5 min， 加 0.1 mol/L 盐 酸 溶 液 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 置 于 暗 处 20 min， 以 显 色 剂 为 空白 ， 在 734 nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 。 以 阿 魏 酸 质 量 体 积 浓 度 为 横 坐 标 ， 吸 光 度 为 纵 坐 标 得 回归 方 程 为 Y=156.77X+0.0384， R2=0.9982。 结 果 表 明 ： 阿 魏 酸 在 0.9-9 g/mL 范 围 内 呈 良 好线 关 系 ， 见 表 2 和 图 5。表 2 总酚酸浓度与吸光度Table 2 Consistency and absorbency of total phenolic acid浓 度C（ mg/mL）0.00092 0.00184 0.00368 0.00552 0.00736 0.0092吸 光 度 A 0.1880 0.3613 0.6153 0.9188 1.1930 1.4638遵义医学院本科学士论文第 5 页 共 29 页图 5 总酚酸标准曲线Fig.5 Standard curve of total phenolic acid1.4.5 精 密 度 试 验 取 同 一 份 对 照 品 溶 液 ， 重 复 测 定 6 次 ， RSD%为 0.639%， 结 果 见 表 3， 表 明 仪 器 精 密 度良 好 。表 3 精密度试验结果Table 3 Precision of test resultN 1 2 3 4 5 6 RSD%吸光度 0.4005 0.4063 0.4067 0.4067 0.4071 0.4072 0.6391.4.6 稳 定 性 试 验 取 同 一 样 品 溶 液 ， 分 别 于 0、 10、 20、 30、 40、 50、 60 min 测 定 吸 收 度 ， 以 阿 魏 酸 计 算总 酚 酸 含 量 （ 见 表 4） ， 结 果 表 明 ： 样 品 在 20 50 min 内 RSD%为 2.72%， 在 10 min 以 内和 50 min 以 后 ， 吸 光 度 差 异 较 大 ， 故 样 品 溶 液 在 20 50 min 内 稳 定 。表 4 稳 定 性 试 验 结 果Table 4 Stability Test Results 1.4.7 重 复 性 试 验取 同 一 样 品 5 份 ， 每 份 约 17 mg， 精 密 称 定 ， 按 照 “供 试 品 溶 液 制 备 ”项 下 操 作 ， 测 定 ，样 品 中 阿 魏 酸 平 均 含 量 为 0.744%， RSD 为 1.99%； 总 酚 酸 平 均 含 量 为 2.079%， RSD 为2.06%。 结 果 表 明 ， 供 试 品 重 复 性 良 好 （ 见 表 5、 6） 。表 5 阿魏酸重复性试验结果Table 5 Ferulic acid reproducible results样品号 称样量（mg） 阿魏酸的含量（%）阿魏酸平均含量（% ） RSD(%)1 17.2 0.7542 17.1 0.7263 17.2 0.7594 17.1 0.7310.744 1.99时间 t (min) 0 10 20 30 40 50 60吸收度 0.7355 0.8066 0.8420 0.8662 0.8831 0.8972 0.9110遵义医学院本科学士论文第 6 页 共 29 页5 17.2 0.752表 6 总酚酸重复性试验结果Table 6 Total phenolic acid reproducible results样品号 称样量（mg） 总酚酸含量（%）总酚酸平均含量（%） RSD(%)1 17.2 2.1332 17.1 2.0723 17.2 2.0814 17.1 2.0155 17.2 2.0962.079 2.061.4.8 加 样 回 收 试 验 取 已 知 阿 魏 酸 和 总 酚 酸 含 量 的 样 品 6 份 ， 每 份 约 18 mg， 精 密 称 定 ， 分 别 精 密 加 入 阿 魏酸 对 照 品 溶 液 （ 0.092 mg/mL） 0.1 mL， 按 照 “供 试 品 溶 液 制