食品中有害有毒物质的测定

8.食品中有害有毒物质的测定 8.1、概述 (概念、来源、种类、测定意义） 8.2、农药残留量（有机氯、有机磷农药）的测定 8.3、食品中黄曲霉毒素的测定 8.4、食品中苯并芘的测定液相色谱法 8.5、食品中 N-亚硝胺的测定比色法 重点掌握有机磷农药、有机氯农药、黄曲霉毒素的 测定 8.1概述： 有害物质： 在自然界中，当某物质或含有该物质 的物料被按其原来的用途正常使用时，若因该物 质而导致人体生理机能、自然环境或生态平衡遭 受破坏，则称该物质为有害物质。从对机体健康 影响的角度可将有害物质分为普通有害物质、有 毒物质、致癌物和危险物。 有毒物质： 一般的定义为凡是以小剂量进入机体 ，通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的 物质。根据这一定义可知，有毒物质是相对的， 剂量决定着一种成分是否有毒，因而，一般有毒 物质的毒性分级也是以中毒剂量作为基准的 。 来源及种类： 不当地使用农药、兽药，包括施药过量、施药期 不当或使用被禁药物 农药残留（ 有机氯农药 残留、有机磷农药残留） 来自加工、贮藏或运输中的污染，如操作不卫生 、杀菌不合要求或贮藏方法不当 黄曲霉毒素 来自特定食品加工工艺，如肉类熏烤、蔬菜腌制 苯并芘、亚硝胺类化合物 来自包装材料中的有害物质，某些有害物质可能 移溶到被包装的食品中；来自环境污染物 多 氯联苯等； 以及来自食品原料中固有的天然有毒物质 动 植物毒素等。 加强食品中有害物质检测的必要性： v 人们对食品质量要求的提高，食品中有害有毒物质 不断地被发现，其产生的机理、对人体有害剂量的 大小及清除污染的方法不断被人们所认识。 v 对食品中的有害有毒物质进行分析检测，有利于加 强食品质量的监督管理，保障人民的身体健康。 v 人们对食品安全性的要求越来越高，使得世界各国 不断降低食品中有害物质的最高残留量的数值，这 对检测水平提出了新的要求。 本章主要介绍有机氯农药残留、有机磷农药残留、 黄曲霉毒素、苯并芘、亚硝胺类化合物的测定方法 8.2农药残留量的测定 概述 农药 是农业生产中使用的各种药剂的总称，种类很 多，但常用的有有机氯农药和有机磷农药两类。 农药残留 是指一部分农药由于其很强的化学稳定性 ，施用后不易分解，仍有部分或大部分残留在土壤 中、作物上及环境中。 食品中普遍存在农药残留，残留量随食品种类及农 药的种类不同而有很大差异，由于农药的毒性都很 大，有的还可在人体内蓄积，对人体造成危害。为 提高食品的卫生质量，保证食品的安全性，保障消 费者的身体健康，许多国家都对食品中农药允许残 留量做了规定。 测定方法： 气相色谱法是常用的检测农药残留的方法，具有 很高的专一性和灵敏度，对于非挥发性或热不稳定的 农药，如部分有机磷农药可选用 HPLC法。 8.2.1食品中的有机磷农药残留量的测定 气相色谱法 以蔬菜为样品进行讲解和样品预处理的演示 概述： 有机磷农药是农药中一类含磷的有机化合物，其种 类很多，目前大量生产与使用的至少有 60多种。 常见的有机磷农药有：敌敌畏、乐果、马拉硫磷等 。有机磷农药有特殊的蒜臭味，挥发性大，对光、 热不稳定。 多数有机磷农药难溶于水，可溶于脂肪及各种有机 溶剂。敌百虫能溶于水。性质不稳定，应用广泛。 但是，某些有机磷农药属高毒农药，对哺乳动物急 性毒性较强，常因使用、保管、运输等不慎，污染 食品，造成人畜急性中毒。 测定原理： 食品中残留的有机磷农药经有机溶 剂提取并经净化、浓缩后，注入气相色谱仪， 气化后在载气携带下于色谱柱中分离，并由火 焰光度检测器检测。当含有机磷样品于检测器 中的富氢火焰上燃烧时，以 HPO碎片的形式， 放射出波长为 526nm的特征光，这种光通过滤光 片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号 ，经微电流放大器放大后，由记录仪记录下色 谱峰。通过比较样品的峰高和标准品的峰高， 计算出样品中有机磷农药的残留量。 特点及适用范围： 本法采用火焰光度检测 器，对含磷化合物具有高选择性和高灵敏 度，可使有机磷农药残留量的最小检出量 达到 ng级水平，并且对有机磷检出极限比 碳氢化合物高 10000倍，故排除了大量溶剂 和其他碳氢化合物的干扰，有利于痕量有 机磷农药的分析。本法适用于粮食、果蔬 、食用植物油中常见有机磷农药残留量的 测定。 仪器和试剂 (1)仪器 组织捣碎机，粉碎机，旋转蒸发器， 气相色谱仪：附有火焰光度检测器 (FPD)。 (2)试剂 丙酮，二氯甲烷、活性炭、中性氧化 铝等 操作步骤： （ 1）样品的预处理：采用丙酮或二氯甲烷提取 ，并在提取时根据样品性状加适量 无水 Na2SO4 、 中性氧化铝、活性碳以脱水、脱油、脱色 ， 基本上一次完成提取、净化。 (2)操作步骤：提取、净化、浓缩、定容 （ 2）测定： 气相色谱条件： 色谱柱， 气体速度：氮气 50mL/min、 氢气 100mL/min、 空 气 50mL/min。 温度：柱温 180 ，汽化室 220 ，检测器 240 测定：吸取 2 5uL混合标准液及样品净化液， 色谱仪中，以保留时间定性。以试样的峰高或峰 面积与标准比较定量 计算： 式中： X 样品中各有机磷农药单一含量， mg/kg m1 从标准曲线上查得的被测样液中有机磷农药的单一含量 ug/mL V 样品净化液体积， mL； m 样品质量， g。 说明 （ 1）国际上多用乙腈作为有机磷农药的提取试剂及分 配净化试剂，如 AOAC， FDA等采取与有机氯农药 提取净化大致相同的方法来提取、净化有机磷农药 ，即用乙睛或石油醚提取，用乙睛水分配或乙睛 石油醚分配等方法净化。但乙睛毒性大，价格贵 ， 常采用二氯甲烷提取，并在提取时根据样品性状 加适量无水硫酸钠、中性氧化铝、活性炭以脱水、 脱油、脱色，基本上一次完成提取、净化。 （ 2）有些热稳定性差的有机磷农药如敌敌畏在用气相 色谱仪测定时比较困难，主要原因是易被担体所吸 附，同时因对热不稳定而引起分解。故可采用缩短 色谱柱至 11.3m， 或减小固定液涂渍的厚度和降低 操作温度等措施来克服上述困难。 8.2.2有机氯农药残留量的测定 - 气相色谱法 以稻米为样品进行讲解和样品预处理的操作演示 有机氯农药的性质及常见品种 有机氯农药（ OCPs)是农药中一类有机含氯化合 物。常见的有机氯农药有 六六六 (BHC)、 滴滴涕（ DDT）， 均为神经毒性物质，脂溶性很强，不溶或 微溶于水。在生物体内的蓄积具有高度选择性，多 贮存于机体脂肪组织或脂肪多的部位。对光、热、 酸均很稳定。在碱性环境中易分解失效。 原理： 样品中六六六、滴滴涕经 提取、净化与浓缩 后 用气相色谱法测定，与标准比较定量。电子捕获 检测器对于负电极强的化合物具有较高的灵敏度 ，利用这一特点，可分别测出微量的六六六和滴 滴涕。不同异构体和代谢物可同时分别测定。 此法为国家标准检验方法，适用于土壤、粮食、 果蔬、肉、蛋、乳等及其制品中的有机氯农药的 测定。 仪器与试剂： （ 1）仪器 小型粉碎机 小型绞肉机 组织捣碎机 电动振荡器 旋转浓缩蒸发器 吹氮浓缩器 气相色谱仪：具有电子捕获检测器 (ECD) (2) 试剂 丙酮 正己烷； 石油醚：沸程 30 60 ； 苯； 硫酸； 无水硫酸钠； 硫酸钠溶液 (20g L)； 六六六、滴滴涕标准溶液 :作为储备液存于冰箱中。 六六六、滴滴涕标准使用液 操作步骤： （ 1） 提取： 由于大多数有机氯农药是弱 极性化合物，其脂溶性高，故可用弱极 性的有机溶剂进行提取，如丙酮、已烷 、乙醚及石油醚等。由于食品种类繁多 、组成复杂，故需根据样品种类及其含 水量选择恰当的提取剂，并采用不同的 提取方法。 对于粮食及脂肪含量高的食品如动植物油 脂、奶油等，可直接用石油醚或环己烷提取 。 对于蔬菜、水果及蛋与蛋制品，可先用亲 水性溶剂丙酮提取，然后加硫酸钠溶液稀释 ，再以石油醚提取有机氯农药。加硫酸钠的 目的是增大丙酮液的极性，降低有机氯农药 在丙酮中溶解度，使其更完全地转移到石油 醚中，而水溶性杂质则留在丙酮层中。 对于乳及乳制品，由于脂肪球外包围一层脂 肪球膜，为利于脂肪与有机氯农药被有机溶剂 提取，应先加入乙醇与草酸钾并振摇，以破坏 脂肪球膜，然后以乙醚 石油醚提取，提取的 醚层应经无水硫酸钠脱水去杂。 对于鱼、禽、肉类及其制品，可采用如下两种 方法提取，一是先加入无水硫酸钠研磨至干粉 状以脱水，然后用己烷或石油醚提取；二是加 入高氯酸 冰醋酸（ 1： 1）进行水浴消化处理 ，再用石油醚提取，提取的醚层应经无水硫酸 钠脱水去杂 （ 2）净化： 原因：由于提取液中常含有脂肪、蜡质及 色素等干扰测定的杂质，如 GC分析中， 会引起峰拖尾、色谱柱分离效能下降等， 故须对样品提取液进行净化， 方法： 对于在酸中稳定的 BHC及 DDT等 农药，常采用加入 浓硫酸磺化 的方法进行净 化，常用的操作方法是于提取液中加相当于 提取液量 1/10 的浓硫酸，轻轻振摇并静置分 层，则 提取液中干扰杂质由于浓硫酸的磺化 作用而生成极性大，且易溶于酸、水的化合 物，便与有机氯农药分离而除去 。操作时， 浓硫酸加入量不宜过多，否则会降低有机氯 农药回收率；加入硫酸磺化净化的次数应以 提取液中干扰杂质多少而定，一般 1 3次， 以观察到振摇后硫酸层清亮力度。 （ 3）浓缩： 净化洗涤后的石油醚提取液， 通过无水硫酸钠脱水后于浓缩器中减压蒸 馏浓缩至 0.2 1.0mL,然后再用石油醚定容 ，供测定用。但注意的是绝不可将净化液 蒸干，否则会带来很大误差。 测定 气相色谱参考条件 色谱柱：内径 3 4mm， 长 1.2 2m的玻璃柱， 内装涂以 OV-7 (15g L )和 QF-1（ 20g L)的混 合固定液的 80 100目硅藻土。 Ni一电子捕获检测器：汽化室温度： 215 ；色谱柱温度； 195 ；检测器温度： 225 ； 载气 (氮气 )流速： 90mL min； 标准曲线的绘制： 分别吸取 BHC、 DDT 标准混合溶液 1、 2、 3、 4 、 5L进样，根据各农药组分含量 (ng)与其相对 应的峰面积（或峰高），绘制各农药组分的标准 曲线。 样品的测定： 吸取样品处理液 1.05.0 L进样，记录色谱峰， 根据其峰面积在 BHC、 DDT各异构体的标准曲 线上查得相应的组分含量。 六六六、滴滴涕及其异构体含量按下式计算： 说明： （ 1） 本法采用操作简便的硫酸磺化法来净化样品提 取液。在硫酸磺化时，由于有水生成，故体系内存 在水份则会影响磺化效果，故含水较高的样品经提 取后应用无水硫酸钠脱水，或蒸去提取溶剂后，再 用正己烷溶解，使溶液中不含水份；磺化用分液漏 斗应烘干，不能用水检漏；磺化用硫酸亦宜使用新 开瓶的硫酸。磺化时硫酸体积应每次以提取液的十 分之一为宜；磺化次数一般应以硫酸层无色澄清为 度。有些样品磺化时，会出现乳化层，此时可加少 许乙醇破乳或静置使乳化层基本消失。 （ 2）在本法色谱分析条件下，色谱柱要使 用硬质玻璃柱，若采用不锈钢柱，金属 易引起农药分解。 （ 3）分析液体样品中有机氯农药采样时， 应用玻璃瓶，不能用塑料瓶，因塑料瓶 对有机氯农药测定有严重影响。如 DDT 会因吸附损失等因素而降低， BHC则因 塑料释放出干扰物质而使结果增高。 8.3食品中黄曲霉毒素的测定 概述： 黄曲霉毒素（ Aflatoxins， 简写 AFT） 是黄曲霉 、寄生曲霉及温特曲霉等产毒菌株的代谢产物 （后者产量较少），是一群结构类似的化合物 。根据其在波长为 365nm处紫外光下呈现不同 颜色的荧光而分为 B、 G二大类，其中 B大类在 氧化铝薄层板上于紫外光照射下呈现蓝色荧光 ；而 G大类则呈绿色荧光。 B大类包括 AFTB1、 B2、 M1、 M2等， G大类中有 AFTG1、 G2等。人 及动物摄入 AFTB1、 B2后，在乳汁和尿中可检 出其代谢产物 AFT M1、 M2。 性质： AFT在水中的溶解度很低，也难溶于乙醚、石油 醚及己烷中，易溶于油和甲醇、丙酮、氯仿、苯 、乙醇等有机溶剂。 AFT是一组性质比较稳定的化 合物，其对光、热、酸较稳定，而对碱和氧化剂 则不稳定。用次氯酸钠溶液、氯、过氧化氢、高 锰酸钾、漂白粉等均可使 AFT分解被破坏掉，并且 氧化剂浓度越大，则 AFT分解速度越快。 AFT主要污染粮油及其制品。如花生、花生油、 玉米、大米等， 其污染程度与各种作物生物学特 性和化学组成以及成熟地所处的气候条件有很大 关系。一般来说，富含脂肪的易产生 AFT。 AFT 属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，是目 前发现的最强的化学致癌物质，其中以 AFTB1 的毒性和致癌性最强。 在 AFT中，由于 AFTB1 的毒性大、污染最广泛，在一般情况下如未检 查出 AFTB1， 就不存在其它的 AFT， 故食品卫 生检测中主要以 AFTB1为主要指标 测定方法： 主要有薄层色谱法、微柱色谱法及 带荧光检测器的液相色谱法等，其中薄层色谱 法为我国 AFT标准分析方法中的第一法。 目前，实验室使用最多的是酶联免疫吸附剂（ ELISA） 试剂盒对 AFTB1 的残留量进行测定 v 酶联免疫吸附剂（ ELISA） 试剂盒是依据 GB/T5009.22-2003第二法的原理制成的，测定 的实质是采用酶标记的抗体或抗原与样品中的 抗原或抗体间进行的抗原 抗体反应，加入显 色液后，通过目测观察颜色来做快速的半定量 的结果分析。 测定原理： 样品中的 AFTB1经提取、脱脂、浓缩 后与定量的特异性抗体（抗黄曲霉毒素 B1单克 隆抗体）反应，多余的游离抗体则与酶标板内 的包被抗原（ AFB1-BSA人工抗原）结合，加入 酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量 。 注意事项： （ 1）由于食品中 AFT分布很不均匀，特别是颗粒样 品，为得到可靠的分析结果，采样时必须注意样品 的代表性。 （）酶联免疫吸附剂（ ELISA） 试剂盒应放在 冰箱中避光保存，并在保质期内使用。 （）由于 AFT是一剧毒且强致癌性物质，使用时应 注意安全防护，实验时应戴口罩，戴手术手套。若 衣服被污染，须用 50%次氯酸钠溶液浸泡 15 30min 后，再用清水洗净。并注意做好实验后的清洗消毒 工作，对于剩余的 AFT标液或阳性样液，应先用 50%次氯酸钠处理后方可倒到指定的地方，实验中 所用的或被污染的玻璃器皿须经 50%的次氯酸钠溶 液浸泡 min再清洗之。实验完毕应用 50%的次氯 酸钠清洗消毒实验台等。 8.4食品中苯并芘的测定液相色谱法 概述： 烟熏、油炸、焙烤、腌制等加工技术，在改 善食品的外观和质地、增加风味、延长保存期、钝 化有毒物质（如酶抑制剂、红细胞凝集素）以及提 高食品的可利用度等方面发挥了很大作用，但随之 还产生了一些有害物质，即 食品加工过程中形成的 有害物质， 相应的食品存在着严重的安全性问题， 对人体健康产生很大的危害。 食品加工过程中形成的有害物质主要可分为三 类： N一亚硝基化合物、多环芳烃和杂环胺。本节 主要简介多环芳烃中的苯并芘和 N一亚硝基化合物 的检测。 苯并芘的来源及性质： 苯并芘是已发现的 200多种多环芳烃中最主要的 环境和食品污染物，是一种强烈的致癌物质，对 机体各器官，如对皮肤、肺、肝、食道、胃肠等 均有致癌作用。 来源： l 食品在熏制、烘烤和煎炸过程中，苯并芘一方 面来源于煤、煤气等不完全燃烧，另一方面来 源于食品中的脂肪、胆固醇等成分的高温热解 或热聚。 l 输送原料或产品的橡胶管道，包装糖果、棒冰 、面包等用的蜡纸，食品加工机械用的润滑油 等都可能含有苯并芘，这样，就可能使得某些 食品在加工环节中被污染。 l 煤、石油、天然气、木材等，当不完全燃烧时 都会产生苯并芘；烧沥青和喷洒沥青时会有大 量苯并芘散发在空气中，这些都可能造成污染 ，进而污染食品原料。 v 苯并芘又称 3， 4-苯并芘，是一种由五个苯环构 成的多环芳烃。常温下苯并芘为浅黄色针状结晶 ，性质稳定，微溶于水、乙醇、甲醇，易溶于环 己烷、己烷、苯、甲苯、二甲苯、丙酮等有机溶 剂。在有机溶剂中，用波长 365nm紫外线照射时 ，可产生典型的紫色荧光。苯并芘在碱性条件下 较稳定。 v 在常温下不与浓硫酸作用，但能溶于浓硫酸；能 与硝酸、过氯酸、氯磺酸起化学反应，人们可利 用这一性质来消除苯并芘。 v 食品中苯并 (a)芘在的测定方法有薄层层析法、荧 光分光光度法、气相色谱和液相色谱法，这里介 绍液相色谱法。 原理： 利用氢氧化钾的甲醇水溶液皂化样品中 的脂肪，多环芳烃以环己烷抽提，再用硫酸净 化，经 Sephadex LH-20色谱柱富集样品中的多环 芳烃，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并 芘从多环芳烃物质中分离出来。与苯并芘标样 比较定量。 仪器： (1)液相色谱仪： 色谱柱： ODS柱，柱长 250mm， 4mm； 柱温： 30 ； 流动相： 75甲醇； 流速： . mL min。 (2)检测器：紫外检测器，波长 287nm 样品处理 ： （）取熏烤肉样用热水洗去表面黏附的杂质、 凉干、去骨头，将可食部分粉碎后备用。 （）样品的皂化、提取、净化、富集。 绘制标准曲线 样品测定 计算 说明： 硫酸能很好的净化样品中的脂肪和其他微量杂 质，硫酸浓度高净化效果好，而硫酸浓度过高 会引起多环芳烃化合物的回收率降低。选择 (6+4)的硫酸效果较好。 8.5、食品中 N-亚硝胺的测定比色法 概述： 食物中的亚硝胺的 来源 主要有： （ 1）由于腌制时盐中亚硝酸盐的作用，如咸鱼、咸肉 （ 2）加热干燥时，空气中氮气氧化成氮氧化物的作用 ，如啤酒、奶粉、豆制品。 所以，亚硝胺检出率最高的食品是咸鱼（尤为海产 品）、啤酒、腌肉制品、奶粉及豆制品等。而新鲜 蔬菜、水果及新鲜肉类检出率很低。 性质： N 亚硝酸胺的化学性质较活泼，在酸性条 件下可分解为相应