聚乙二醇化壳聚糖的合成-正文

1 文献综述 1.1 壳聚糖概述 壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化 学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D 葡萄糖，是甲壳素 N-脱乙酰基的产物，一般而言， N-乙酰基脱去 55%以上的就可称之为壳聚糖，或者说，能在 1%乙酸或 1%盐酸中溶解 1%的脱乙酰甲壳素，这种脱乙酰甲壳素被称之为壳聚糖。结构式如图 1-1： 图图 1-1 壳聚糖结构式壳聚糖结构式 壳聚糖是甲壳素 N-脱乙酰基的产物，一般而言，N-乙酰基脱去 55%以上的就可称 之为壳聚糖，或者说，能在 1%乙酸或 1%盐酸中溶解 1%的脱乙酰甲壳素，这种脱乙酰 甲壳素被称之为壳聚糖。事实上，N-脱乙酰度为 55%以上的甲壳素，就能在这种稀酸 中溶解。作为工业品的壳聚糖，N-脱乙酰度在 70%以上。N-脱乙酰度在 55%70%的是 低脱乙酰度壳聚糖，70%85%的是中脱乙酰度壳聚糖，85%95%的是高脱乙酰度壳聚 糖，95%100%的是超高脱乙酰度壳聚糖。N-脱乙酰度 100%的壳聚糖极难制备。甲壳 素的每个糖基上，也许都有 N-乙酰基，也许不一定都有 N-乙酰基，凡是 N-乙酰度在 50%以下的，都被称之为甲壳素，因为它肯定不溶于上述浓度的稀酸。脱乙酰基程度 (D.D)决定了大分子链上胺基(NH2)含量的多少，而且 D.D 增加，由于胺基质子化而使 壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多，聚电解质电荷密度增加，其结果必将导致其结构， 性质和性能上的变化，至今壳聚糖稀溶液性质方面的研究都忽略了 D.D 值对方程的影 响。 壳聚糖是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，脱乙酰基程度(D.D)决定了大分子链上胺 基(NH2)含量的多少，而且 D.D 增加，由于胺基质子化而使壳聚糖在稀酸溶液中带电基 团增多,聚电解质电荷密度增加，其结果必将导致其结构，性质和性能上的变化，至今 壳聚糖稀溶液性质方面的研究都忽略了 D.D 值对方程的影响。VANDUM 等人1曾研究 了不同离子强度对壳聚糖在稀溶液中的分子尺寸和粘度的影响。结果认为离子强度不 同会改变无规线团的膨胀度进而改变分子尺寸和特性粘度，通过对不同 D.D 壳聚糖进 行 MARK-HOUWINK 方程常数的测定，结果表明 K2A 值随 D.D 值的变化。从而由 MARK-HOUWINK 方程常数 K2A 有规律地依赖于壳聚糖的脱乙酰度而变化，而且在相 同分子量时，随着脱乙酰度的增加,壳聚糖在稀溶液中分子尺寸，特性粘度和扩张因子 等增加，而特性比和空间位阻因子随着脱乙酰度的增加而减少。从而在适用范围内的 任意一个壳聚糖样品通过比较简单的特性粘度测量，即可计算其平均分子量，从而可 积累一些基础数据用于进一步的研究工作。由于壳聚糖和甲壳质具有高化学反应活性 并且易于被一些化学试剂修饰，因此这方面的研究工作进行的较多，也取得了可喜的 成果。从而通过各种方法对壳聚糖进行了性质改良。 国外通过冰冻氢氧化钠-十二烷基硫酸钠系统的简单步骤制备成功了烷基-CHITIN 纤维2，烷基化产生了各种不同链长和体容度的烷基卤素化合物，对水或甲酸的亲合性 的增加，这种亲合性的增加是由于部分分子晶体结构破坏而产生的。核磁共振的研究 表明 C6 位置上的羟基优于 C3 位置被取代，同时也制备了烷基-CHITIN 纤维和薄膜.这 种亲合性质的改善，在以后的壳聚糖应用中有良好的价值。另外还制备出了壳聚糖多 孔小珠，对重金属有螯合作用，也可以用于生物材料的固定化反应。通过碘化卤化制 备了壳聚糖移植共聚物，卤化与碘化的方法主要进行壳聚糖功能集团的改造，其中碘 化条件温和，并可以产生各种反应的前体。该反应易于发生在 C6 位值上，另外用于制 备阳离子移植共聚物，其反应条件在室温和紫外光 308nm 处进行。对壳聚糖各种功能 集团的改造还包括制备羟基壳聚糖，目前国内用甲醛和乙酸酐为交联剂，制备了以壳 聚糖为母体的壳聚糖凝胶 LCM-X，并对其性质进行研究。 国内外关于壳聚糖凝胶的研究及应用报导指出3制备 LCM-X 既不溶于水，稀酸和 碱溶液，也不溶于一般的有机溶剂，但是 LCM-X 是具有活性基团(NH2)的凝胶，并且 具有较好的机械强度和化学性质稳定性等优良性能且不需特殊处理，即带有活性基团 (NH2)，以及其母体几丁质资源丰富，价格低廉，是一种很有应用前景的生物多聚物。 但是由于目前尚未找到适宜的分散剂，致使 LCM-X 未能形成颗粒化的产品，应用受限 制，这一点有待于进一步研究解决。 国内外对水凝胶的方面的研究很重视，开发新的水凝胶资源是主要的任务之一， 水凝胶具有优良的生物相容性，抗凝血性，吸水溶胀性和良好的光学性能。在固定化 酶，细胞分离，蛋白制备，缓释药物，较接触旋的制造以及人工脏器的研究中具有重 要的作用。但是目前在国内外见详细的报导有关壳聚糖水凝胶性质的研究，国内仅对 水凝胶的初步性质进行了探索，结果认为水凝胶以甲醇为成胶介质凝胶的吸胀性最强4。 关于壳聚糖凝胶的研究有待于进一步开展。 壳聚糖的生物相容性良好，在生物医学及制药等方面的应用极其广泛，可用作烧 伤敷料及伤口愈合剂，包扎纱布用壳聚糖处理后，伤口愈合速度可提高 75%。用壳聚 糖制成的可吸收性手术缝线，机械强度高，可长期贮存，能用常规方法消毒，可染色， 可掺入药剂，能被组织降解吸收，免除患者拆线的痛苦。壳聚糖能抑制胃酸和溃疡， 聚乙二醇化壳聚糖的合成 3 具有降解胆固醇及三甘油脂的作用。肝素是一种带有磺酸基、羧基的极有效的抗凝血 剂，硫酸酯化的壳聚糖在结构上与肝素相似，这种类肝素衍生物一般具有相当甚至超 过肝素活性，为提供合成廉价的抗凝血剂提供了有效的途径。此外，壳聚糖还可用于 制作人工肾透析膜和隐形眼镜。由壳聚糖制备出的微胶囊，是一种生物降解型的高分 子膜材料，是优良且极具发展前途的医用缓释体系。 壳聚糖具有高化学反应活性并且易于被一些化学试剂修饰，因此这方面的研究工 作进行的较多，也取得了可喜的成果。从而通过各种方法对壳聚糖进行了性质改良。 如壳聚糖多孔小珠，对重金属有螯合作用，也可以用于生物材料的固定化反应。通过 碘化卤化制备了壳聚糖移植共聚物。卤化与碘化的方法主要进行壳聚糖功能集团的改 造,其中碘化条件温和，并可以产生各种反应的前体。该反应易于发生在 C6 位值上， 用于制备阳离子移植共聚物。其反应条件在室温和紫外光 308nm 处进行。对壳聚糖各 种功能集团的改造还包括制备羟基壳聚糖。 由于壳聚糖在特定的条件下，能发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、 硝化、卤化、氧化、还原、缩合和络合等化学反应，可生成各种具有不同性能的壳聚 糖衍生物。上述反应在甲壳素和壳聚糖中引入了大的侧基，破坏了其结晶结构，因而 其溶解性提高，从而扩大了壳聚糖的应用范围。 1.2 壳聚糖的接枝共聚 壳聚糖的接枝共聚研究最早见于1973年的一篇美国专利，Slagel5等首先将丙烯酰 胺-2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸与壳聚糖的接枝共聚物用于提高纸制品的干态度。1979 年，Kojima等6采用三丁基硼烷( TBB) 作为引发剂用于甲基丙烯酸甲酯与甲壳素的接 枝共聚。1990 年代以后，壳聚糖接枝共聚的研究进入蓬勃发展时期。研究开发了新的 接枝单体、新的引发剂体系、新的合成技术以及可控导入大分子单体，如具有生物相 容性、生物可降解性的合成大分子单体，药物载体用树枝状大分子，可控制释放且能 超分子组装识别的环糊精大分子，甚至与大多数合成聚合物具有很好相容性的单分散 聚烷基唑啉大分子。如果说早期的接枝共聚研究具有尝试性和科学研究的好奇性，那 么这个时期的研究目标则更具理性和目的性，接枝策略也更多样化。 接枝共聚是壳聚糖改性的重要方法之一，由于PEG易与壳聚糖发生交联，一般采 用PEG单甲醚(mPEG)作为接枝单元，与壳聚糖或壳聚糖衍生物葡胺糖单元上的不同位 置结合，即可得到多种PEG化壳聚糖衍生物，如PEG-g-壳聚糖、PEG-g-壳聚糖季铵盐 等。目前的接枝共聚衍生化反应主要在壳聚糖的2-N位置和6-C位置进行。N-PEG化壳 聚糖合成方法主要有两步合成法和一步合成法。 两步法7是常用的壳聚糖接枝方法，第一步先将mPEG活化，一般可通过二甲基亚 砜(DMSO)、二重稳态自由基、醇氧化酶等氧化剂将MPEG氧化为聚乙二醇醛(mPEGA)， 再在酸性水溶液条件下与壳聚糖上的伯氨基反应，即可得到-PEG化壳聚糖。然而 mPEGA的制备过程较复杂，活化程度低，且mPEGA易被氧化，反应中也难以避免醛醇 缩合的发生。因此，Hu等改进了合成路线，先将mPEG在三苯基亚磷酸盐的作用下与 碘代甲烷反应得到碘化mPEG，再与6-三苯基甲基壳聚糖接枝，脱去三苯基甲基后便可 得到N-PEG化壳聚糖。该路线不需使用催化剂，且简便易行。 一步反应法7是在甲酸溶液中，先将溶解的壳聚糖与mPEG混匀，再加入适量甲醛， 壳聚糖上的氨基先与甲醛生成希夫碱中间体，再与mPEG上的羟基结合，即可得到 PEG-g-壳聚糖。该方法制备简单，反应周期短，操作方便。Sugimoto8等认为在对壳聚 糖进行改性时，有必要保留其氨基糖结构单位和大部分氨基，因此对壳聚糖6位C上的 改性就显得非常重要。Makugka9等先用邻苯二甲酸酐在干燥的二甲基酰胺中与壳聚糖 反应，使壳聚糖上的氨基得到保护，然后再通过取代反应即得到一系列mPEG衍生物， 所得到的壳聚糖衍生物均为浅木兰色粉末。 交联改性是壳聚糖常用的改性方法，交联可以增强壳聚糖及其衍生物的力学强度 和耐酸、耐有机溶剂性能。戊二醛是壳聚糖交联改性中最常用的交联剂，然而其细胞 毒性和在肠道pH值下难以溶解的性质限制了它在药物传输系统中的应用。以PEG为交 联剂得到的壳聚糖共聚物，不仅安全无毒，而且其溶胀性能明显提高。Kulkarni4等制 备了PEG-壳聚糖交联聚合物，发现在pH为7.4时，其泡胀率为130%250%，未交联的 壳聚糖在pH为7.4时泡胀率仅为100%。在pH为1.1时，PEG-壳聚糖交联聚合物泡胀率为 170%350%，壳聚糖则已经完全溶解。且当PEG的相对分子质量增加时，聚合物的泡 胀率也随之增加。PEG-壳聚糖交联聚合物在不同pH值环境下均有良好的溶胀性，从而 使其有潜力成为胃肠道缓释给药的载体。 目前关于PEG-壳聚糖共聚物的研究较少，但其合成过程简单，可以克服PEG接枝 壳聚糖共聚物的一些不足，不仅能改善其溶解性能，还赋予其一些新的功能。Ganji等 以KSO为自由基引发剂制备了PEG-壳聚糖聚合物，作为新型的可注射的嵌段聚合物， 该聚合物展现出良好的温敏性，在低温时该聚合物为可注射的液体，而当温度达到体 温时，便转化为不透明的凝胶，便于给药。 1.3 PEG-g-壳聚糖特性 1.3.1 PEG-g-壳聚糖理化特性 对壳聚糖进行化学改性，既可以改善壳聚糖的水溶性，又能赋予壳聚糖一些新的 性能，常见方法有酰化、羧甲基化、巯基化、季胺化以及聚乙二醇(PEG)接枝等。 Harris 等10于 1984 年首先采用还原氨基化反应将 PEG 醛接枝到壳聚糖上的氨基，合成 了 PEG 壳聚糖接枝共聚物。因在壳聚糖中引入亲水性的基团，破坏了壳聚糖分子链排 列的规整性，削弱了壳聚糖分子链间的氢键作用，从而使溶解性能得到改善。近年来 随着国内外对 PEG 化壳聚糖的研究逐渐深人，发现 PEG 修饰不仅能提高壳聚糖的溶解 聚乙二醇化壳聚糖的合成 5 性，而且还可以改善壳聚糖以及壳聚糖衍生物的细胞毒性，从而使聚合物的生物相容 性增加，促进了 PEG 化壳聚糖在多肽药物、基因药物传输以及生物功能材料上的应用。 将 PEG 链引入壳聚糖分子结构，不仅增加其亲水性，还降低了结晶性，使其在两 相中的性能都得到改善。Jeong11等制备了 PEG-g-壳聚糖，并用紫外分光光度计法测定 了壳聚糖，多种相对分子质量 PEG-g-壳聚糖在不同 pH 值水溶液和不同有机溶剂中的 溶解性能。结果表明，壳聚糖溶液在 pH 为 6.0 时开始出现混浊；当 pH 值升至 7.4 时， 则完全析出，且不溶于 DMSO、二甲基酰胺、乙醇等有机溶剂。而 PEG-g-壳聚糖在 pH 为 4.011.0 时均可溶解，而且在 DMSO、二甲基酰胺中也有良好的溶解性。 Mao12等制备的 PEG-g-N-三甲基壳聚糖(PEG-g-TMC)，即使接枝率只有 10%，聚合物 在 pH 为 114 时都可溶于水，且与 PEG 的相对分子质量无关，最大溶解度能达到 50gL-1。而 Jeong 等11制备的不同接枝率的 PEG-g-壳聚糖在水中的溶解度可达到 300gL-1以上。 1.3.2 PEG-g-壳聚糖生物学特性 将壳聚糖进行 PEG 化修饰后，既保留了壳聚糖及其衍生物本身的一些优良性质， 如生物黏附性，促黏膜吸收等，还改善了壳聚糖的生物相容性，提高了壳聚糖作为药 物载体的安全性。尽管壳聚糖一般被认为是安全、可生物降解且无毒的聚合物，但 Schipper8等还是观察到某些壳聚糖的毒性。这是因为壳聚糖是一种阳离子聚合物，在 体内易与红细胞的质膜相结合，并可能与带负电荷的细胞成分和蛋白结合，从而引起 溶血、血栓形成及细胞破裂等安全性问题。而将壳聚糖进行 PEG 化修饰后，由于 PEG 能在水中快速运动，并具有较大的立体排斥效应，可屏蔽掉一部分正电荷，从而降低 了血小板和血浆蛋白的黏附作用和与细胞表面的接触，增加了聚合物的生物相容性 J。考察 PEG 化壳聚糖衍生物生物相容性的常用方法有溶血实验，细胞毒性实验和生 物降解性研究。 溶血实验主要考察阳离子聚合物与带负电荷的红细胞膜的相互作用。Zhu10等制备 了 PEG-g-壳聚糖季铵盐，并考察了不同浓度下壳聚糖季铵盐和 PEG-g-壳聚糖季铵盐共 聚物的溶血率。当共聚物浓度为 2 mgL-1时，壳聚糖季铵盐的溶血率为 13.6%，而 PEG-g-壳聚糖季铵盐的溶血率仅有 7.1%，仅为壳聚糖季铵盐溶血率的一半。这是由于 PEG 减少了共聚物与血浆蛋白和血小板的吸附，使溶血率下降。此外，实验还表明 PEG 的作用与其相对分子质鼍有关，具有较长分子链的 PEG5000 与低相对分子质量的 PEG 相比，更能有效屏蔽共聚物的正电荷，提高材料在血液中的生物相容性。 细胞毒性实验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境、检测材料接触机体组织 后生物学反应的体外实验。Mao9等以 L929 小鼠成纤维细胞为模型测定了 PEG-g-TMC 对细胞代谢活性的影响，发现 TMC 具有一定的细胞毒性，且随着相对分子质量的增加 而增强，TMC(400 ku)的半数抑制浓度(IC)低至 15 mgL-1，而将其进行 PEG 化修饰后， 细胞毒性得到了显著性改善。当以相同相对分子质量(400 ku)的壳聚糖季铵盐进行不同 程度的 PEG 化修饰后，取代度增加与半抑制浓度增加呈线性关系，并且 PEG-g-TMC 与未修饰的 TMC 的细胞毒性有显著性差异。另外，100 ku 和 50 ku 的 TMC 经 PEG 化 修饰后，细胞毒性降为原有的 1/10，孵育 24 h 后，浓度为 500 mgL-1的两种聚合物溶 液中仍有 80%以上的细胞存活。此外，该组还以乳酸脱氧(LDH)实验测定了聚合物对 细胞完整性的破坏程度。结果表明，PEG-g-TMC 的 LDH 释放均低于 6%，而未修饰的 TMC 的 LDH 释放率高达 50.54%，是 PEG-g-TMC 的 8 倍。这更证明了 PEG 修饰对壳 聚糖衍生物细胞毒性的改善作用。 壳聚糖衍生物与 PEG 均为可生物降解的高分子材料，而两者结合所得的共聚物也 展现出良好的生物可降解性。Pozzo13等引合成了 PEG-壳聚糖交联共聚物，并以酶解 法考察了产物的生物降解性。实验结果表明，聚合物对水解酶如木瓜蛋白酶和脂肪酶 敏感，短时间内便有 50%左右聚合物发生降解，而 24h 后聚合物几乎全部降解。与此 同时，聚合物并不会被溶解酵素、淀粉酶、胶原酶所降解。由此可以推测当该 PEG 化 壳聚糖衍生物用于体内药物传输时，可被组织分布广泛的脂肪酶所逐渐降解，从而不 会在体内蓄积。 PEG 化壳聚糖具有卓越的生物黏附性以及促吸收特性，并且还是一种天然低毒的 阳离子聚合物，易与带负电的多肽药物、基因、疫苗等相结合，是生物医药领域极有 应用价值的药物载体之一。 1.4 壳聚糖在药剂学中的应用 由于甲壳质有强的结晶结构，其溶解性和反应性均较差，而壳聚糖是甲壳质的脱 乙酰基产物，它能溶解于pH6的稀酸中，化学性质也较活泼，应用更加方便。另外， 壳聚糖分子中有伯羟基、仲羟基和伯氨基，可对这三个活性基团进行选择性化学反应， 制备出具有其它应用价值的新材料。 壳聚糖来源广泛，性质稳定，生物相容性和可降解性好，毒性极小，应用范围广 泛，在药剂学领域的应用极为活跃。壳聚糖具有很强的亲水性，可在酸性介质中膨胀 形成胶性黏稠物质而阻滞药物扩散及溶出，制成缓释微球与微囊、缓释片、缓释颗粒、 缓释小丸等，其盐也被用于制造胃内漂浮制剂和生物黏附片。由于壳聚糖具很好的成 膜性，在酸性介质中缓慢溶蚀，可作为片剂、颗粒剂等的包衣材料，达到缓释目的。 壳聚糖作为药物载体可以控制药物释放，延长药物疗效、降低药物毒副作用，提 高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物的稳定性及改变给药途径，还可大大加强制剂 的靶向给药能力。壳聚糖作为药物制剂的优点是，能被广泛存在于生物组织中的溶菌 酶降解，生成的天然无毒代谢物，且能被生物体完全吸收。因此，较那些能生成有毒 聚乙二醇化壳聚糖的合成 7 副作用产物的生物材料有明显的优越性。 1.5 聚乙二醇在药物载体中的应用 聚乙二醇(PEG)是一种用途极为广泛的聚醚高分子化合物，它可应用于医药、卫生、 食品、化工等众多领域。目前，在新型生物材料的制备中，聚乙二醇可作为改性基团 赋予材料新的特性与功能14，如亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性等。近 几年，mPEG-g-CS 及其衍生物的研究非常广泛。主要集中应用于纳米药物载体，温敏 凝胶制备，基因治疗以及靶向治疗等方面。运载的药物主要有全反式维甲酸、紫杉醇、 羟基喜树碱等。 2 实验方法 2.1 实验仪器及原料 表表2.1 仪器明细表仪器明细表 仪器名型号生产厂家 电热恒温鼓风干燥箱DHG-9123A上海精宏实验设备有限公司 超声波清洗器KH5200B昆山禾创超声仪器有限公司 数显恒温多头磁力搅拌器HJ-4A上海蓝凯仪器仪表有限公司 冷冻干燥机LY0-0.2M2 SIP上海东富龙科技股份有限公司 真空泵HSZ-D(III)上海豫华仪器有限公司 电子天平FA2004上海箐海仪器有限公司 微量定量移液器Micro Pette Plus大龙兴创实验仪器有限公司 表表2.2 原料明细表原料明细表 原料名规格生产厂家 壳聚糖CP浙江澳兴有限公司 甲酸 98%AR上海凌峰化学试剂有限公司 单甲氧基聚乙二醇AR上海凌峰化学试剂有限公司 37%甲醛AR上海凌峰化学试剂有限公司 无水乙醇HPLC国药集团化学试剂有限公司 37%盐酸AR上海恒信化学试剂有限公司 2.2 实验方法 2.2.1 壳聚糖纯化 称取50g壳聚糖，加入1molL-1NaOH溶液50mL，70搅拌条件下保温2 h，抽滤。 滤饼用去离子水洗涤后于40下烘干。烘干后，溶于200 mL浓度为0.1 molL-1醋酸溶液 中，过滤除去杂质，滤液用1molL-1NaOH溶液调节pH至8。用G4砂芯漏斗抽滤，去离 子水反复冲洗至pH为中性，滤饼冷冻干燥。 2.2.2 mPEG-g-CS 的制备 精密称取 100 mg 纯化后的 CS（分子量 11 万）溶解在 4 ml 98%甲酸中，放置使其 溶解完全。加入 45mlDMSO 稀释，室温磁力搅拌均匀。随后加入一定量 mPEG，持续 搅拌 15 min，加入适量质量 37%甲醛溶液，室温磁力搅拌 1 h。 将反应液移至透析袋（截留分子量 8000-14000 Da）中，去离子水透析 1 天。将透 聚乙二醇化壳聚糖的合成 9 析袋中的溶液转移至烧杯中，3 M NaOH 调节 pH 值至 13，布氏漏斗抽滤，再用无水乙 醇洗涤滤饼。 滤饼移入透析袋中，透析一天，除去里面混有的乙醇，冷冻干燥，得到产物。 2.2.3 mPEG-g-CS 的凝胶色谱检测 采用Agilent1100高效液相色谱系统检测mPEG-g-CS中残留的mPEG是否除尽。色谱 条件：，TSKPWXLG4000凝胶色谱柱，流动相0.2 M CH3COOH，0.1 M CH3COONa， 流速为0.6 ml/min，示差折光检测器，柱温30。标准品为不同分子量的葡聚糖：T- 1(Mw=12,000)，T-2(Mw=50,000)，T-3(Mw=27,0000)，T-4(Mw=670,000)。将mPEG-g- CS溶解在超纯水中过夜，配制成浓度为2 mg/ml的溶液，过220 nm水系滤膜，进样检测。 2.2.4 CS 和 mPEG-g-CS 核磁检测 用 2.85(CH-CS)与 3.10(Me-mPEG)的峰面积比值来计算得到 mPEG-g-CS 的取代度(DS%)。 根据公式 DS%=(A310/3)/A2.85100%，最终计算得出 2 批样品的 mPEG 取代度，样品 I(mPEG-g-CS。)投料质量比(mPEG/CS)为 24：5，DS 为 20%。因此，反应中可以通过 控制 mPEG 和壳聚糖的投料比来获得适宜 mPEG 取代度的 mPEG-g-CS 样品。 2.2.5 临界胶束浓度测定 临界胶束浓度(CMC)是两亲分子形成胶束的最小浓度。测定 CMC 的方法较多，荧 光探针技术是一种比较有效的方法之一。芘是目前应用较多的一种憎水性探针化合物。 当芘以探针的形式加到胶束水溶液中时，通常将其荧光发射谱的第 l 和第 3 强度的比值 Im/I0，作为衡量芘所处环境极性的表征指标。 以嵌二萘为分子探针，用荧光分光光度计测定不同取代度的 mPEG-g-CS 临界聚集 浓度。精密称取 3.0 mg 嵌二萘，用 50 ml 甲醇溶解作为储备液。每次移取 100 l 储备 液，于 10 ml 离心管中，自然挥干甲醇。分别将 6 ml 1.010-54.0 mg/ml 的 12 种不同 浓度的样品加入到含上述离心管中，超声探头超声 2 min（超 1s，停 1s） ，放置 12 h 后 测定荧光光谱。自 350nm 到 400nm 进行荧光扫描，I3:波长 385 nm，I1：波长 373 nm。I1/ I3的强度比值对 lg 浓度作图计算 CAC。 （激发波长 334nm） 3 结果与讨论 3.1 壳聚糖纯化 冷冻干燥后得经纯化的壳聚糖 43.56g，得率为 87.1%。 3.2 mPEG-g-CS 的制备 mPEG-g-CS 冷冻干燥产品为白色棉絮状，三种不同取代度的 mPEG-g-CS 产量和 产率分别为：1150 mg（14.16%，理论取代度10%） 、823 mg（20.27%，理论取代度 17%） 、正在冷冻干燥（理论取代度 25%） 。 3.3 mPEG-g-CS 的凝胶色谱检测 经凝胶色谱检测结果可得，制备的 mPEG-g-CS 未用无水乙醇洗涤（图 3-1） ，凝胶 色谱除在 14.238 出现 mPEG-g-CS 色谱峰外、19.145 min 时还出现了 mPEG 色谱峰。说 明，只用截留分子量为 800014000 Da 的透析袋不能透析除去过量没有反应的 mPEG。将反应液透析一天后，除去有机溶剂。利用 mPEG 与 mPEG-g-CS 在碱性水溶 液中溶解度差异，调解透析液 pH 至 13，使 mPEG-g-CS 析出，布氏漏斗抽滤，得到 mPEG-g-CS 粗产物。mPEG-g-CS 在无水乙醇中溶解度很小，而 mPEG 则易溶于无水乙 醇，利用两者溶解度差异，再次洗涤产物，除去残留的 mPEG。产物分别使用无水乙 醇洗涤 3 次（图 3-2） 、5 次（图 3-3）后的凝胶色谱图显示，保留时间为 19 min 左右的 mPEG 消失，证明 mPEG 已经完全除尽，后处理方法的有效性和可行性。 聚乙二醇化壳聚糖的合成 11 min681012141618 nRIU -1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 RID1 A, Refractive Index Signal (LISI12091601.D) 4.903 5.985 6.559 7.444 7.646 8.248 9.292 9.576 9.680 9.810 9.976 10.148 10.287 10.472 10.609 10.728 11.552 11.704 11.873 12.114 12.197 14.238 19.145 图图 3-1 mPEG-g-CS 产品未洗涤凝胶色谱图产品未洗涤凝胶色谱图 min681012141618 nRIU -1000 0 1000 2000 3000 RID1 A, Refractive Index Signal (LISI12091602.D) 4.878 Area: 496749 13.165 图图 3-2 mPEG-g-CS 产品无水乙醇洗涤产品无水乙醇洗涤 3 次后的凝胶色谱图次后的凝胶色谱图 min681012141618 nRIU 0 1000 2000 3000 4000 RID1 A, Refractive Index Signal (LISI12091603.D) 4.892 Area: 740677 13.012 图图 3-3 mPEG-g-CS 产品无水乙醇洗涤产品无水乙醇洗涤 5 次后的凝胶色谱图次后的凝胶色谱图 3.4 CS 和 mPEG-g-CS 核磁检测 图图 3-4 CS 和和 mPEG-g-CS 核磁共振图谱核磁共振图谱 从图 3-4 可以看出，CS 的图谱中，由于受溶剂的干扰，仅可见 CS 的 2.85(CH-CS)易 于分辨。mPEG-g-cS 图谱中 2.85(CH-CS)，3.10(Me-mPEG)易于分辨，故可用 2.85(CH-CS)与 3.10(Me-mPEG)的峰面积比值来计算得到 mPEG-g-CS 的取代度(DS%)。根据公式 DS%=(A310/3)/A2.85100%，最终计算得出 2 批样品的 mPEG 取代度，样品 I(mPEG-g- CS。)投料质量比(mPEG/CS)为 24：5，DS 为 20%。因此，反应中可以通过控制 mPEG 和壳聚糖的投料比来获得适宜 mPEG 取代度的 mPEG-g-CS 样品。 3.5 临界胶束浓度（CMC）测定 图图 3-5 取代度取代度 15%的的 mPEG-g-CS 临界胶束浓度测定（临界胶束浓度测定（n=3） 聚乙二醇化壳聚糖的合成 13 自 350nm 到 400nm 进行荧光扫描时，出现两个明显的峰，分别出现在在 373 nm 和 395 nm，故共截取 3 个波长处的吸光度：373 nm（I1） 、385 nm （I3） 、395 nm。分 别结算 385 nm、395 nm 处荧光激发波长的强度与 373 nm 的强度比值，结果显示，395 nm 的荧光强度与 373 nm 荧光强度比值没有规律。I1/ I3的强度比值对 lg 浓度作图，拟 合后计算 CMC（图 3-5） ，得取代 15%的 mPEG-g-CS 的 CMC=0.34 mg/ml。 4 结论 通过本次实验结果可以得出： 冷冻干燥后得经纯化的壳聚糖 43.56g，得率为 87.1%。 采用甲醛连接的方法可将 mPEG 接枝于壳聚糖分子，通过调节聚乙二醇单甲醚 与壳聚糖的比例可对接枝反应的取代程度进行控制，以获得适当取代度的 mPEG-g- CS，合成过程中使用的有机溶剂易于除去，反应周期相对较短。因此，此合成方法具 有制备简单，反应周期短，