课件：细胞工程在环境保护方面的应用.ppt

细胞工程在环境保护方面的应用,制作人：吕敏,一、细胞工程概论,细胞工程是即在细胞水平上应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术，按照人们的要求,有计划地大规模培养组织和 细胞以 获得生物极其制品，或以改变细胞的遗传组织或以生产新的品种的工程。,增殖,分化,死亡,细胞分化就是由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。,细胞工程主要研究的是细胞的,（1）细胞增殖是生物繁殖的基础 单细胞生物以细胞分裂的方式产生后代；多细胞生物的繁殖和发育的基础。,细胞衰老和凋亡,1,细胞内水分减少，细胞萎缩，细胞体积变小,2,有些酶活性降低,3,细胞内色素沉积,4,细胞内线粒体数量减少呼吸速率减慢，细胞核增大，染色体固缩，染色加深,5,细胞膜通透性功能改变，物质运输故能降低。,细胞衰老的特征：,老人色斑,皱纹,白发,定义：有基因所决定的细胞自动结束生命的生理过程。受到严格的由遗传机制决定的程序性过程。受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，也常常被称为细胞编程性死亡。 实质：与凋亡相关的基因选择性表达式细胞凋亡,细胞的凋亡,一种正常的生理过程,细胞凋亡的意义： 细胞的自然更新，消除不必要的细胞，而不引起炎症。 多细胞生物正常发育，维持内部环境稳定，抵御外界各种因素的干扰,细胞工程的主要技术和应用包括组织和细胞的培养技术，细胞的融合技术，细胞器移植技术,体外受精技术，物理、化学技术等。目前在 环境治理中应用较多的是细胞培养技术，细胞的融合技术及物理、化学技术。,（一）细胞培养技术 （二）细胞融合技术 1、遗传标记的筛选 2、原生质体制备与再生 3、原生质体融合 4、融合子的鉴定 （三）固定化细胞技术,(一)细胞培养技术,细胞培养技术包括微生物的培养、植物细胞培养以及动物的组织与细胞培养。 微生物的培养主要是指微生物营养结构的研究以及培养方法的研究，其目的是提供用于研究或生产的微生物菌种。 植物细胞培养包括植物器官、组织、细胞、原生质体、胚和植株的培养。它是在植物组织技术基础上发展起来的，是指在立体条件下培养植物细胞的方法。 动物细胞培养是在动物体内获取某些器官或组织的细胞，在模拟体内生理条件下，进行离体培养。常用的方法有微导管培养法、微载体培养法和微胶囊培养法。,（二）细胞融合技术,细胞融合是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞，使一个细胞的遗传物质包括细胞核DNA和核外基因都进入另一个细胞。 它是继转化、转导和接合之后一种更有效转移遗传物质的手段。细胞融合技术能克服遗传障碍，实现远缘杂交；构建集双亲优良遗传性状于一体的融合子，创造有应用前景的生物。其整个过程包括：遗传标记筛选、原生质体的制备、融合与再生、融合子的鉴定。,1、遗传标记的筛选 融合子的筛选是融合过程的关键。目前采用的亲本遗传标记和筛选主要有下列几种方法： （1）营养缺陷型标记 （2）抗药性标记 （3）荧光色素标记 （4）失活原生质体供体法,原生质体制备与再生,（1）制备 根据细胞壁的不同结构与组成，菌体的处理方法不同。 a、在制备细菌、放线菌的原生质体时，主要使用溶菌酶，其中革兰氏阳性菌用溶菌酶处理，革兰氏阴性菌用溶菌酶加乙二胺四乙酸处理。 b、对于酵母、霉菌、大型真菌、植物，由于其细胞壁组成更为复杂，常用纤维素酶、蜗牛酶、几丁质酶等复合酶处理、 原生质体的制备过程中受影响的因素主要有培养基成分、培养方法、菌龄、酶浓度、酶处理温度与时间、pH值、渗透压稳定剂等。,原生质体制备与再生,制备的原生质体已经失去细胞壁，仅有一层厚约10nm的细胞膜，它具有生物活性，但不是正常的细胞，在普通培养基上不能生长，必须涂布与再生培养基上，使之再生为正常的细胞。 再生培养基需补加两类物质： 一类是蛋白质、糖类或氨基酸等营养因子； 另一类是渗透压稳定剂，如蔗糖、丁二酸钠、KCl、Mg2+等。,（3）原生质体融合,1974年，匈牙利的Ferenczy采用离心力诱导的方法报道了白地酶的营养缺陷型突变株的原生质体的融合。随后人们相继用NaCl、KCl和Ca（NO3）2等作为诱变剂进行融合，但融合频率都很低。同年，Kao发现PEG在适量Ca2+存在下能有效地诱导植物原生质体融合，从而是这一技术跃上了新的阶段。大大提高了融合频率。PEC多采用分子量4000和6000两种，Hopwood研究认为这两者融合的效果差别不大。融合率还受PEG和阳离子的浓度、诱导融合时间、pH值等因素的影响。林红雨等采用在融合液中添加新生磷酸钙的方法可以促进原生体融合。在融合方法上，除了化学因子诱导融合外，电场诱导、激光诱导细胞融合的新技术，进一步提高了融合频率。,4、融合子的鉴定,在再生培养基上再生出的标记得到互补的菌落，我们可以初步判定它是融合子。由于这样检出的融合子中，还有部分杂合子、部分二倍体、异合体的存在，所以要对检出的融合子做进一步的鉴定。 鉴定工作一般从形态学、生理生化性质、生物量、遗传学（基因型、DNA含量、GC比值）和同工酶等几个方面进行。近年来，又有人通过限制性内切酶切片段的比较、核苷酸序列分析、分子杂交RAPD技术等分子生物学方法来鉴定融合子。,到目前为止，虽然关于融合子中双亲株遗传物质重组的分子机制还不很明确，但有些问题人们已形成共识：原生质体融合后的细胞处于暂时的二倍体（或多倍体）状态，之后有两种可能：一是染色体不发生重组，两个细胞的染色体共存于个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合子；另一类是两亲株的整套基因组（包括细胞核、细胞质）相互接触，染色体发生多位点交换产生真正的同源重组，从而产生各种各样的基因重组，获得多种类型的重组子，通过连续传代分离纯化可以将这两类融合区分开。另外，融合后染色体的重组是随机的种属间细胞对异源DNA的限制作用及染色体DNA的非同源性，仍是融合的一大障碍。,（三）固定化细胞技术,固定化细胞技术（简称IMC），也叫固定化微生物技术，是指通过化学或物理手段，将筛选分离出的是易于降解特定废水的高效菌株，或通过基因工程技术克隆的特异性菌株进行固定化、使其保持活性并反复利用。固定化细胞有细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、运转费用低、维护管理简单和剩余污泥少等优点，因此，固定化细胞技术已越来越受到人们的重视。,01,02,03,吸附法,包埋法,交联法,固定化细胞的制备方法,按照固定载体与作用方式不同,吸附法（载体结合法） 通过物理吸附、化学或离子结合的方法，将细胞固定在非水溶性载体上。该方法操作简单，细胞活性损失小，载体可反复使用，但所用固定的细胞数量有限，细胞和载体结合不牢，易脱落。废水处理中的生物膜法是其代表性例子。,包埋法 使细胞扩散进入多孔性载体内部或浆细胞包裹在凝胶网格结构中或半透性聚合薄膜内，小分子的底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围介质中去。该法操作简单，对细胞活性影响小，制作的固定化细胞球强度高，是目前研究最广泛的固定化方法，但包埋材料会一定程度阻碍底物和氧扩散，并对大分子底物不适用。,交联法（架桥法） 该法是不用载体的，它利用两个以上功能团试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基羟基等进行交联，形成共价键来固定细胞。此法化学反应条件剧烈，对细胞活性影响大，实际常与其他方法结合。聚集交联固定法是使用凝聚剂将菌体细胞形成细胞聚集体，再利用双功能或多功能交联剂与细胞表面的活性基团发生反应，使细胞彼此交联形成稳定的立体网状结构。这样，高效菌体不易流失，生物浓度高，而提高了处理效果。,03,02,01,植物细胞培养用于可降解塑料的生产,固定化细胞,细胞融合技术构建环境治理工程菌,二、细胞工程在环境中的应用,（一）植物细胞培养用于可降解塑料的生产,利用植物本身作为反应器进行次生代谢产物的生产，发挥植物的生物合成能力，为人类生产所需的原料，现在已经有多种物质可以用培养转基因植物进行生产，例如用植物可以进行可生物降解的生产。聚羟基烷酯（PHA）是一种可以用来制备可生物降解塑料的单体原料。以乙酰-CoA为前提合成的，现在主要用微生物发酵法进行生产。 自从1992年美国科学家首次进行了植物生产PHB的尝试后，Somervilles小组于1994年改进了策略，将PHB定位于质体。英国Zenica公司将phbA、phbB、phbC基因导入了油菜，利用Rubisco小亚基转运肽将三个基因定位于叶绿体中表达，提高了产量。美国Monsanto公司的科研人员正在同时进行转基因油菜和大豆生产PHB的研究。德国Terthewey利用马铃薯在块茎的胞质和线粒体中合成PHB.Padgette等在研究基因植物生产PHB的同时将植物生产共餐物PHBV也摆上了日程。利用环基因植物进行PHA的生产可以极大地降低成本，从而有利于推广生物降解塑料的生产和使用。,（二）细胞融合技术构建环境治理工程菌,1、纤维素降解菌原生质体融合 两株脱双香草醛（与纤维素相关有机化合物，简称DDV）降解菌Fusobact erium varium和Enterococcus faecium，当它们单独作用时，在8天内可降解3%10%的DDV，混合培养时，降解率可达30%，说明有明显的互生作用。将两株菌进行细胞融合，融合细胞（FET菌株）的降解率最高可达80%。将融合细胞FET和具有纤维素分解能力的革兰阳性菌白色瘤球菌（Ruminnoccusalbus）融合，将纤维素分解基因引入到FET菌株中，获得1株革兰阳性重组子，它具有Ruminnoccusalbus亲株45%左右的-葡萄糖苷酶和纤维素二糖酶活性，同时还具有87%FET降解DDV酶的活性。 在生物降解反应中，微生物之间的共生和互生现象普遍存在。可能是由于微生物间相互提供了彼此生长或发生降解反应所需的某种生长因子。对于这种有共生或互生作用的细胞，通过细胞融合技术，可以将多个细胞的优良性状集中到一个细胞内。,（二）细胞融合技术构建环境治理工程菌,2、芳香族降解菌的构建 Pseudomonas alcaligenes CO可以降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯。而Pseudomonas putida R5-3可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯。上述两菌株均不能利用1,4-二氯苯甲酸酯，通过细胞融合，得到的融合细胞可以同时降解上述4种化合物。将乙二醇降解菌Pseudomomas mendocina 3RE-15和甲醇降解菌Bacillus lentus 3BM-2中的DNA转化至苯甲酸和苯的降解菌Acinetobacter calcoaceticus T3的原生质体中，获得重组子TEM-1可同时降解苯甲酸、苯、甲醇、和乙二醇，降解率分别为100%、100%、84.2%、63.5%。此菌株用于化纤废水处理对COD的去除率可达67%，高于三菌株混合培养时的降解能力。 这一结果可说明细胞事例可以集中双亲的优良性状，并可产生新的性能。,（二）细胞融合技术构建环境治理工程菌,3、利用光合细菌原生质体融合构建环境工程菌 光合细菌是一类能进行光合作用而不产氧的特殊生物类群原核生物的总称。光合细菌不仅能利用光能固氮合成有机物，也能通过多种方式和途径转化不同类型的有机物和无机物质，在水体治理过程中起着十分重要的作用。由于光合细菌种类繁多，各有不同功能，因此如何提高光合细菌的应用效果，是人们目前特别关注的问题。 陈树培等对光合细菌的原生质融合进行了较为深入的研究。先是将光合细菌球形红假单胞细菌和沼泽红假单胞细菌在PEC催化下得到光合细菌种间融合子。其融合子对降解底物中COD的能力优于任一亲本菌株，表现出高效降解、利用有机污染物的优势。随后对光合细菌球形红假单胞菌P9479和酿酒酵母Y9407的融合细胞Foa和Fzl的性能研究表明：两融合子耐酸性能与酿酒酵母相似；Foa耐热性近于酿酒酵母、Fzl的耐热性近于球形红假单胞菌；对于废水中污染物BOD5 的去除率E和容积负荷Uv在底物浓度BOD5为4600mg/L时均优于双亲；融合子Fzl的生物负荷Ub和菌体比降解率q高于酿酒酵母，絮凝效率P优于任一亲株。融合子在多方面综合了双亲菌株有事，可见将原生质体融合技术引入废水资源化处理的应用领域具有良好前景。,（二）细胞融合技术构建环境治理工程菌,4、利用细胞融合技术构建抗污染型植物 工业革命以来，人类活动特别是工业活动造成了严重的环境污染。当生物群落污染物胁迫时，不同物种的适应性反应不可能完全相同，某些物种因无抗性基因而被淘汰。有研究表明由于大气高浓度SO2的影响，美国俄亥俄州北部白松群体至少有40%的物质已丢失。熏蒸实验和野外调查表明，在颤杨和红槭中也有类似的情况。 污染胁迫的最显著效应是消除敏感物种或个体，改变生物种群的物种构成。研究表明，污染胁迫导致植物居群进化。矿山和冶炼厂污染区出现抗重金属生态型。农业杂草中发现抗除草剂进化。抗气体污染物进化也有若干报到。在研究过程实例中，除少数例外，抗污染性均表现为可遗传性状，而目前关于抗污染特性的遗传基础仍然研究得不充分，所以我们可以利用细胞融合技术的优势，将抗污染性植入其他植物体内以保证该物种对环境污染良好的适应性。,美国纽约州厄普顿Brookhaven国家实验室的微生物学家Daniel van der Lelie 和比利时林堡大学中心的环境生物学家Jaco Vangrosveld领导的研究小组发现，向植物中注射一种细菌的菌株能够使植物降低甲苯致病的能力。于是研究人员采集了一种通常存在于黄玉扁豆内部的细菌，这些无害的细菌多位于细胞的表面，而且将它们与那些具有降解甲苯能力的细菌进行原生质融合，结果本地的黄玉扁豆在于细菌之间的基因交换过程中获得了能够降解甲苯的基因。这种新加载的细菌是的黄玉扁豆能够在受污染的土壤中茁壮成长，而此前那些未经改良的普通黄玉扁豆却无发生存。,（三）固定化细胞,初期的细胞固定化技术经常用于发酵工业，但是日趋严重的水环境问题对废水生物处理工艺高效性的迫切要求，使得人们开始利用固定化细胞技术取代传统的活性污泥处理方式，进入实现污染物生物降解的新领域。相对较于传统的处理方法，固定化细胞技术具有如下优点： 1、能维持较高的微生物浓度； 2、有利于代谢长的微生物生存； 3、处理效率高，运行稳定； 4、便于固液分离，剩余污泥量少； 5、适用范围广，处理成本低。,葛文准等通过包埋法固定销化菌，分别用海藻酸钠、卡拉胶、聚乙烯醇（PVA）和丙烯酰胺（AC